一种纸基耦合增强拉曼传感器制备及其在大田软海绵酸检测中的应用的制作方法

本发明涉及一类基于适配体特异性虏获性能的纸基耦合增强拉曼传感器，特别涉及一种互补dna链的纸基表面增强拉曼传感器及其制备方法和在海洋水体及海产贝类中大田软海绵酸检测中的应用。

背景技术：

大田软海绵酸是一种亲脂、耐热的聚醚类腹泻藻毒素。日本和英国分别于1976年和1997年均发生过因大田软海绵酸污染引起的食物中毒事件。目前虽尚未见人类因大田软海绵酸中毒致死的报道，但已显示出其对肿瘤的促进作用，以及致突变和免疫毒素的作用。而含大田软海绵酸藻类几乎遍布全球主要海域。因此，开发一种可以实现海洋水体及海洋贝类中大田软海绵酸的现场快速检测方法对人类生命健康安全、贝类养殖业发展、海洋污染及重大石油泄漏的快速预警响应及海洋生态环境的动态监测等均具有重大意义。近年来检测贝类样品中大田软海绵酸残留的新方法包括生物测定法、液相色谱质谱法（lc-ms）、蛋白质磷酸酶抑制试验、生物传感和酶联免疫吸附法等。目前，高效液相色谱与荧光检测相结合，已被广泛应用于海产品毒素的检测，lc-ms和液相色谱-串联质谱也获得越来越多的应用。但由于其需要昂贵的设备和专业技术人员，无法满足海水污染事件及食品中毒重大事件的现场、即时、快速响应需求。

表面增强拉曼散射（sers）是利用贵金属表面等离子体共振（spr）效应增强附近分子拉曼散射光谱的一种技术。sers具有良好的灵敏度、无创检测能力和独特的指纹效应，是一种快速、准确检测多组分的强大技术。对于超灵敏的sers分析，贵金属纳米结构的电磁和化学增强机理是应用最广泛的理论，在相邻纳米粒子之间的近场区域重叠称为“热点”的区域，局域场增强效果最强。sers分析技术在食品安全、环境保护、疾病检测和光电器件等领域发挥着重要作用。目前，许多具有较大拉曼增强能力和良好再现性的sers固相基底是在硅片、玻璃等基底上通过物理气相沉积，原子层沉积，聚焦离子束光刻和其他策略修饰的良好有序的周期性银或金纳米颗粒阵列所构成。然而，上述基底由于成本高、制备过程复杂且耗时、灵活性差等原因，不适于大规模加工制备及现场分析应用。

技术实现要素：

具有轻质，易组装和强信号增强能力的低成本拉曼基底最近受到越来越多的关注。作为一种柔性多功能材料，纸因其具有多孔，大比表面积，丰富的羟基和毛细管驱动力的特性，成为一种有前途的拉曼基底候选物。本发明提供了一种基于适配体特异性虏获性能的纸基耦合增强拉曼传感器及其制备方法，并提供其在大田软海绵酸检测中的应用。该传感器是一种基于适配体特异性虏获的耦合增强纸基sers传感器，用于海洋水体和海产贝类中大田软海绵酸残留的高特异性和高效分析。依据纸纤维的立体网络结构及纸基可操控性、上下贯通等特性，利用贵金属纳米粒子的自催化生长原理，在纸纤维表面催化还原诱导组装致密、有序、排布均匀的纳米金颗粒，构筑基于表面等离子体共振的纳米金纸sers基底；原位合成三维空间树突状3d银材料，构建高热点密度电磁场增强的sers耦合双层，引入互补dna链建立特异性虏获-表面耦合增强拉曼分析界面，实现拉曼光谱快速的精确分析。耦合sers增强纸传感器可快速地对海洋水体和海产贝类中大田软海绵酸进识别和虏获，而达到现场检测的目的，制备方法简单，成本低廉，可大规模制备，可根据需求剪裁和折叠组装，方便携带至现场，且具有较高的选择性和精密度，为海水治理提供理论与技术支持。

本发明采取的技术方案为：

一种基于互补dna链的纸基表面增强拉曼传感器的制备方法，包括如下步骤：

（1）利用图形软件adobeillustratorcs6绘制各个功能区域，然后，利用固体蜡打印在色谱纸上同时制造50个初步纸芯片模型，如图1所示。对蜡打印图形进行烘烤，使蜡浸透纸背，在色谱纸两面形成疏水区域；

（2）在步骤（1）得到的纸芯片模型的功能区域内，利用金种子溶液对纸基表面进行纳米金颗粒修饰，经过孵育，纸纤维上原位催化形成结构有序、排列致密、贯通纤维上下的纳米金颗粒，获得纳米金-纸基固相基底，即“热点”一级增强的sers纸基底；

（3）将步骤（2）得到的纸芯片模型进行树突状银材料修饰，在芯片模型修饰了纳米金颗粒的区域依次滴加硝酸银溶液和羟胺溶液，原位合成树突状银材料，如图2所示，构筑高热点密度的双重耦合增强sers纸基底；

步骤（3）所述的硝酸银的浓度为40mmol/l，羟胺的浓度为4.0mmol/l；

步骤（3）所述的硝酸银溶液的用量为5微升，羟胺溶液的用量为5微升；

（4）大田软海绵酸的特异性dna模拟酶链，定义为链1，其碱基序列如核苷酸序列表所示，将一定浓度的链1固定在纸芯片的树突状银/纳米金修饰的功能区域，随后用巯基乙醇封锁活性位点，滴加磷酸盐缓冲溶液清洗；

步骤（4）中所述链1，其特征在于：其特定的碱基序列以及其5’端修饰上巯基；

（5）将一定浓度的染料修饰的互补dna适配体链，定义为链2，其碱基序列如核苷酸序列表所示，滴加于链1修饰的功能区域，室温下孵育3h，用磷酸盐缓冲溶液清洗；

步骤（5）中所述dna链2，其特征在于：其特定的碱基序列以及其3’端修饰上cy3染料；

（6）将一定浓度的大田软海绵酸加入到步骤（5）所得功能区域中，室温下反应2h，用磷酸盐缓冲溶液洗掉非特异性吸附的大田软海绵酸及解离的链2；

（7）利用拉曼光谱仪在633nm激光激发下，绘制拉曼强度对大田软海绵酸浓度的标准曲线，实现海洋水体和海产贝类实际样品中大田软海绵酸浓度检测。

本发明的突出特色是：1）在本发明中，将纳米金颗粒在纸基上原位还原生长赋予基底拉曼增强性能。在其上继续修饰三维空间树突状3d银材料，构建高热点密度电磁场增强的sers耦合双层；2）在修饰了树突状3d银材料的纸基上引入大田软海绵酸的特异性dna模拟酶链，形成特异性识别组件，可以提高传感器的对目标分析物的选择性；3）以染料修饰的互补dna链与链1进行杂交，进而加入大田软海绵酸后，形成分子竞争，实现大田软海绵酸含量的精准检测。

附图说明

图1.本发明中纸芯片50个功能区域绘制示意图。

图2三维空间树突状3d银材料扫描电子显微镜图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

一种基于互补dna链的纸基表面增强拉曼传感器在大田软海绵酸检测的应用：

（1）利用图形软件adobeillustratorcs6绘制各个功能区域，然后，利用固体蜡打印在色谱纸上同时制造50个初步纸芯片模型。对蜡打印图形进行烘烤，使蜡浸透纸背，在色谱纸两面形成疏水区域；

（2）在步骤（1）得到的纸芯片模型的功能区域内，利用金种子溶液对纸基表面进行纳米金颗粒修饰，经过孵育，纸纤维上原位催化形成结构有序、排列致密、贯通纤维上下的纳米金颗粒，获得纳米金-纸基固相基底，即“热点”一级增强的sers纸基底；

（3）将步骤（2）得到的纸芯片模型进行树突状银材料修饰，在芯片模型修饰了纳米金颗粒的区域依次滴加5微升硝酸银溶液（40mmol/l）和5微升羟胺溶液（4.0mmol/l），原位合成树突状银材料，构筑高热点密度的双重耦合增强的sers纸基底；

（4）将一定浓度的大田软海绵酸的特异性dna模拟酶链，定义为链1，固定在纸芯片的树突状银修饰的功能区域，随后用巯基乙醇封锁活性位点，滴加磷酸盐缓冲溶液清洗；

（5）将一定浓度的染料修饰的互补dna适配体链，定义为链2，滴加于链1修饰的功能区域，室温下孵育3h，用磷酸盐缓冲溶液清洗；

（6）将一定浓度的大田软海绵酸加入到步骤（5）所得功能区域中，室温下反应2h，用磷酸盐缓冲溶液洗掉非特异性吸附的大田软海绵酸及解离的链2；

（7）利用拉曼光谱仪在633nm激光激发下，绘制拉曼强度对大田软海绵酸浓度的标准曲线，实现海洋水体和海产贝类实际样品中大田软海绵酸浓度检测。

序列表

<110>济南大学

<120>一种纸基耦合增强拉曼传感器制备及其在大田软海绵酸检测中的应用

<141>2019-11-14

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<213>人工序列(artificialsequence)

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