本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，具体将黑二氧化钛纳米颗粒和碘氧铋纳米片及金纳米颗粒(b-tio2nps/bioinss/aunps)作为基底材料，pbs/co3o4作为信号抗体标记物，构建了检测降钙素原的光电化学免疫传感器。
背景技术：
降钙素原（pct）是降钙素的天然前体，由甲状腺c细胞和蛋白水解产生，是一种有前景的用于细菌感染诊断的疾病标志物，它比其他已知的疾病标志物对脓毒症的诊断更灵敏。降钙素原在正常人体内的含量低于0.1ng/ml，但当发生细菌感染或脓毒症时，降钙素原的含量会迅速增加，增加量取决于感染的程度。因此降钙素原的早期诊断对于细菌感染等疾病的治疗具有重要的临床意义。目前，对于降钙素原的检测方法有很多，比如酶联免疫分析法、放射免疫分析、荧光或表面等离子体共振等方法，但上述方法具有操作复杂、仪器昂贵等劣势，因此本发明发展的一种操作简便、价格低廉、灵敏度高的检测方法具有重要意义。本发明构建的光电化学传感器是一种利用光电活性物质的光电转换性质确定待分析物浓度的装置，因其检测信号是电信号，激发信号是光源，实现了激发信号与检测信号的分离，具有较低的背景信号和较高的灵敏度，且其制备简便、成本较低，因此在食品分析、环境检测、水质分析、生物分析等领域应用广泛。
光活性材料是光电化学传感器关键组成部分。作为一种性能优良的光电转换半导体材料，二氧化钛被广泛应用于光催化、燃料电池等领域，然其宽的带隙(3.2ev)使其只能吸收紫外光而限制了它的应用。因此，在本项发明中，在二氧化钛的基础上，利用硼氢化钠进行还原得到b-tio2nps，产生的氧空位，可增加对可见光的利用率。另外将bioinss与b-tio2nps复合形成带隙匹配结构促进电子的转移。通过在电极表面滴涂aunps形成敏化结构增加电极的导电性，提高光电流响应。并以pbs/co3o4复合物作为信号标记物，利用其对光和空穴牺牲剂的竞争吸收，提高光电化学传感器的灵敏度。
技术实现要素：
本发明的目的之一是分别合成b-tio2nps、bioinss及aunps，构成b-tio2nps/bioinss/aunps多层复合敏化结构，利用b-tio2nps和bioinss之间的带隙匹配结构和aunps良好的导电性促进光生电子的转移。
本发明目的之二是合成pbs/co3o4复合物，并将其与信号抗体结合，形成pbs/co3o4-ab2生物共轭物。
本发明目的之三是以b-tio2nps/bioinss/aunps多层复合敏化结构作为光活性基底材料，以pbs/co3o4复合物作为信号标记物，构建夹心型光电化学免疫传感器，并且用于降钙素原的快速、灵敏检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将大块ito导电玻璃裁成2.0cm×0.8cm，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干；
2）滴加10µl、5-8mg/mlb-tio2nps均匀分散悬浮液至ito导电玻璃导电面，室温下晾干，制得b-tio2nps电极；
3）将b-tio2nps电极分别在5-10mmbi(no)3和5-10mmki溶液中蘸10s，超纯水冲洗，重复上述循环20-30次，制得b-tio2nps/bioinss电极；
4）滴加8µlaunps溶液至b-tio2nps/bioinss电极表面，制得b-tio2nps/bioinss/aunps电极；
5）滴加5µl、8~12µg/ml的降钙素原捕获抗体溶液至修饰电极表面，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
6）滴加3µl、质量分数为1.0%的牛血清蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
7）滴加5µl、0.1pg/ml~50ng/ml的降钙素原抗原标准溶液到修饰电极表面，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
8）滴加5µl、3.0~5.0mg/mlpbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液到电极表面，4℃冰箱孵化60min，超纯水冲洗，制得修饰完全的电极，即一种检测降钙素原信号减弱型光电化学免疫传感器。
如权利要求1所述的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器的制备方法，所述b-tio2nps的制备，步骤如下：
将4.0-5.0gp25二氧化钛纳米颗粒和1.5-2.0gnabh4混合并研磨30min，氩气氛围的管式炉中300℃煅烧50-60min，冷却至室温后，所得产品分别用超纯水和乙醇离心清洗3次，真空干燥箱中35℃，12h后得到b-tio2nps。
如权利要求1所述的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器的制备方法，所述bioinss的制备，步骤如下：
将涂覆b-tio2nps的ito导电玻璃分别在5-10mmbi(no)3和5-10mmki溶液中蘸10s，用超纯水冲洗，重复上述循环20-30次，制得bioinss。
如权利要求1所述的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器的制备方法，所述aunps的制备，步骤如下：
50-55ml质量分数为0.01%haucl4溶液，120℃油浴中煮沸，2.5-5.0ml质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30min至溶液变紫红色，制得aunps溶液。
如权利要求1所述的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器的制备方法，所述pbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液的制备，步骤如下：
1）co3o4多面体的制备及其氨基化：
3.0-6.0gco(no3)2·6h2o和13-16g2-甲基咪唑分别溶于250ml甲醇中，将2-甲基咪唑溶液加入到co(no3)2溶液中，室温下老化24h，甲醇离心洗涤3次，所得固体真空干燥箱中烘干后置于管式炉中350℃煅烧120min，得到co3o4多面体，0.05-0.1gco3o4多面体分散在含0.15ml三氨丙基三乙氧基硅烷的10ml乙醇溶液中，超声分散30min，70℃下回流24h，无水乙醇离心洗涤3次，在真空干燥箱中35℃12h，制得氨基化co3o4多面体；
2）pbsqds的制备：
7~21μl巯基乙酸加入到25ml1~7mmol/lpb(no3)2溶液后，氮气下鼓泡20min并用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值为5~12，鼓泡20min后，加入2ml0.01~0.015mol/lna2s溶液，氮气氛围下搅拌4h后得到pbsqds溶液；
3）pbs/co3o4的制备：
5-10mg氨基化co3o4多面体，0.8g1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.1g的n-羟基琥珀酰亚胺溶于15mlpbsqds溶液中，将上述混合液室温下搅拌2h，超纯水洗涤3次，然后将产品分散于2ml超纯水；
4）pbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液的制备：
2ml10µg/ml降钙素原检测抗体溶液和10µl5mg/ml1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10µl1mg/mln-羟基琥珀酰亚胺4℃震荡30min，6mg的pbs/co3o4加入上述溶液4℃震荡6h，100µl质量分数为1%的牛血清蛋白溶液注入上述溶液4℃震荡12h，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器，用于降钙素原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，如权利要求1所制备的ito修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10ml、ph7.4的含0.1mol/l抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，设置电压为0v，运行时间100s，照射led灯波长为400~450nm；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔10s开灯持续照射10s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明的有益成果
1.本发明合成的b-tio2nps/bioinss/aunps，b-tio2nps可以提高ito表面的粗糙程度这利于bioinss的生长，进而提高捕获光源的能力，同时交错的纳米片结构具有大的比表面积可以增加捕获抗体的负载量，并且aunps良好的导电性和表面等离子体共振效应可以加速电极表面的电子传递速率，显著提高了光电转换效率。
2.本发明合成纳米复合材料pbs/co3o4作为检测抗体标记物，构建信号减弱型光电化学免疫传感器。pbs量子点是一种带隙较窄的半导体，可以吸收400-1300nm的可见及红外光，可以和b-tio2np/bioinss/aunps竞争吸收光源和电子供体；co3o4是一个多面体，p型半导体结构，具有较大的比表面积，可以用于负载pbs量子点，并且具有较大的位阻，阻碍电子和空穴牺牲剂的传递，与pbs量子点构成协同作用，使得光电流响应变小，构成一种信号减弱型的光电化学夹心型免疫传感器。
3.本发明利用纳米复合材料pbs/co3o4直接与标志物检测抗体结合，构建无酶免疫传感器，避免因为酶的失活或泄露引起检测误差。同时利用pbs/co3o4复合材料实现信号减弱，极大提高了光电化学传感器的检测灵敏度，具有重要的科学意义和应用价值。
4.本发明制备的信号减弱型光电化学免疫传感器，用于降钙素原的检测，响应时间短，稳定性好，可以实现对降钙素原的简单、快速、高灵敏和特异性检测。本发明制备的传感器对降钙素原的检测范围为0.1pg/ml~200ng/ml，检测限为0.02pg/ml。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种基于pbs/co3o4复合物的光电化学降钙素原传感器的制备方法，制备步骤如下：
1）将大块ito导电玻璃裁成2.0cm×0.8cm，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干；
2）滴加10µl、5mg/mlb-tio2nps均匀分散悬浮液至ito导电玻璃导电面，室温下晾干，制得b-tio2nps电极；
3）将b-tio2nps电极分别在5mmbi(no)3和5mmki溶液中蘸10s，超纯水冲洗，重复上述循环20次，制得b-tio2nps/bioinss电极；
4）滴加8µlaunps溶液至b-tio2nps/bioinss电极表面，制得b-tio2nps/bioinss/aunps电极；
5）滴加5µl、8µg/ml的降钙素原捕获抗体溶液至修饰电极表面，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
6）滴加3µl、质量分数为1.0%的牛血清蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
7）滴加5µl、0.1pg/ml~50ng/ml的降钙素原抗原标准溶液到修饰电极表面，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
8）滴加5µl、3.0mg/mlpbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液到电极表面，4℃冰箱孵化60min，超纯水冲洗，制得修饰完全的电极，即一种检测降钙素原信号减弱型光电化学免疫传感器。
实施例2一种基于pbs/co3o4复合物的光电化学降钙素原传感器的制备方法，制备步骤如下：
1）将大块ito导电玻璃裁成2.0cm×0.8cm，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干；
2）滴加10µl、7mg/mlb-tio2nps均匀分散悬浮液至ito导电玻璃导电面，室温下晾干，制得b-tio2nps电极；
3）将b-tio2nps电极分别在8mmbi(no)3和8mmki溶液中蘸10s，超纯水冲洗，重复上述循环25次，制得b-tio2nps/bioinss电极；
4）滴加8µlaunps溶液至b-tio2nps/bioinss电极表面，制得b-tio2nps/bioinss/aunps电极；
5）滴加5µl、10µg/ml的降钙素原捕获抗体溶液至修饰电极表面，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
6）滴加3µl、质量分数为1.0%的牛血清蛋白溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
7）滴加5µl、0.1pg/ml~50ng/ml的降钙素原抗原标准溶液到修饰电极表面，4℃冰箱晾干，超纯水冲洗；
8）滴加5µl、5.0mg/mlpbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液到电极表面，4℃冰箱孵化60min，超纯水冲洗，制得修饰完全的电极，即一种检测降钙素原信号减弱型光电化学免疫传感器。
实施例3b-tio2nps的制备，步骤如下：
将4.0gp25二氧化钛纳米颗粒和1.5gnabh4混合并研磨30min，氩气氛围的管式炉中300℃煅烧50min，冷却至室温后，所得产品分别用超纯水和乙醇离心清洗3次，真空干燥箱中35℃，12h后得到b-tio2nps。
实施例4b-tio2nps的制备，步骤如下：
将5.0gp25二氧化钛纳米颗粒和2.0gnabh4混合并研磨30min，氩气氛围的管式炉中300℃煅烧60min，冷却至室温后，所得产品分别用超纯水和乙醇离心清洗3次，真空干燥箱中35℃，12h后得到b-tio2nps。
实施例5bioinss的制备，步骤如下：
将涂覆b-tio2nps的ito导电玻璃分别在5mmbi(no)3和5mmki溶液中蘸10s，用超纯水冲洗，重复上述循环20次，制得bioinss。
实施例6bioinss的制备，步骤如下：
将涂覆b-tio2nps的ito导电玻璃分别在8mmbi(no)3和8mmki溶液中蘸10s，用超纯水冲洗，重复上述循环30次，制得bioinss。
实施例7aunps的制备，步骤如下：
50ml质量分数为0.01%haucl4溶液，120℃油浴中煮沸，2.5ml质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30min至溶液变紫红色，制得aunps溶液。
实施例8aunps的制备，步骤如下：
55ml质量分数为0.01%haucl4溶液，120℃油浴中煮沸，5.0ml质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液加入上述溶液，搅拌下继续煮沸30min至溶液变紫红色，制得aunps溶液。
实施例9pbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液的制备，步骤如下：
1）co3o4多面体的制备及其氨基化：
3.0gco(no3)2·6h2o和13g2-甲基咪唑分别溶于250ml甲醇中，将2-甲基咪唑溶液加入到co(no3)2溶液中，室温下老化24h，甲醇离心洗涤3次，所得固体真空干燥箱中烘干后置于管式炉中350℃煅烧120min，得到co3o4多面体，0.05gco3o4多面体分散在含0.15ml三氨丙基三乙氧基硅烷的10ml乙醇溶液中，超声分散30min，70℃下回流24h，无水乙醇离心洗涤3次，在真空干燥箱中35℃12h，制得氨基化co3o4多面体；
2）pbsqds的制备：
7μl巯基乙酸加入到25ml1mmol/lpb(no3)2溶液后，氮气下鼓泡20min并用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值为8，鼓泡20min后，加入2ml0.01mol/l的na2s溶液，氮气氛围下搅拌4h后得到pbsqds溶液；
3）pbs/co3o4的制备：
5mg氨基化co3o4多面体，0.8g1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.1g的n-羟基琥珀酰亚胺溶于15mlpbsqds溶液中，将上述混合液室温下搅拌2h，超纯水洗涤3次，然后将产品分散于2ml超纯水；
4）pbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液的制备：
2ml10µg/ml降钙素原检测抗体溶液和10µl5mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10µl1mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺4℃震荡30min，6mg的pbs/co3o4加入上述溶液4℃震荡6h，100µl质量分数为1%的牛血清蛋白溶液注入上述溶液4℃震荡12h，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
实施例10pbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液的制备，步骤如下：
1）co3o4多面体的制备及其氨基化：
6.0gco(no3)2·6h2o和16g2-甲基咪唑分别溶于250ml甲醇中，将2-甲基咪唑溶液加入到co(no3)2溶液中，室温下老化24h，甲醇离心洗涤3次，所得固体真空干燥箱中烘干后置于管式炉中350℃煅烧120min，得到co3o4多面体，0.1gco3o4多面体分散在含0.15ml三氨丙基三乙氧基硅烷的10ml乙醇溶液中，超声分散30min，70℃下回流24h，无水乙醇离心洗涤3次，在真空干燥箱中35℃12h，制得氨基化co3o4多面体；
2）pbsqds的制备：
21μl巯基乙酸加入到25ml7mmol/lpb(no3)2溶液后，氮气下鼓泡20min并用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值为11，鼓泡20min后，加入2ml0.015mol/l的na2s溶液，氮气氛围下搅拌4h后得到pbsqds溶液；
3）pbs/co3o4的制备：
8mg氨基化co3o4多面体，0.8g1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.1g的n-羟基琥珀酰亚胺溶于15mlpbsqds溶液中，将上述混合液室温下搅拌2h，超纯水洗涤3次，然后将产品分散于2ml超纯水；
4）pbs/co3o4降钙素原检测抗体复合物溶液的制备：
2ml10µg/ml降钙素原检测抗体溶液和10µl5mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和10µl1mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺4℃震荡30min，6mg的pbs/co3o4加入上述溶液4℃震荡6h，100µl质量分数为1%的牛血清蛋白溶液注入上述溶液4℃震荡12h，用ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液离心清洗3次，并分散于2mlph为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
实施例11制备的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器，用于降钙素原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，所制备的ito修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10ml、ph7.4的含0.1mol/l抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，设置电压为0v，运行时间100s，照射led灯波长为400~450nm；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔10s开灯持续照射10s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
实施例12制备的一种基于pbs/co3o4复合物信号减弱型光电化学免疫传感器，用于降钙素原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，所制备的ito修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在10ml、ph7.4的含0.1mol/l抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，设置电压为0v，运行时间100s，照射led灯波长为400~450nm；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔10s开灯持续照射10s，然后记录光电流，绘制工作曲线；
（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
实施例13应用实施例1和实施例2构建的传感器按照实施例11和12的检测方法对降钙素原标准溶液进行了检测，测得传感器的线性检测范围为0.1pg/ml~50ng/ml，检测限为0.02ng/ml。