本发明涉及的是血小板膜蛋白在诊断急性冠脉综合征的应用，属于生物化学领域。
背景技术：
：：急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,acs)是一类急性缺血性心脏病，其高发病率和死亡率已成为国际健康关注的重点[1]。急性冠脉综合征与冠状动脉易损斑块密切相关，冠脉管腔内不稳定斑块破裂可导致血小板活化，血栓形成，甚至是血栓性闭塞。由此可见，血小板在冠状动脉斑块的进展、不稳定性和破裂中起着重要的作用[2-4]。而血小板表面膜蛋白也参与血小板活化、粘附和聚集，可间接介导急性冠脉综合征的发病和临床表现[5,6]。临床上，急性冠脉综合征主要通过典型的胸痛症状，心电图变化，或者/和心脏坏死标志物的改变等联合诊断。心脏坏死标志物，最常见的心肌肌钙蛋白(cardiactroponin,ctn)，是评估和诊断急性冠脉综合征的基本工具，已成为心肌梗死诊断的金标准。虽然肌钙蛋白对心肌损伤具有高度的特异性和敏感性，但它们无法识别心肌损伤的具体机制，例如在急性肺水肿、肺栓塞、病毒性心肌炎等多种疾病状态下，也会出现肌钙蛋白升高。同时，肌钙蛋白并不能区别稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛[7,8]。因此，寻求新的、敏感性高，特异性强的生物学标志物对急性冠脉综合征的诊断具有重大意义。国内外并未停止对诊断急性冠脉综合征新型生物学标志物的研究，而且，生物学标志物的研究不只局限于血清或血浆生化指标，还涉及血小板膜蛋白的表达水平。研究表明，血小板膜表面胶原受体糖蛋白vi(gpvi)，p-选择素(p-selectin)和癌胚抗原细胞粘附分子1(ceacam1/cd66a/bgp)在血小板膜表面表达，并在血小板介导的生理性止血和病理性血栓形成中发挥着重要作用[3,9,10]。此外，急性冠脉综合征中某些血小板膜蛋白表达水平明显增加，可作为急性冠脉综合征诊断的新指标[3,6,9,11]。血小板在生理性止血和病理性血栓形成中发挥着重要作用，而血小板膜蛋白又是这些过程中的关键介质[12]。癌胚抗原细胞黏附分子5(carcinoembryonicantigenelatedcelladhesionmolecule5,ceacam5/cea)和ceacam1均为癌胚抗原细胞粘附分子(ceacams)家族成员，它们在结构以及同嗜性或异嗜性的配体结合方面有一定相似性。cea广泛表达于各种细胞表面，包括上皮细胞，内皮细胞，免疫细胞等，在细胞粘附，细胞间和细胞内信号传导以及肿瘤进展中发挥着重要作用[13,14]。此外，cea作为广谱肿瘤标志物，可反映各类肿瘤的存在，同时，其在结直肠癌、乳腺癌和肺癌等患者血清中的高表达与肿瘤恶化和亚临床转移密切相关[14,15]。而血小板也是肿瘤细胞外渗和肿瘤转移的重要参与者[16,17]。因此发展对于cea作为预测或者诊断急性冠脉综合征新的生物学标志物，具有十分重要的价值和临床实践意义。参考文献[1]benjaminej,blahamj,chiuvese,cushmanm,dassr,deor,etal.heartdiseaseandstrokestatistics-2017update:areportfromtheamericanheartassociation[j].circulation.2017,135(10):e146-e603.[2]gawazm,neumannfj,schomiga.evaluationofplateletmembraneglycoproteinsincoronaryarterydisease:consequencesfordiagnosisandtherapy[j].circulation.1999,99(1):e1-e11.[3]stellosk,bigalkeb,stakosd,henkelmannn,gawazm.platelet-boundp-selectinexpressioninpatientswithcoronaryarterydisease:impactonclinicalpresentationandmyocardialnecrosis,andeffectofdiabetesmellitusandanti-plateletmedication[j].journalofthrombosisandhaemostasis:jth.2010,8(1):205-7.[4]navas-carrillod,marinf,valdesm,orenes-pineroe.decipheringacutecoronarysyndromebiomarkers:high-resolutionproteomicsinplatelets,thrombiandmicroparticles[j].criticalreviewsinclinicallaboratorysciences.2017,54(1):49-58.[5]andrewsrk,gardineree,sheny,berndtmc.plateletinteractionsinthrombosis[j].iubmblife.2004,56(1):13-8.[6]gremmelt,frelingeral,3rd,michelsonad.plateletphysiology[j].seminarsinthrombosisandhemostasis.2016,42(3):191-204.[7]katush,zieglera,ekincio,giannitsise,stoughwg,achenbachs,etal.earlydiagnosisofacutecoronarysyndrome[j].europeanheartjournal.2017,38(41):3049-55.[8]delvalmartind,sanmartínfernándezm,zamoranogómezjl.biomarkersinacutecoronarysyndrome[j].ijcmetabolic&endocrine.2015,8:20-3.[9]wongc,liuy,yipj,chandr,weejl,oatesl,etal.ceacam1negativelyregulatesplatelet-collageninteractionsandthrombusgrowthinvitroandinvivo[j].blood.2009,113(8):1818-28.[10]bigalkeb,geislert,stellosk,langerh,daubk,kremmere,etal.plateletcollagenreceptorglycoproteinviasapossiblenovelindicatorfortheacutecoronarysyndrome[j].americanheartjournal.2008,156(1):193-200.[11]bigalkeb,stellosk,weighj,geislert,seizerp,kremmere,etal.regulationofplateletglycoproteinvi(gpvi)surfaceexpressionandofsolublegpviinpatientswithatrialfibrillation(af)andacutecoronarysyndrome(acs)[j].basicresearchincardiology.2009,104(3):352-7.[12]ozakiy,suzuki-inouek,inoueo.plateletreceptorsactivatedviamulitmerization:glycoproteinvi,gpib-ix-v,andclec-2[j].journalofthrombosisandhaemostasis:jth.2013,11suppl1:330-9.[13]horstak,wagenerc.cea-relatedcams[j].handbookofexperimentalpharmacology.2004,(165):283-341.[14]beaucheminn,arabzadeha.carcinoembryonicantigen-relatedcelladhesionmolecules(ceacams)incancerprogressionandmetastasis[j].cancermetastasisreviews.2013,32(3-4):643-71.[15]bramswigkh,poettlerm,unseldm,wrbaf,uhrinp,zimmermannw,etal.solublecarcinoembryonicantigenactivatesendothelialcellsandtumorangiogenesis[j].cancerresearch.2013,73(22):6584-96.[16]labellem,begums,hynesro.directsignalingbetweenplateletsandcancercellsinducesanepithelial-mesenchymal-liketransitionandpromotesmetastasis[j].cancercell.2011,20(5):576-90.[17]bestmg,soln,kooii,tannousj,westermanba,rustenburgf,etal.rna-seqoftumor-educatedplateletsenablesblood-basedpan-cancer,multiclass,andmolecularpathwaycancerdiagnostics[j].cancercell.2015,28(5):666-76.[18]jneidh,addisond,bhattdl,fonarowgc,gokaks,gradykl,etal.2017aha/accclinicalperformanceandqualitymeasuresforadultswithst-elevationandnon-st-elevationmyocardialinfarction:areportoftheamericancollegeofcardiology/americanheartassociationtaskforceonperformancemeasures[j].circulationcardiovascularqualityandoutcomes.2017,10(10).[19]kimurak,kimurat,ishiharam,nakagaway,nakaok,miyauchik,etal.jcs2018guidelineondiagnosisandtreatmentofacutecoronarysyndrome[j].circulationjournal:officialjournalofthejapanesecirculationsociety.2019,83(5):1085-196.技术实现要素：本发明的目的是提供血小板膜蛋白在诊断急性冠脉综合征的应用，所述的应用要解决心肌肌钙蛋白作为评估和诊断急性冠脉综合征的标记物，仍有一定假阳性的问题。本发明提供血小板膜蛋白在诊断急性冠脉综合征的应用。本发明提供血小板膜蛋白作为生化指标在诊断急性冠脉综合征的应用。本发明提供作为可靠指标在预测早期心肌缺血、急性冠脉综合征患者风险分层和不良预后事件的应用。进一步，本发明提供血小板膜蛋白作为生物学标志物在诊断急性冠脉综合征的应用。本发明所述的血小板膜蛋白来源于血小板膜表面，为血小板膜表面cea。所述的血小板膜蛋白，通过双色流式细胞术来检测其在洗涤血小板上的表达。所述的血小板膜蛋白，通过双色全血流式细胞术检测其在急性冠脉综合征患者及冠状动脉正常患者血小板上的表达水平。在上述双色流式细胞术实验中，测定静息状态下及不同浓度凝血酶(0.5u/ml、1u/ml、2u/ml)活化后，血小板膜表面cea的表达情况。实验证明，血小板膜表面cea在人血小板膜表面表达，且不同浓度凝血酶刺激后血小板膜表面cea表达水平升高。在上述双色全血流式细胞术实验中，测定急性冠脉综合征患者及冠状动脉正常患者血小板膜表面cea的表达情况。实验证明，急性冠脉综合征患者血小板膜表面cea水平升高，可是一种新的、强有力的、可靠的可用于诊断急性冠脉综合征的生物学标志物。本发明所述的血小板膜蛋白灵敏度高，特异性强，对急性冠脉综合征的诊断具有重要意义。附图说明图1为双色流式细胞术检测cea在静息或凝血酶活化后人血小板上的表达：图1a为cea在静息(resting)人血小板上的表达,结果用平均荧光强度(meanfluorescenceintensity，mfi)±标准误差(standarderror，se)表示,横坐标为洗涤血小板的分组，纵坐标为血小板膜表面cea的mfi(n＝3；**p<0.01)；图1b为具代表性的流式细胞术直方图,横坐标为fitc的荧光强度，纵坐标为血小板数量(n＝3；**p<0.01)；图1c和图1d为不同浓度凝血酶刺激后血小板膜表面cea的表达,横坐标为洗涤血小板的处理分组，纵坐标为血小板膜表面cea的mfi(n＝3；**p<0.01)。图2a为急性冠脉综合征患者和冠状动脉正常患者中血小板膜表面cea的表达情况；图2b为ami，ua和冠状动脉正常患者中血小板膜表面cea的表达情况；图2c为stemi，nstemi，ua和冠状动脉正常患者中血小板膜表面cea的表达情况，结果以mfi±se表示,横坐标为患者疾病的分组，纵坐标为血小板膜表面cea的mfi(**p<0.01，n＝82)。图3a为血小板膜表面cea水平与心肌收缩标志物(bnp)的相关性，横坐标为血小板膜表面cea的mfi，纵坐标为bnp的浓度(n＝82)；图3b-d为分别为血小板膜表面cea水平与心肌损伤标志物(ctni，ckmb和myo)的相关性，横坐标为血小板膜表面cea的mfi，纵坐标分别为ctni，ckmb和myo的浓度(n＝82)。图4a为血小板膜表面cea对急性冠状动脉综合征的诊断价值，横坐标为假阳性率(1-特异性％)，纵坐标真阳性率(敏感性％)；图4b为血小板膜表面cea，ctni水平以及二者联合后对急性冠状动脉综合征的诊断效能的比较。横坐标为假阳性率(1-特异性％)，纵坐标真阳性率(敏感性％)。具体实施方式以下结合具体实施例及附图进一步阐述本发明。实施例仅用于说明此发明而不用于限制本发明的范围。各实施例中受试者入选标准和排除标准：本发明研究连续纳入了2018年12月至2019年3月在昆明医科大学附属第一医院以胸痛就诊的患者82例。根据美国心脏协会/美国心脏病学会(aha/acc)指南，所有患者均经冠状动脉造影诊断[18]。在82例患者中，62例被诊断为急性冠脉综合征，其中包括st段抬高型心肌梗死(st-segmentelevationmyocardialinfarction，stemi)患者21例，非st段抬高型心肌梗死(non-stelevationmyocardialinfarction，nstemi)患者21例，不稳定型心绞痛(unstableanginapectoris，ua)患者20例；以及20例冠状动脉正常的健康受试者作为对照组。年龄小于18岁的患者，心肌坏死标志物呈假阳性，无法给予知情同意的患者，以及被诊断为各类肿瘤患者被排除在外。所有过程均根据赫尔辛基宣言进行，且经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会通过，所有患者入选前均已签署知情同意书。急性冠脉综合征包括stemi，nstemi和ua；其中，stemi和nstemi又统称为急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)。诊断标准如前所述[19]。实施例中所用的实验方案：1.样本的收集取肘静脉血收集于3.2％的枸橼酸钠(1:9)抗凝管内，然后立即制备洗涤血小板，或者立即采用双色全血流式细胞术检测并分析。入院时同时完善血常规，血生化，凝血功能，心肌坏死标志物(ctni，ckmb和myo)，心肌收缩标志物(bnp)，心电图，心脏彩超等相关检验和检查。2.主要试剂及实验仪器多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(peridinin-chlorophyll-proteincomplex，percp)标记的抗人cd61抗体购自美国biolegend公司；异硫氰酸荧光素(fluorescein，fitc)标记的抗人cea抗体购自美国genetex公司；同型抗体fitc标记的小鼠免疫球蛋白g1购自美国bd公司。流式细胞仪型号为bdfacscantoii。3.血小板的分离及洗涤血小板的制备取肘静脉血于3.2％的枸橼酸钠(1:9)抗凝管内，22℃以150g离心10分钟，吸取上清为富血小板血浆(plateletrichplasma，prp)，而后，22℃以1,000g离心prp15分钟，弃去上清，得到浓缩血小板团块，血小板团块用适量tyrodebuffer(137mmol/lnacl，2.8mmol/lkcl，10mmol/lhepes，1mmol/lmgcl2,12mmol/lnahco3,0.42mmol/lnah2po4,1mg/mlglucose和2.5mg/mlbsa，ph7.4)轻柔吹打，洗涤两次，最后，轻轻重悬浓缩血小板团块并调整血小板数目至2-3×108个/ml。洗涤血小板用于双色流式细胞术实验，测定静息状态下及不同浓度凝血酶活化后，血小板膜表面cea的表达情况。4.双色流式细胞术检测静息状态下及活化后，血小板膜表面cea的表达情况将洗涤血小板分至100μl/ep管，分为空白对照组，同型对照组，静息状态组，不同浓度凝血酶活化后(0.5u/ml、1u/ml、2u/ml)a、b、c组，加入等体积tyrodebuffer或者不同浓度凝血酶，37℃孵育10分钟后，每管加入percp标记的抗人cd61抗体(1:10)用以识别出血小板，静息状态组及不同浓度凝血酶活化a、b、c组加入fitc标记的抗人cea抗体(5μg/ml)，同型对照组加入fitc标记的同型抗体(5μg/ml)，空白组则加入等体积的tyrodebuffer，37℃孵育30分钟后，每管加入250μlpbs缓冲液终止反应，而后立即进行流式细胞术分析，并记录，每组重复3次，取平均值。5.双色全血流式细胞术检测急性冠脉综合征患者及冠状动脉正常患者血小板膜表面cea表达情况取肘静脉血于3.2％的枸橼酸钠(1:9)抗凝管内，各取10μl至含90μltyrodebuffer的ep管中并混匀，每例患者分成三组：空白对照组，同型对照组，以及实验组。每组样本中加入percp标记的抗人cd61抗体(1:10)用以识别出血小板，而后分别加入等体积的tyrodebuffer，fitc标记的同型抗体(5μg/ml)，以及fitc标记的抗人cea抗体(5μg/ml)，37℃孵育30分钟后，加500μlpbs缓冲液洗涤2次，而后以300μlpbs缓冲液重悬，后立即进行流式细胞术分析，并记录，每组重复3次，取平均值。6.统计分析使用graphpadprism7.0和medcalc15.10分析和处理所有数据。应用双侧检验，p<0.05为统计显著性标准。应用shapiro-wilk法检验各计量资料的正态性。正态分布资料使用非配对t检验或单因素方差onewayanova分析比较组间差异性，非正态分布资料则采用mann-whitney检验或非参数检验比较组间差异性。使用spearman分析血小板膜表面cea水平与心肌坏死标志物和心肌收缩标志物之间的相关性。建立受试者工作特征曲线(roc)，计算roc曲线下面积(auc)以评估其诊断价值，并比较不同roc曲线的诊断效能。roc曲线评价方法：auc>0.5时，auc值越接近1，其诊断效能越高。当auc在0.5～0.7时诊断效能较低，当auc在0.7～0.9时有一定的诊断效能，当auc>0.9时有较高的诊断效能。实施例1cea在人血小板上的表达情况本实施例中采用人洗涤血小板，应用双色流式细胞术检测静息状态下及不同浓度凝血酶活化后(0.5u/ml、1u/ml、2u/ml)，血小板膜表面cea的表达情况。从图1a和图1b可知，cea表达于血小板膜表面。同时，经不同浓度凝血酶活化后(0.5u/ml、1u/ml、2u/ml)，血小板表面cea水平明显升高，且血小板膜表面cea水平经中等浓度凝血酶活化后(1u/ml)显著升高，而在较高浓度凝血酶活化后(2u/ml)呈现下降趋势(图1c和图1d)。本实施例提示cea是血小板膜表面表达的一种蛋白，且血小板膜表面cea的表达水平可与血小板活化相关。实施例2急性冠脉综合征患者及冠状动脉正常患者血小板膜表面cea表达情况本实施例中应用双色全血流式细胞术检测急性冠脉综合征患者及冠状动脉正常患者血小板膜表面cea表达情况，结果以mfi±se表示。acs组血小板膜表面cea表达水平显著高于正常冠状动脉组[1459±149.8vs429.8±110；p<0.01](图2a)；ami组、ua组血小板膜表面cea表达水平显著高于正常冠状动脉组[1504±180.7vs1364±273.3vs429.8±110；p<0.01(图2b)；stemi组、nstemi组、ua组血小板膜表面cea表达水平显著高于正常冠状动脉组[1445±309.6vs1562±194.2vs1364±273.3vs429.8±110,p<0.01](图2c)。本实施例提示急性冠脉综合征患者血小板膜表面cea表达水平明显增加，血小板膜表面cea水平可是诊断急性冠脉综合征新的、可靠的生化指标。实施例3血小板膜表面cea与心肌收缩标志物(bnp)和心肌损伤标志物(ctni，ckmb和myo)的相关性由图3a可知，血小板膜表面cea与bnp水平呈显著正相关关系(r＝0.27,p＝0.021)，但是与ctni，ckmb和myo未见明显相关性(ctni:r＝0.17,p＝0.14；ckmb:r＝0.11,p＝0.34；myo:r＝0.13,p＝0.26)，见图3b、图3c、图3d。虽然血小板膜表面cea与acs发病时心肌坏死生物标志物未见明显相关性，但这可能意味着血小板膜表面cea水平与初始心肌损伤生物标志物变化不同步，其可能为反映急性冠脉综合征中血小板活化的另一早期生物学标志物。同时，高水平的血小板膜表面cea有助于预测acs心肌缺血或梗死后心室重构。由此可以推测，血小板膜表面cea水平的升高可是预测早期心肌缺血，以及acs患者风险分层和不良预后事件的一个可靠指标。实施例4血小板膜表面cea对急性冠状动脉综合征的诊断价值采用受试者工作曲线(roc)及曲线下面积(auc)进行验证，通过急性冠脉综合征患者和冠状动脉正常患者血小板膜表面cea的表达水平判断其用于诊断急性冠脉综合征的能力，评估其检验效能。由图4a可知，本发明所述的血小板膜蛋白用于诊断急性冠脉综合征时auc为0.86，敏感性为89％，特异性为75％，具有临床诊断意义。同时，与现有生物学指标ctni相比，其诊断效能相似(p>0.05)；与ctni联合后，其auc为0.91,敏感性为93％，特异性为75％，较单用本发明所述的血小板膜蛋白或现有生物学指标ctni，敏感性更高，诊断效能更佳(p<0.01)，见图4b。因此，本发明所述的血小板膜蛋白可作为用于诊断急性冠脉综合征的新的生物学标志物。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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