一种食品真菌毒素结构的稳定性判定方法与流程

本发明涉及食品毒素检测技术领域，特别是涉及一种食品真菌毒素结构的稳定性判定方法。

背景技术：

小麦、玉米等谷物类食品真菌毒素污染严重威胁着人类健康，而镰刀菌毒素(fusariummycotoxin)是其中危害较大的一类。镰刀菌毒素为镰刀菌侵染谷物过程中产生的代谢产物总称，重点包括了玉米赤霉烯酮(zearalenone)、呕吐毒素(vomitoxin)、t-2毒素、伏马毒素(fumonisins)等。其中，玉米赤霉烯酮又称右环十四酮酚，是一种二羟基苯甲酸内脂的合成非甾体雌激素，镰刀菌是其主要产毒菌。t-2毒素主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物。呕吐毒素也叫脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,don),属于单端孢霉烯族化合物，禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌是其主要的产毒菌种。伏马毒素主要由串珠镰刀菌和层出镰刀菌这两种霉菌产生。由于这些毒素化合物普遍具有一定化学惰性，一般食品加工方法难以去除或易带来二次污染，因此急需开发新型友好的脱毒方法。

目前已有诸多减毒或脱毒方法，其中物理吸附剂吸附(活性炭，硅藻土，蒙脱石，葡甘露聚糖),低温等离子体处理、电子束、脉冲光、挤压、蒸煮法等存在便捷程度较低的问题。化学包括了电解水、光敏化、臭氧氧化、催化降解、溶剂洗脱法等，但这些反应条件剧烈、试剂安全性较低。生物法包括了发酵、酶解等，但生物法对环境温湿度要求较高。新兴的食品非热加工方法——脉冲电场法，以其非侵入破坏性的处理方式，便捷可携的设备，高效清洁的效果逐渐在食品风险物质控制方面得到应用，但其存在难以快速预判处理后目标物质结构稳定性的问题，合理的处理参数调节有很大经验依赖性。目前脉冲电场处理后分子结构稳定性评价主要通过气相质谱、液相色谱、液相质谱等色谱法，它们虽可实现精确定量，但成本高昂。

随着高性能计算机的普及和发展，基于外电场条件下分子理论振动光谱(红外和拉曼),能够快速实现对于分子结构稳定性的预测，非常适合脉冲电场脱毒条件初期筛选，因此，行业内急需寻找一种低成本、简便快捷的脉冲电场下镰刀菌毒素结构稳定性判定方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的安全性较低、成本高或者预判缓慢的问题，本发明提供一种食品真菌毒素结构的稳定性判定方法。

本申请的具体方案如下：

一种食品真菌毒素结构的稳定性判定方法，包括：

s1，构建食品真菌毒素的分子结构模型，并将所述分子结构模型转化为模拟输入坐标文件；

s2，对所述分子结构模型进行优化；

s3，基于优化运算输出文件提取能量极小结构坐标文件，并将能量极小结构坐标文件转化为基于笛卡尔坐标系的电场下光谱计算参数文件；

s4，在笛卡尔坐标系下的电场计算参数文件上施加强度等梯度增加的外电场，同时在外电场下逐个对目标毒素分子结构进行优化；

s5，提取在外电场下优化后目标毒素分子结构的能量极小结构，基于能量极小结构进行理论光谱计算，得到不同外电场下食品真菌毒素分子振动光谱偏移规律，根据动光谱偏移规律间接推断出食品真菌毒素分结构在外电场下的稳定性变化。

优选地，步骤s2包括：以m062x/6-311g(d,p)理论水平对所述分子结构模型进行几何结构优化和振动分析。

优选地，几何结构优化四个收敛标准是:最大受力<0.00045；方均根受力<0.00030；最大位移<0.00180；方均根位移<0.00120，对所述分子结构模型进行几何结构优化后再进行分子振动频率分析，分子结构模型的振动频率无虚频即可判定为能量极小结构。

优选地，步骤s4包括：选择笛卡尔坐标系下x、y、z三轴中一个坐标轴，在选择的坐标轴正向逐步施加强度递增的外电场，同时在相同理论水平m062x/6-311g(d,p)下逐个对目标毒素分子结构进行几何优化和振动分析，得到满足几何优化收敛标准和无虚频的外电场响应下的能量极小结构。

优选地，所述择笛卡尔坐标系下x、y、z三轴中一个坐标轴的步骤包括：选择笛卡尔坐标系下x、y、z三轴中原子分布最多的轴向。

优选地，施加的外电场起始值为0.0100a.u，递增步长为0.0025a.u。

优选地，步骤s5包括：基于能量极小结构，基于频率振动分析(关键词freq)结果拟合红外光谱，通过raman关键词拟合拉曼光谱，通过红外光谱和拉曼光谱得到基团振动模式归属，并提取光谱信息，根据提取的光谱信息获得振动峰波数信息，并计算最大相对偏移量，根据最大相对偏移量预测出食品真菌毒素分结构在外电场下的稳定性变化。

优选地，所述食品真菌毒素为镰刀菌毒素，所述镰刀菌毒素为呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从分子振动光谱角度快速表征外电场下镰刀菌真菌毒素分子结构稳定性变化，为在实际中应用脉冲电场控制食源性风险物质提供了理论上的指导，该技术省时经济，可快速实现外电场脱毒素过程中外电场强度参数的预判。具体如下：

1.通过在m062x泛函和6-311g(d,p)基组下成功实现了三种镰刀毒素的基态几何结构优化、不同外电场下的几何结构优化。2.通过设置梯度强度递增的外电场并进行优化和振动分析，大致获得了x轴正向三种镰刀菌毒素分子的最大可耐受外电场强度，脱氧雪腐镰刀菌烯醇为0.04a.u、玉米赤霉烯酮为0.0325a.u、t-2毒素为0.02a.u。

2.无需购买标准品，系统考察了外电场下镰刀菌毒素红外和拉曼两种分子的理论振动光谱，并进行了主要基团的振动模式归属，结果具有定性可靠性。

3.通过比较光谱图中主要振动峰波数偏移变化，获得了不同外电场下镰刀菌毒素分子振动光谱偏移普遍规律，间接观察到镰刀菌毒素分子结构在外电场下的稳定性变化。

附图说明

图1为本发明的食品真菌毒素结构的稳定性判定方法的示意性流程图。

图2(a)为本发明的呕吐毒素分子结构示意图。

图2(b)为本发明的呕吐毒素在外电场下的分子结构图。

图3(a)为本发明的玉米赤霉烯酮分子结构示意图。

图3(b)为本发明的玉米赤霉烯酮在外电场下的分子结构图。

图4(a)为本发明的t2-毒素分子结构示意图。

图4(b)为本发明的t2-毒素在外电场下的分子结构图。

图5(a)为本发明的呕吐毒素在外电场下的第一红外光谱图。

图5(b)为本发明的呕吐毒素在外电场下的第二红外光谱图。

图5(c)为本发明的呕吐毒素在外电场下的第三红外光谱图。

图6(a)为本发明的呕吐毒素在外电场下的第一拉曼光谱图。

图6(b)为本发明的呕吐毒素在外电场下的第二拉曼光谱图。

图6(c)为本发明的呕吐毒素在外电场下的第三拉曼光谱图。

图7(a)为本发明的玉米赤霉烯酮在外电场下的第一红外光谱图。

图7(b)为本发明的玉米赤霉烯酮在外电场下的第二红外光谱图。

图8(a)为本发明的玉米赤霉烯酮在外电场下的第一拉曼光谱图。

图8(b)为本发明的玉米赤霉烯酮在外电场下的第二拉曼光谱图。

图9为本发明的t2-毒素在外电场下的红外光谱图。

图10为本发明的t2-毒素在外电场下的拉曼光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

在本实施例，以预测三种镰刀菌真菌毒素中呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素的结构稳定性为例，三种镰刀菌的分子结构示意图分别为图2(a)、3(a)、4(a)。

利用计算机模拟程序对三种镰刀菌真菌毒素进行建模、几何结构优化和频率振动分析获得能量极小结构。基于此优化的结构，沿三种毒素分子笛卡尔坐标系的x轴正向为固定分子进行施加等梯度增加的外电场，优化获得不同外电场强度下的能量极小结构。在优化过程中设关键词参数以获取红外和拉曼振动光谱信息，之后导入输出结果文件到结果可视化程序中，进行三种毒素分子振动光谱中主要振动峰的振动模式和振动波数归属。通过对比分析不同外电场下的分子理论振动光谱振动峰波数响应值变化，获得光谱偏移量和偏移方向，以定性判定分子结构稳定性变化。具体如下：

参见图1、一种食品真菌毒素结构的稳定性判定方法，包括：

s11，采用gaussianview程序构建三种镰刀菌真菌毒素(呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素)的分子结构模型，并将所述分子结构模型转化为模拟输入坐标文件；导出为gaussian程序输入文件(gjf或com后缀文件)，打开输入文件后，设置优化理论水平为m062x/6-311g(d,p)，频率分析和红外光谱拟合关键词均为freq。

s12，对所述分子结构模型进行优化；具体地，步骤12包括：在gaussian程序包中以m062x/6-311g(d,p)理论水平对所述分子结构模型进行几何结构优化和振动分析。其中几何结构优化四个收敛标准是:最大受力<0.00045；方均根受力<0.00030；最大位移<0.00180；方均根位移<0.00120，对于平面分子或柔性较大分子，最大位移项不满足收敛标准，而其他三项满足收敛标准也同样认为该优化过程收敛。对所述分子结构模型进行几何结构优化后通过关键词freq再进行分子振动频率分析，分子结构模型的振动频率无虚频即可判定为能量极小结构。

s13，基于优化运算输出文件提取能量极小结构坐标文件，并将能量极小结构坐标文件转化为基于笛卡尔坐标系的电场下光谱计算参数文件；其中能量极小结构是本领域一般技术人员所熟知的名词。

通过检查以上步骤中获得的输出文件末尾是否出现正常结束的提示，并通过查找关键词frequencies进行检查频率是否为虚频，通过查找关键词yes检查几何优化收敛情况，通过检查后提取该文件中的能量极小结构，三种毒素分子优化后结构如图2(b)、3(b)、4(b)所示。结构坐标参数文件分别如表1、2、3所示。

表1m062x/6-311g(d,p)水平下呕吐毒素优化后坐标信息

表2m062x/6-311g(d,p)水平下玉米赤霉烯酮优化后坐标信息

表3m062x/6-311g(d,p)水平下t-2毒素优化后坐标信息

s14，在笛卡尔坐标系下的电场计算参数文件上施加强度等梯度增加的外电场，同时在外电场下逐个对目标毒素分子结构进行优化；步骤s4包括：选择笛卡尔坐标系下x、y、z三轴中原子分布最多的轴向，在选择的坐标轴正向逐步施加强度递增的外电场，比如对脱氧雪腐镰刀菌烯醇沿分子轴x轴正坐标，逐步施加强度为0.01、0.0125、0.0150a.u…，即以0.0025a.u递增的外电场强度；此处对呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素首先优先选择x轴正向。外电场强度设置采用梯度增加进行，起始值为0.0100a.u，递增步长为0.0025a.u。同时在相同理论水平m062x/6-311g(d,p)下逐个对目标毒素分子结构进行几何优化和振动分析，得到满足几何优化收敛标准和无虚频的外电场响应下的能量极小结构。优化过程中设置关键词使得分子固定朝向设置的电场方向，得到满足几何优化收敛标准和无虚频的外电场响应下能量极小结构。具体地，在外电场下优化过程中，在参数文件中通过添加nosymn关键词确保脱目标毒素分子在优化时始终沿着x轴，不发生偏移和翻转，获得能量极小结构。优化过程中，添加红外光谱和拉曼光谱频率校正因子0.97。

对于以上步骤产生的一系设置有外电场参数的毒素分子结构文件进行优化，尽可能最大限度产生满足几何收敛标准和无虚频条件的能量极小结构，之后提取这些能量极小结构，基于频率振动分析(关键词freq)结果进行红外光谱拟合，通过关键词raman进行拉曼光谱拟合。

s15，提取在外电场下优化后目标毒素分子结构的能量极小结构，基于能量极小结构进行理论光谱计算，得到不同外电场下食品真菌毒素分子振动光谱偏移规律，根据动光谱偏移规律间接推断出食品真菌毒素分结构在外电场下的稳定性变化。

具体地，步骤s15包括：基于已收敛的外电场下毒素分子优化振动分析结果(用于提取外电场下能量极小结构)，直接提取红外光谱，通过raman关键词拟合拉曼光谱。通过红外光谱和拉曼光谱得到基团振动模式归属，并提取光谱信息，根据提取的光谱信息获得振动峰波数信息，并计算最大相对偏移量，根据最大相对偏移量预测出食品真菌毒素分子结构在外电场下的稳定性变化。

在本实施例，在直接提取红外光谱，通过raman关键词拟合拉曼光谱时，在设置频率校正因子为0.97，基于gaussian程序完成理论红外和拉曼光谱拟合，获得输出文件(log或out后缀文件)。在gaussianview程序中观看红外和拉曼光谱拟合输出结果文件，根据gaussianview程序导入输出文件(log或者out文件)，[结果]result→[振动]vibrations→[开始动画]startanimation进行毒素分子光谱图中主要振动峰的振动模式归属。并导出光谱信息文件，导入origin2016程序作图，对比分析振动峰最大相对偏移量，结果如表4-9所示。

基于振动波数偏移预测分子结构稳定性，可间接通过化学键力常数来判定。一般的，对于双原子分子振动，分子振动模型可看成分子中原子为平衡点为中心做简谐振动过程。基于此模型，把化学键相连的两个原子近似看成是谐振子，则分子中每个谐振子的振动频率v(振动波数)，可用经典力学中的胡可定理表述：

其中，k为化学键力常数(n·cm-1)，是将化学键两端的原子由平衡位置拉长0.1nm后的恢复力。μ1为折合质量，μ1＝(ma·mb)/ma+mb,ma和mb分别为化学键两端原子a和b的质量。当用波数б代替v,用原子a、b的折合相对原子质量μ代替μ1，上述公式变为：

表明双原子基团的振动频率与化学键力常数的平方根成正比，也就是化学键越强，折合相对原子质量越小，其振动频率越高，反之，在折合相对原子质量变化不大的情况下，振动频率越低，表明化学键力常数越低。

从图2(b)、3(b)、4(b)中可以看出，对于呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素在x轴正向下均有较y轴和z轴更多的原子分布，故优先选择x轴正向进行外电场下优化、振动分析、红外和拉曼光谱计算。结合图5(a)、5(b)、5(c)和表4可看出，呕吐毒素红外光谱图中有五个较明显的振动峰，从左往右依次将其命名为①、②、③、④、⑤。振动分析归属可知它们分别对应于呕吐毒素分子中的羟基o4-h37的收缩振动、乙烯基c11-h23-h24的收缩振动、羰基c9＝o6的收缩振动，羟基o3-h36和烃基c12-h27面外摆动，以及羟基o3-h36和o5-h38的面外摆动。以未加电场时的振动波数为初始值，对比不同外电场下的波数变化，可以看出，随着电场强度增加，这些振动峰的波数向着短波长方向移动，均发生了蓝移现象，最大蓝移值可为284cm-1。根据影响官能团特征振动频率的因素主要是由基团中原子的质量和原子间的化学键力常数决定，蓝移现象表明外电场下，呕吐毒素分子中上述基团的振动频率降低，呕吐毒素分子中上述基团的化学键强度逐步降低，表明分子稳定性越来越差。根据图6(a)、6(b)、6(c)中呕吐毒素外电场下拉曼光谱，结合表5可知，对于呕吐毒素分子，较明显的拉曼振动峰为烃基c12-h22的收缩振动、烃基c15-h29-h30-h31的收缩振动、烃基h24-c11-h23的收缩振动，随着外电场强度增加，也均发生了明显的蓝移现象。外电场下，这三种振动峰的波数从可最大蓝移分别为35、52、110cm-1,表明外电场下，呕吐毒素c-h键强度逐渐减弱，分子稳定性逐步降低。综合呕吐毒素红外和拉曼光谱偏移量可看出，在电场强度为0.0400a.u时，蓝移程度最大，表明该电场强度下呕吐毒素分子结构稳定性最低。

表4呕吐毒素外电场下红外光谱主要振动峰归属和最大偏移量

表5呕吐毒素外电场下拉曼光谱主要振动峰归属和最大偏移量

对于玉米赤霉烯酮，结合图7(a)、7(b)为玉米赤霉烯酮在外电场下红外光谱图和表6可知，随着外电场强度增加，玉米赤霉烯酮的红外光谱中的四个主要振动峰，①羟基o5-h45的收缩振动，②烃基c13-h36-h35-h37的收缩振动，③羰基c18＝o3的收缩振动和羟基o4-h44的面外摆动，④羟基o5-h45的面外摆动均会发生一定程度的蓝移，最大蓝移值为200cm-1。结合玉米赤霉烯酮在外电场下拉曼光谱图8(a)、8(b)和表7，可知，对于玉米赤霉烯酮的三个主要拉曼振动峰，①羟基o5-h45的收缩振动，②烃基c13-h35-h36-h37的收缩振动，③乙烯基c19＝c16的收缩振动，均随外电场强度增加而蓝移，最大蓝移值为343cm-1。综合红外和拉曼光谱可知，玉米赤霉烯酮在外电场强度0.0325a.u下稳定性最差。

表6玉米赤霉烯酮外电场下红外光谱主要振动峰归属和最大偏移量

表7玉米赤霉烯酮外电场下拉曼光谱主要振动峰归属和最大偏移量

对于t-2毒素，结合外电场下红外光谱图9和表8，可知，随着外电场强度增加，t-2毒素红外光谱主要振动峰①羟基o4-h49的收缩振动、②烃基c32-h63-h62、c33-h67-h66的收缩振动，③羰基c26＝o8的收缩振动，④o3＝c24＝07的面外摆动，⑤羟基o4-h49的面外摆动均发生蓝移现象，最大蓝移值为143cm-1。结合外电场下拉曼光谱图10和表9，可知，随着外电场强度增加，t-2毒素拉曼光谱主要振动峰①烃基c32-h63-h62不对称收缩振动，②烃基c29-h56-h57-h58的收缩振动，③烃基c32-h62-h63-h64的收缩振动均发生蓝移现象，最大蓝移值为40cm-1。综合t-2毒素外电场下红外和拉曼光谱偏移量可知，其在外电场强度为0.0200a.u下稳定性最低。

表8t2-毒素外电场下红外光谱主要振动峰归属和最大偏移量

表9t2-毒素外电场下拉曼光谱主要振动峰归属和最大偏移量

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。