一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法与流程

【技术领域】

本发明涉及多肽分离检测的技术领域，特别是一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法的技术领域。

背景技术：

多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由三个或三个以上氨基酸分子脱水缩合而成的化合物都可以成为叫多肽。现有的一些多肽含有多个手性中心，如n(2)-l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，其具有两个手性中心和四种手性异构体，且四种手性异构体分别为d-丙氨酰-d-谷氨酰胺、l-丙氨酰-d-谷氨酰胺、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺。基于多肽分子结构中没有共轭基团，其在紫外检测器下未有吸收峰，采用常规的氨基柱和手性柱的高效液相色谱法的测定方法难以将多肽手性异构体有效分离。此外，药典检测对成品原料药构型具有要求，因此针对具有手性中心的多肽进行精确检测至关重要。开发一种适用于含两个及以上手性中心以上的多肽手性异构体的分离检测方法，对于定量、定性分析多肽原料药具有较大意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，能够快速高效分离检测出含两个及以上手性中心的多肽手性异构体，操作方法简单，分离度高，灵敏度强。

为实现上述目的，本发明提出了一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，包括以下几个步骤：

步骤一，多肽衍生化处理：将含多个手性中心的多肽溶于稀释剂中，依次加入缓冲溶液和衍生化试剂，放置暗处60℃水浴反应60min，获得多肽手性异构体衍生化物；

步骤二，分离检测：采用高效液相色谱法对多肽手性异构体衍生化物进行分离和检测；

其中，所述高效液相色谱法的色谱柱为离子交换型手性柱，流动相由流动相a与流动相b按体积比为(10～25)：(70～95)混合而成，所述的流动相a为甲醇缓冲盐溶液，所述的流动相b为乙腈缓冲盐溶液，所述的高效液相色谱法在高效液相色谱仪下进行检测分析。

作为优选，所述稀释剂为5％甲醇，所述步骤一中的缓冲溶液为硼酸缓冲溶液。

作为优选，所述硼酸缓冲溶液的ph为9.0，且由0.05mol/l硼砂溶液与0.2mol/l硼酸溶液按体积比为4:1混合而成。

作为优选，所述衍生化试剂为2，4-二硝基氟苯。

作为优选，所述甲醇缓冲盐溶液由甲醇、水、甲酸、二乙胺按体积比为980：20：2：2.6混合而成，所述的乙腈缓冲盐溶液由乙腈、水、甲酸、二乙胺按体积比为980：20：2：2.6混合而成。

作为优选，所述流动相a与流动相b的体积比为20:80。

作为优选，所述流动相的ph为5～6，流动相的流速为0.9～1.1ml/min。

作为优选，所述离子交换型手性柱的柱温为30℃，离子交换型手性柱为chiralpakzwix(+)，离子交换型手性柱的规格为3μm4.0x150mm。

作为优选，所述高效液相色谱仪分析时液相色谱检测波长为355nm。

作为优选，所述高效液相色谱法进行色谱检测时进样量为20μl，所述的洗脱溶液为ph7.0的磷酸缓冲溶液。

本发明的有益效果：通过该方法可快速高效分离检测出含两个及以上手性中心的多肽手性异构体，操作方法简单，分离度高，灵敏度强。

本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

【附图说明】

图1是本发明一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法的空白组衍生化后液相色谱图；

图2是本发明一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法的实验组衍生化后液相色谱图。

【具体实施方式】

本发明一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，具体操作方法如下：

移取5.0ml的5％甲醇空白溶液放至50ml棕色容量瓶内作为空白组，加入ph9.0的硼酸缓冲溶液5.0ml，混匀，再加入5.0ml的2,4-二硝基氟苯，用封口膜将50ml棕色容量瓶密封住，并将其放置暗处的60℃水浴环境下反应60min，反应结束后取出冷却至室温，向50ml棕色容量瓶内添加ph7.0磷酸缓冲溶液稀释至刻度，获得5％甲醇空白溶液衍生化物溶液；

取20μl的5％甲醇空白溶液衍生化物溶液注入高效液相色谱仪，在相应的仪器条件环境下采用高效液相色谱法进行检测分析，记录液相色谱图，该空白组的液相色谱图如图1所示。

本发明一种用高效液相色谱法分离测定含多个手性中心的多肽手性异构体的方法，具体操作方法如下：

分别称取2.0g的d-丙氨酰-d-谷氨酰胺、l-丙氨酰-d-谷氨酰胺、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺分别放至四个20ml容量瓶中，向四个20ml容量瓶中分别加入5％甲醇水进行溶解，定容，定容后的溶液浓度均为100μg/ml，之后分别取上述四个容量瓶中溶液5.0ml至新的20ml容量瓶内，加入5％甲醇完成定容，获得浓度为25μg/ml的实验品溶液作为实验组；

移取5.0ml的实验品溶液放至50ml棕色容量瓶内，加入ph9.0的硼酸缓冲溶液5.0ml，混匀，再加入5.0ml的2,4-二硝基氟苯，用封口膜将50ml棕色容量瓶密封住，并将其放置暗处的60℃水浴环境下反应60min，反应结束后取出冷却至室温，向50ml棕色容量瓶内添加ph7.0磷酸缓冲溶液稀释至刻度，获得多肽手性异构体衍生化物溶液，衍生化过程中反应式如下：

式中，i代表多肽(手性中心用*表示)，ii代表衍生化试剂2，4-二硝基氟苯，iii代表多肽手性异构体衍生化物；

取20μl多肽手性异构体衍生化物溶液注入高效液相色谱仪，在相应的仪器条件环境下采用高效液相色谱法进行检测分析，记录液相色谱图，该实验组的液相色谱图如图2所示，图2中rt代表保留时间，area代表峰面积，width代表峰宽，height代表峰高，area％代表面积百分比，peakresolutionusp代表峰分离度usp；

由图2可知四个多肽手性异构体的出峰时间(rt)如下：d-丙氨酰-d-谷氨酰胺：4.295min，l-丙氨酰-d-谷氨酰胺：4.821min，l-丙氨酰-l-谷氨酰胺：8.285min，d-丙氨酰-l-谷氨酰胺：13.109min，峰分离度均大于1.5，且峰形好、柱效高，说明本方法可有效分离多肽手性异构体，可用于多肽手性异构体的分离测定。

上述的实施例1和2中选用的仪器条件环境均保持相同，具体仪器条件环境如下：

仪器：agilent1260高效液相色谱仪；

离子交换型手性柱：chiralpakzwix(+)离子交换型手性柱，离子交换型手性柱的规格为4.0x150mm,3μm，离子交换型手性柱的柱温为30℃；

流动相：流动相a和流动相b按20：80混合而成，流动相a由由甲醇、水、甲酸、二乙胺按体积比为980：20：2：2.6混合而成，流动相b由乙腈、水、甲酸、二乙胺按体积比为980：20：2：2.6混合而成，流动相的ph为5～6，流动相的流速：1ml/min；

液相色谱检测波长：355nm；

高效液相色谱仪进样量：20μl；

高效液相色谱仪进样方式：自动进样。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。