一种呋塞米中糠胺含量测定的控制方法与流程

本发明属于分析化学
技术领域：
，具体涉及用高效液相色谱法测定呋塞米中糠胺含量的分析方法。
背景技术：
：呋塞米，化学名furosemide。临床广泛用于治疗与心力衰竭有关的水肿，也可单独或与其他抗高血压药物联合使用治疗高血压。其结构式如下：呋塞米的合成多以糠胺和2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸为起始原料，经过取代反应、精制等步骤得到呋塞米，生产中多以2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸的含量来监控反应终点，糠胺的残留量易被忽略。糠胺的结构式如下：快速准确的测定呋塞米中残留的糠胺含量具有挑战性。糠胺常温下为液体，首选气相色谱法测定：糠胺为小分子胺，fid检测器上的响应低，而且呋塞米不易挥发，高温易分解，无法直接准确测定呋塞米中含有的1%以下的糠胺；糠胺沸点高，呋塞米的溶解度低，气相顶空法测定亦无法满足检测要求。由于气相色谱法胺类杂质检测过程残留较大，重复性差，灵敏度低，因此，很难采用一般的气相色谱法对呋塞米中残留的糠胺进行定量测定。糠胺极性强，不具备敏感的紫外吸收基团，但有较弱的紫外吸收。为克服糠胺灵敏度的缺陷，可通过增加供试品浓度的方式来提高限度浓度。呋塞米在氢氧化钠溶液中的溶解度高，但直接进酸性流动相中，增大呋塞米析出风险，甚至会堵塞仪器。故而通过中和的方式，使呋塞米析出，过滤除去，同时确保糠胺全部溶解。对微量糠胺的定量通常需要采用质谱测定。本研究中采用液相色谱法进行控制，操作简单，灵敏度可达30ppm，满足最低的限度要求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用液相色谱法分离测定呋塞米中微量糠胺的方法，它采用氢氧化钠溶解酸中和并过滤的前处理方式，并采用紫外检测器测定。该方法通过验证能有效达到对少量糠胺的定量测定，从而实现对呋塞米质量的有效控制。解决了现有技术下对呋塞米中糠胺残留的有效质量控制的问题，该方法简单、快速、准确。其特征如下：所述稀释剂为0.05~0.2mol/l的盐酸溶液、95%的乙腈水溶液、氢氧化钠溶液、甲醇，优选稀释剂为0.05~0.3mol/l的盐酸溶液，更优选0.1mol/l的盐酸溶液。所述供试品中呋塞米的浓度为1mg/ml~50mg/ml，优选2~10mg/ml。所述前处理方式为：0.2~0.5m的氢氧化钠溶液使呋塞米全部溶解，用盐酸中和，并用稀释剂定量稀释至刻度。所述方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。所述流动相中水相为磷酸缓冲液，其中含有0.1~1%的离子对试剂，磷酸调节ph至2.3~4.0。方法优选ph2.5~3.0。所述方法中设置流动相流速为0.5~2.0ml/min，柱温控制在35℃~50℃之间。所述方法中采用紫外检测器，检测波长优选为190~220nm。呋塞米中糠胺残留量测定的具体方法如下：一、仪器与试剂岛津2030plus高效液相色谱仪，湘仪l420型离心机，乙腈（色谱纯），盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、庚烷磺酸钠（分析纯）、磷酸（色谱纯）。稀释剂：盐酸溶液。磷酸盐缓冲液：庚烷磺酸钠溶于1000ml水中，磷酸调节为ph2.5~3.0；对照品溶液：取糠胺对照品适量，用盐酸溶液定量稀释，摇匀，即得对照品溶液。二、样品的测定：（1）样品前处理：避光操作，取呋塞米样品，精密称定，加入0.5ml氢氧化钠使溶解，加稀释剂定量稀释至刻度，摇晃，离心，取上清，作为供试品溶液。（2）色谱条件：流动相：磷酸盐缓冲液为水相，乙腈为有机相，进行洗脱。采用高效液相色谱法测定，紫外检测波长210nm。（3）专属性试验在上述色谱条件下，依次分别取空白溶剂、糠胺对照品、呋塞米及其他已知杂质的溶液，可知糠胺与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，空白溶剂、呋塞米及其他杂质均未干扰糠胺测定，符合要求。（4）定量限在上述色谱条件下，根据色谱峰的信噪比为10:1时的响应浓度确定定量限，信噪比为3:1时的响应浓度确定检测限，经测定糠胺的检测限为0.05μg/ml，定量限为0.2μg/ml。（5）线性配制不同浓度的糠胺对照品溶液，记录峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，得到回归方程：y=61152x+1586，r²=0.9999。（6）仪器精密度试验制备定量限浓度的对照品溶液一份，按上述条件连续进样6针，记录峰面积，计算相对峰面积的标准平均偏差为2.6%，准确度试验称取11份样品，其中2份按照供试品溶液配制。其他9份分成3组，每组分别加入糠胺3个浓度的对照品溶液，每个浓度平行配制3份，制备加标样品，按上述色谱条件测定。经计算，糠胺平均回收率为93.8%，rsd为2.8%。（7）溶液的稳定性取含糠胺对照品溶液放置13小时内分别进样测得峰面积，计算rsd为1.1%。糠胺对照品溶液稳定性测定在13h内稳定。本方法专属性强、灵敏度高、线性范围宽、定量准确、溶液稳定性好等特性。为切实可行的测定呋塞米原料及制剂中残留糠胺提供了有力的科学依据。本发明具有的积极效果：本发明采用高效液相色谱法测定，尤其是通过创造性劳动得到的特殊的前处理方法和稀释剂，从而实现了呋塞米中残留微量糠胺的定量测定，最终保证可呋塞米的有效性和安全性。附图说明附图1：根据本发明实施例1得到的糠胺对照品溶液液相色谱图。附图2：根据本发明实施例1得到的呋塞米供试品溶液液相色谱图。具体实施方式以下实施例仅用于说明本发明，但不作为对本发明保护范围的限制。实施例1仪器高效液相色谱仪：岛津，lc-2030c，uv检测器。色谱柱：ultimateaq-c18（4.6mm×250mm，5μm）。流动相：水相为磷酸缓冲液（0.5g庚烷磺酸钠溶于1000ml水中，磷酸调节ph至2.6）；有机相为乙腈。洗脱梯度：时间（min）流动相a（%）流动相b（%）0955209552330702930703095545955流速为1.0ml/min柱温为35℃检测波长：210nm进样量：50μl稀释剂：0.1mol/l的盐酸溶液样品处理：取本品20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加0.2m氢氧化钠溶液0.5ml使溶解，再用稀释剂（0.1mol/l的盐酸溶液）定量稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液；取杂质糠胺对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lml中约为2µg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品及供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图分别见图1和图2，按外标法计，糠胺含量为0.01%。图2可以看出：本发明的方法能够有效测定呋塞米中残留的少了糠胺的含量，可以用于呋塞米原料及中间体的质量检测。实施例2。仪器同实施例1。色谱柱：thermohypersilbdsc184.6mm×250mm，5μm适用）。稀释剂同实施例1流动相：水相为磷酸缓冲液（0.3g辛烷磺酸钠溶于1000ml水中，磷酸调节ph至2.8）；有机相为甲醇。水相：有机相=90:10。流速为1.5ml/min柱温为40℃检测波长：210nm进样量：10μl稀释剂：0.05mol/l的盐酸溶液样品处理：呋塞米注射液2ml，置10ml量瓶中，稀释剂定量稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液；取杂质糠胺对照品适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每lml中约为20µg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品及供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计，糠胺含量为0.02%。当前第1页1 2 3