一种比阿培南和/或有关物质的检测方法与流程

本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种比阿培南和/或有关物质的检测方法。

背景技术：

比阿培南(biapenem)是一种碳青霉烯类合成抗生素，由美国惠氏(wyeth)研制，2001年11月授权日本明治制果株式会社(meijiseika)生产，注射用比阿培南于2002年6月首次在日本上市，2008年在我国上市。临床上主要用于治疗由敏感细菌引起的败血症、肺炎、肾盂肾炎等，主要不良反应为皮疹/皮肤瘙痒、恶心、呕吐以及腹泻等。

比阿培南原料多以比阿培南母核(map)与单硫侧链制得比阿培南缩合物，再去保护基而得。注射用比阿培南为原料直接无菌分装得到，其杂质可能包括母核、侧链、缩合物等工艺杂质及制剂或储存过程中降解产生的开环物及聚合物等等。比阿培南及注射用比阿培南在各国药典中均未收载，现法定检验标准均为国家药品监督管理局标准。目前，文献及法定检验标准对于比阿培南及其制剂的检测方法主要集中在反相高效液相色谱体系，采用十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相体系或采用较低比例的有机相，既需要采用亲水的色谱填料，同时难以洗脱比阿培南母核等强保留杂质；或采用离子对试剂，增加了后续杂质在线鉴定的难度；且较少方法在一个色谱系统中同时控制聚合物杂质。

比阿培南为两性离子化合物，且结构中含有较多极性基团，在反相色谱体系中保留较弱，需要采用低初始比例的有机相或采用离子对试剂增加保留，结合试验操作，现有比阿培南原料及其制剂分析方法具有如下缺点：1)流动相初始比例为2％～3％，需要采用亲水的色谱填料，同时难以洗脱比阿培南母核等强保留杂质；2)流动相中采用离子对试剂时，基线噪音较大，影响检测灵敏度；同时影响后续杂质的结构鉴定等工作；3)在一个色谱系统中，难以同时检测二聚体杂质。

因此，建立一种灵敏、专属、高效、具有较强洗脱能力的分析方法，用于考察、评价及筛选比阿培南原料质量进而提高其后续制剂质量，是本领域技术人员急需解决的问题。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术问题，提出一种比阿培南和/或有关物质的检测方法。采用正相液相色谱系统可以实现比阿培南和/或有关物质的检测，使比阿培南与杂质、杂质与杂质实现良好的基线分离的同时，能够分离、检测到尽可能多的杂质，其测定结果准确，并能同时测定比阿培南有关物质和聚合物杂质的含量；为评价比阿培南生产工艺或产品质量及制剂储存等方面提供技术依据。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明是提供了一种比阿培南和/或有关物质的检测方法，所述检测方法为正相色谱法，采用由有机溶剂和缓冲盐水溶液组成的流动相进行等度洗脱；

其中，所述有关物质为比阿培南母核、侧链、比阿培南缩合物、开环物、二聚体a、二聚体b、比阿培南氨甲酰开环物中的至少一种；

所述有机溶剂为乙腈或甲醇-乙腈的混合溶液；

所述缓冲盐为磷酸、醋酸或甲酸的钠盐、钾盐、铵盐中的至少一种。

进一步地，所述缓冲盐为磷酸二氢铵。

进一步地，所述流动相中所述有机溶剂的体积比为50-90％，所述缓冲盐水溶液中缓冲盐的浓度为2-20mmol·l^-1。

进一步优选地，所述流动相中所述有机溶剂的体积比为80-90％，所述缓冲盐水溶液中缓冲盐的浓度为5-10mmol·l^-1。

更进一步优选地，所述流动相中所述有机溶剂的体积比为86％。

进一步地，采用磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾或氨溶液来调节所述缓冲盐水溶液的ph值，所述ph值调节为3.0-4.0。

进一步优选地，所述ph值调节为3.0-3.5。

进一步地，所述检测方法采用的色谱柱为inertsildiol(4.6mm×250mm，5μm)，其填料活性基团为二醇基，所述色谱柱的进样体积为1-20μl，进样速度为0.5-2.0ml·min-1，检测波长为210-230nm，柱温为30-50℃。

进一步优选地，所述所述色谱柱的进样体积为5μl，进样速度为1.0ml·min-1，检测波长为220±2nm，柱温为30-40℃。

进一步地，所述检测方法还包括：所述洗脱结束后，采用检测器对所述比阿培南有关物质及其含量进行测定。

进一步地，所述比阿培南的检测限为0.04μg·ml^-1。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的比阿培南和/或有关物质的检测方法，操作简便快捷，可以高效、快速、精确测定比阿培南药物中有效物质和具体各种杂质的含量，可为评价比阿培南生产工艺或产品质量及制剂储存等方面提供技术依据；可实现二聚体杂质和其他工艺杂质及降解杂质的同时监测，提高试验及质量评价效率，降低试验成本。

本发明的检测方法专属性良好，可实现强保留杂质的洗脱，方法重复性良好，灵敏度高，且可快速实现与质谱仪的联用，利于未知杂质的结构鉴定。

附图说明

图1是实施例1中比阿培南和有关物质的混合对照品溶液的典型色谱图；

图2是实施例1中来源a的比阿培南原料粗品的典型色谱图；

图3是实施例1中来源a的注射用比阿培南的典型色谱图；

图4是实施例1中来源b的注射用比阿培南的典型色谱图；

图5是实施例1中来源c的注射用比阿培南的典型色谱图；

图6是实施例1中来源d的注射用比阿培南的典型色谱图；

图7是实施例1中来源e的注射用比阿培南的典型色谱图；

图8是实施例2中对照品溶液中的比阿培南的典型色谱图；

图9是实施例2中注射用比阿培南中的比阿培南的典型色谱图；

图10是实施例3中缓冲液ph值为2.5时的比阿培南峰形；

图11是实施例3中缓冲液ph值为3.5时的比阿培南峰形；

图12是实施例4中提供比阿培南检测限的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

本发明涉及一种比阿培南和/或有关物质的检测方法，所述检测方法为正相色谱法，采用由有机溶剂和缓冲盐水溶液组成的流动相进行梯度洗脱，所述有关物质为比阿培南母核、侧链、比阿培南缩合物、开环物、二聚体a、二聚体b、比阿培南氨甲酰开环物中的至少一种。

以下对比阿培南有关物质进行说明，如表1所示：

表1比阿培南及各已有关物质的结构和来源

本发明的实施例中采用的仪器为：agilent高效液相色谱仪(色谱柱为inertsildiol(4.6mm×250mm，5μm))，配备紫外检测器、四元梯度泵、自动进样器；电子天平(mse125p-100-du，德国sartorius公司)；

检测条件：检测波长220nm；流速，1.0ml·min^-1；进样体积，5μl；柱温，35℃；流动相，乙腈-(10mmol·l^-1)磷酸二氢铵缓冲液(ph为3.0)。

样品来源：来源a，江苏某制药公司；来源b，山东某制药公司；来源c，河北某制药公司；来源d，江苏某制药公司；来源e，日本某制药公司。

实施例1

不同来源的比阿培南原料粗品及注射用比阿培南中阿培南和有关物质的检测：

混合对照品溶液的制备：分别取比阿培南母核(先用适量乙腈溶解)、侧链、比阿培南缩合物、开环物、二聚体a、二聚体b、比阿培南氨甲酰开环物各适量，加水溶解，配制成比阿培南浓度为3mg·ml^-1，其他杂质浓度均约为30μg·ml^-1的混合溶液。

样品溶液的制备：取来源a的比阿培南原料、来源分别为a、b、c、d、e(原研)的注射用比阿培南各适量，加水溶解，配制成3mg·ml^-1的溶液。

对上述混合对照品溶液和样品溶液进行正相色谱分析，agilent高效液相色谱仪(色谱柱为inertsildiol(4.6mm×250mm，5μm))，检测波长220nm；流速，1.0ml·min^-1；进样体积，5μl；柱温，35℃；流动相，乙腈-(10mmol·l^-1)磷酸二氢铵缓冲液(ph为3.0)。实验结果如图1-7所示。

本发明建立的色谱分离系统，可以实现强保留杂质比阿培南母核的快速洗脱，且各杂质之间、以及杂质和比阿培南之间分离度均良好，该方法操作简单，分析时间较短，可以为原料生产工艺的评价提供技术支持。且可以区分不同工艺来源的原料，为生产企业生产工艺的监控提供技术保障，为制剂质量一致性评价研究提供依据。

实施例2

注射用比阿培南含量的检测：

取注射用比阿培南(来源a)适量，加水溶解，配制成0.3mg·ml^-1的溶液，进行正相色谱分析，agilent高效液相色谱仪(色谱柱为inertsildiol(4.6mm×250mm，5μm))，检测波长220nm；流速，1.0ml·min^-1；进样体积，5μl；柱温，35℃；流动相，乙腈-(10mmol·l^-1)磷酸二氢铵缓冲液(ph为3.0)，得到如图9所示的注射用比阿培南中的比阿培南的典型色谱图。

与图8对照品溶液中的比阿培南的典型色谱图，峰面积法对照计算可得注射用比阿培南中比阿培南的含量，本发明建立的色谱分离系统，可以快速检测制剂的含量，可以为质量监测提供技术支持。

实施例3

流动相中缓冲液ph值对比阿培南和有关物质之间的分离情况及色谱保留行为的影响：

agilent高效液相色谱仪(色谱柱为inertsildiol(4.6mm×250mm，5μm))，检测波长220nm；流速，1.0ml·min^-1；进样体积，5μl；柱温，35℃；流动相，乙腈-磷酸二氢铵缓冲液；分别在缓冲液ph值为2.5时和缓冲液ph值为3.5时测定比阿培南的峰形，如图10和图11所示。

流动相中缓冲液ph值主要影响比阿培南及其杂质的峰形、比阿培南及有关物质的保留强度。结果显示，在ph＝2.5时，比阿培南峰形较差，可能与比阿培南在该ph条件下解离状态相关；在ph＝3.5时，比阿培南峰形良好且与其前洗脱的氨甲酰开环降解物峰之间分离度良好。

实施例4

本发明的检测方法的比阿培南的检测限：

agilent高效液相色谱仪(色谱柱为inertsildiol(4.6mm×250mm，5μm))，检测波长220nm；流速，1.0ml·min^-1；进样体积，5μl；柱温，35℃；流动相，乙腈-(10mmol·l^-1)磷酸二氢铵缓冲液(ph为3.0)。

如图12所示，有关物质测定时，样品浓度为3mg·ml^-1，比阿培南检测限约为0.04μg·ml^-1，相当于0.001％，灵敏度高。其中，本实施例进样量为5μl，也可以根据选择的仪器的定量环大小调节样品浓度和进样量。

本发明建立的色谱分离系统，以乙腈和磷酸盐为流动相，不采用离子对试剂，检测灵敏度高，利于后续未知杂质的结构鉴定，为工艺的改进提供依据。重要的是在一个色谱系统中可以实现原料生产工艺相关的主要副产物、降解杂质尤其是聚合物杂质的同时检测，比阿培南和上述杂质之间分离良好；试验操作简单方便，分析时间短，可快速实现比阿培南原料及其制剂的质量控制。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。