利用荧光指纹分析的处理原料中的TSNAs定量方法、程序以及装置与流程

利用荧光指纹分析的处理原料中的tsnas定量方法、程序以及装置
技术领域
1.本发明涉及利用荧光指纹分析的处理原料中的tsnas定量方法、程序以及装置，尤其涉及可适用于tsnas中的微量成分的定量的定量方法、程序以及装置。
2.另外，tsnas是指烟草特有亚硝胺(tobacco
‑
specific nitrosamines)，作为典型的tsnas，可列举nnn(n'
‑
亚硝基去甲烟碱)、nnk(4
‑
(甲基亚硝氨基)
‑1‑
(3
‑
吡啶基)
‑1‑
丁酮)、nat(n'
‑
亚硝基新烟草碱)、nab(n'
‑
亚硝基假木贼碱)这四种。


背景技术：

3.对试样中的成分进行测量的一般的方法是利用提取液提取试样中的各种成分，并利用高效液相色谱法(hplc
‑
ms/ms)对其进行定量。但是，在该方法中，样品的预处理、测量需要花费劳力和时间。
4.作为为了对试样中的成分进行分析、定量，无需对样品进行预处理就能够进行无损分析的成分分析、定量方法，已知利用了近红外(near
‑
infrared)分光分析(nir)的分析、定量。在nir中，使用所测量的nir光谱进行校准曲线(calibration curve)的制作和验证，并使用所制作的校准曲线进行成分分析和定量。
5.此外，作为无需对样品进行预处理就能够进行无损分析的成分分析、定量方法，还已知利用了荧光指纹信息的分析、定量(例如参见专利文献1等)。在这样的荧光指纹分析中，使用所测量并获取的荧光指纹信息进行校准曲线的制作和验证，并使用所制作的校准曲线进行成分分析和定量，从这一点来看，其部分特征与nir相同。下面，先简单地说明有关荧光指纹和荧光指纹分析的概略。
6.如图2所示，当一边向含有荧光物质的试验试样照射激发光一边阶段性地改变波长，并测量从试验试样发出的光(荧光)时，在将激发波长(λex)、荧光波长(测量波长)(λem)、荧光强度(iex，em)设为三个正交轴的三维空间中，描绘出对应的点。
7.将这些点的集合可视化后的结果，称为荧光指纹或者激发荧光矩阵(excitation emission matrix；eem)。
8.对于荧光指纹，通过利用等高线形状、颜色分布等来显示各个点的荧光强度，可以将其表示为三维曲线图(参见图3)，此外，也可以将其表示为二维曲线图(参见图4)。
9.这种荧光指纹示出了三维的具有大量信息的试验试样固有的图案，能够用于各种鉴别、定量等。
10.与其它分光分析方法相比，这种荧光指纹分析具有以下优点：无需对试验试样进行荧光染色等预处理就能够进行试验试样的表征(characterization)；操作简单且还能够在短时间内进行测量；信息量多且还能够比较容易地进行定量；能够进行无损、无接触的测量；由于使用了紫外～可见光，因而装置比较便宜。
11.在荧光指纹的测量中，需要荧光分光光度计，其具有扫描激发波长并连续地测量各个荧光光谱的功能，市场上也销售具有这种功能的荧光分光光度计(日立高新技术公司
制造的f
‑
7000等)。
12.现有技术文献
13.专利文献
14.专利文献1：日本特开第2018
‑
40779号公报


技术实现要素：

15.发明要解决的课题
16.如上述那样，在将高效液相色谱法(hplc
‑
ms/ms)应用于tsnas测量的情况下，样品的预处理、测量需要花费劳力和时间。
17.此外，考虑将nir应用于tsnas测量，但nir存在例如以下问题，难以采用nir。
18.(1)不具有用于对烟草原料中的tsnas浓度范围进行测量的足够的灵敏度。
19.(2)试样中的tsnas的峰与烟碱的峰重叠，此外，烟碱的存在量远远多于tsnas，因而tsnas的峰被烟碱的峰掩盖，难以识别tsnas的峰。
20.因此，考虑将能够设定为与nir相比高灵敏度的荧光指纹分析应用于tsnas测量。这种情况下，与nir相比，还能够进行考虑了精密的化学结构的区别的测量，因而能够识别烟碱和tsnas的峰位置。然而，上述四种tsnas之中，尤其对于nnk和nab来说，其在烟草原料中的存在量非常微量，因而即使使用荧光指纹分析，也难以对这些成分进行单独定量。
21.用于解决课题的手段
22.为了解决上述课题，本发明人等提出了一种新的方法，用于利用荧光指纹分析对tsnas进行定量。下面，对该方法的概要进行说明。
23.本发明人等对处理原料(烟草原料)中存在的四种tsnas进行了研究，结果认识到：即使在四种tsnas的含量不同的情况下，它们的含量的比(各tsna的存在比率)在同一烟草种类的烟草原料中也没有大的差异。
24.换言之，发明人认识到：在将同一烟草种类的烟草原料中存在的四种tsnas的含量(例如重量％)分别设为nnn：a、nat：b、nnk：c、nab：d的情况下，它们之间的比(各tsna的存在比率)即a：b：c：d在同一烟草种类中基本上一定。作为烟草种类，以白肋烟(burley)种为例，可得到a：b：c：d＝55：35：8：2左右的数值。
25.然后，基于上述认识进一步研究后发现：在将四种tsnas的四个峰作为整体，看作是一个峰的情况下，对于该一个峰来说，虽然峰的高度根据成分量的变化而发生变化，但在同一烟草种类的烟草原料中，是大致相似的形状(详见后述)。
26.由此，得出了以下结论：能够通过识别四种tsnas的总和作为荧光指纹的峰，并提取该峰，从而对还考虑了nnk、nab那样的难以单独定量的成分的定量值的四种tsnas的总量进行定量，并基于该总量和各tsna的已知的存在比率，对四种tsnas进行定量。
27.本发明是基于上述研究结果而提出的，对于本发明的实施方式，例示如下。
28.(方式1)
29.一种利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，包括：荧光指纹信息获取工序，对于含有nnn、nnk、nat以及nab四种烟草特有亚硝胺(tsnas)的烟草原料，获取荧光指纹信息，该荧光指纹信息包括激发波长、荧光波长以及荧光强度的数据；估计模型制作工序，将所述荧光指纹信息设为解释变量、将根据所述烟草原料中的四种tsnas的已知的定量值计算出
的所述四种tsnas的含量的总量设为响应变量，获取校准曲线；总量估计工序，基于所述校准曲线和所述四种tsnas的含量未知的烟草原料的荧光指纹信息，估计所述烟草原料中含有的所述四种tsnas的含量的总量；以及含量估计工序，基于估计出的所述四种tsnas的含量的所述总量和所述四种tsnas的已知的存在比率，估计所述四种tsnas的含量。
30.(方式2)
31.如方式1所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，在所述荧光指纹信息获取工序中，通过经由用于减少特定波长范围的光的强度的滤光器(filter)对荧光进行测量，从而获取所述荧光指纹信息。
32.(方式3)
33.如方式2所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，所述特定波长范围为400nm以上。
34.(方式4)
35.如方式1至3所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，在所述估计模型制作工序中，通过多变量分析来制作上述校准曲线。
36.(方式5)
37.如方式4所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，所述多变量分析为pls回归分析。
38.(方式6)
39.如方式1至5所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，所述方法还包括预处理工序，所述预处理工序包括针对所述荧光指纹信息的删除处理。
40.(方式7)
41.如方式1至6所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，在激发光的照射前，所述试验试样被粉碎并混合成粉末状。
42.(方式8)
43.如方式7所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，通过所述试验试样的粉碎，使试样的粒径为1mm以下。
44.(方式9)
45.如方式1至8所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，为了事先使水分量固定，所述烟草原料在规定的调和条件下被贮存规定时间。
46.(方式10)
47.如方式9所述的利用荧光指纹分析的烟草原料的定量方法，其特征在于，所述调和条件是温度22℃、湿度60％的室内的条件，所述规定时间为24小时以上。
48.(方式11)
49.一种程序，用于使计算机执行方式1至10所述的方法。
50.(方式12)
51.一种装置，其特征在于，具有：估计模型制作单元，输入与含有nnn、nnk、nat以及nab四种烟草特有亚硝胺即tsnas的烟草原料有关的、包括激发波长、荧光波长以及荧光强度的数据的荧光指纹信息，将所述荧光指纹信息设为解释变量、将根据所述烟草原料中的四种tsnas的已知的定量值计算出的所述四种tsnas的含量的总量设为响应变量，获取校准
曲线；总量估计单元，基于所述校准曲线和所述四种tsnas的含量未知的烟草原料的荧光指纹信息，估计所述烟草原料中含有的所述四种tsnas的含量的总量；以及含量估计单元，基于估计出的所述四种tsnas的含量的所述总量和所述四种tsnas的已知的存在比率，估计所述四种tsnas的含量。
52.(方式13)
53.如方式12所述的装置，其特征在于，通过经由用于减少特定波长范围的光的强度的滤光器对荧光进行测量，从而获取所述荧光指纹信息。
54.(方式14)
55.如方式13所述的装置，其特征在于，所述特定波长范围为400nm以上。
56.(方式15)
57.如方式12至14所述的装置，其特征在于，所述装置还具有预处理单元，所述预处理单元对所述荧光指纹信息进行预处理。
58.(方式16)
59.如方式15所述的装置，其特征在于，所述预处理包括针对所述荧光指纹信息的删除处理。
60.另外，“程序”是通过任意的语言、记述方法记述的数据处理方法，与源代码、二进制代码等的形式无关。此外，“程序”可以构成为单一形式，也可以分散构成为多个模块、库，此外，也可以构成为与其它现有的程序协同来实现其功能。
61.此外，“装置”可以构成为硬件，但也可以构成为通过计算机的软件来实现各种功能的功能实现单元的组合。功能实现单元可包括例如程序模块。
62.发明的效果
63.根据本发明，能够迅速且准确地对处理原料中包含的四种tsnas进行定量。
附图说明
64.图1是用于对本发明的一实施方式的概要进行说明的流程图。
65.图2是表示在向测量对象物照射激发光的情况下从该测量对象物发出的荧光的光谱的概要的说明图。
66.图3是三维地表示荧光指纹的一例的等高线形状的曲线图。
67.图4是二维地表示荧光指纹的一例的等高线形状的曲线图。
68.图5是表示样品的荧光指纹的一例的图。
69.图6是表示含有tsnas试剂的标本的荧光指纹的一例的图。
70.图7是针对多个样品，描绘了由四种tsnas的含量的总量和基于荧光指纹信息的估计值规定的点的曲线图。
71.图8是用于对本发明的另一实施方式的概要进行说明的框图。
72.图9是表示通过经由使波长范围为400nm以上的光的强度减少的滤光器来测量荧光从而获取的样品的荧光指纹的一例的图。
73.图10是用于对使波长范围为400nm以上的光的强度减少的滤光器的配置的概要进行说明的示意图。
74.图11是针对多个样品，使用通过经由使波长范围为400nm以上的光的强度减少的
滤光器来测量荧光从而获取的荧光指纹信息，描绘了由四种tsnas的含量的总量和基于荧光指纹信息的估计值规定的点的曲线图。
具体实施方式
75.下面，对本发明的实施方式进行说明，但需要注意的是，本发明不限于以下说明的实施方式。
76.<本发明的一实施方式的概要>
77.图1是用于对本发明的一实施方式的概要进行说明的流程图。
78.首先，准备四种tsnas的含量已知的试验试样(烟草原料)(s01)，针对这样的已知的试验试样，测量荧光指纹，获取荧光指纹信息(s02)。
79.另外，在获取所述荧光指纹信息时，优选经由用于减少特定波长范围的光的强度的滤光器来测量荧光。此外，优选将该特定波长范围设为400nm以上。详见后述(参见〔本发明的优选的一实施方式〕)。
80.接着，根据需要对所获取的荧光指纹信息进行预处理(s03)。另外，也可以省略该预处理。关于预处理，详见后述。
81.接着，对所获取的荧光指纹信息与试验试样中含有的四种tsnas的总量之间的关系进行模型化，制作估计模型(校准曲线)(s04)。具体而言，通过使用各种多变量分析方法、数据挖掘方法来建立以所获取的荧光指纹信息为解释变量(explanatory variable)、以四种tsnas的总量为响应变量(response variable)的估计式，从而进行该模型化，并制作用于根据荧光指纹信息来估计试验试样中的四种tsnas的总量的校准曲线(回归式)。另外，估计式的建立中使用的算法也可以是更加通用且适应于非线性现象的机器学习算法，例如支持向量机(support vector machine，svm)、随机森林(random forest，rf)、神经网络(neural network)等。模型化时使用的多变量分析方法的例子见后述。
82.对这样建立的估计模型(校准曲线)进行验证，确认其有效性(s05)。
83.使用被确认了有效性的估计模型(校准曲线)，基于未知的处理原料(烟草原料)的荧光指纹信息，估计所述未知的处理原料(烟草原料)中作为成分而被含有的四种tsnas的总量(s06)。
84.基于估计出的四种tsnas的总量和各tsna的已知的存在比率，估计四种tsnas的含量(s07)。
85.<本发明的另一实施方式的概要>
86.图8是用于对本发明的另一实施方式的概要进行说明的框图。
87.tsnas定量装置100用于利用荧光指纹分析对处理原料中的tsnas进行定量，具有：预处理单元110，输入与试样(烟草原料)有关的包含激发波长、荧光波长以及荧光强度的数据的荧光指纹信息，并对被输入的荧光指纹信息进行预处理；估计模型制作单元120，将所述预处理单元110的输出设为输入、将实施了预处理的荧光指纹信息设为解释变量、将所述试验试样中含有的四种tsnas的总量设为响应变量，获取校准曲线；总量估计单元130，基于所述估计模型制作单元120获取的所述校准曲线和未知的处理原料(烟草原料)的荧光指纹信息，估计所述未知的处理原料(烟草原料)中作为成分而被含有的四种tsnas的总量；以及含量估计单元140，基于估计出的四种tsnas的总量和各tsna的已知的存在比率，估计四种
tsnas的含量。另外，也可以省略预处理单元110。
88.首先，使用已知的荧光分光光度计等，获取成分的种类、含量已知的试验试样的荧光指纹信息。
89.另外，在获取所述荧光指纹信息时，优选经由用于减少特定波长范围的光的强度的滤光器来测量荧光。此外，优选将该特定波长范围设为400nm以上。详见后述(参见〔本发明的优选的一实施方式〕)。
90.接着，将所获取的荧光指纹信息输入至所述预处理单元110，并对被输入的荧光指纹信息进行预处理。另外，可以省略该预处理。此外，关于进行预处理的情况下的预处理，详见后述。
91.接着，通过估计模型制作单元120，对已实施预处理的荧光指纹信息与四种tsnas的总量之间的关系进行模型化，制作估计模型(校准曲线)。该模型化与上述本发明的一实施方式相同。然后，对这样建立的估计模型(校准曲线)进行验证，确认其有效性，并将被确认了有效性的估计模型(校准曲线)预先存储至未图示的存储器等。
92.总量估计单元130使用被确认了有效性的估计模型(校准曲线)，并基于未知的处理材料(烟草原料)的荧光指纹信息，估计所述未知的处理材料(烟草原料)中作为成分而被含有的四种tsnas的总量。另外，优选对未知的试样的荧光指纹信息也进行所述预处理单元110的预处理(图8的tsnas定量装置100采用了这种结构)，但也可以根据需要省略这样的预处理。
93.含量估计单元140基于估计出的四种tsnas的总量和各tsna的已知的存在比率，估计四种tsnas的含量。另外，各tsna的已知的存在比率的信息可以被预先存储于含量估计单元140或者tsnas定量装置100，也可以从外部被提供至tsnas定量装置100。
94.<模型化时使用的多变量分析方法>
95.作为模型化时使用的多变量分析方法，可以使用pls(partial least squares，偏最小二乘法)回归分析、多元回归分析、主成分回归分析、最小二乘法等各种分析方法。
96.pls回归分析是提取主成分以使主成分与响应变量之间的协方差成为最大的方法，在解释变量之间存在较强的相关的情况(产生多重共线性的情况下)下有效。
97.主成分回归分析是提取主成分以使主成分的方差成为最大的方法，仅使用解释变量进行主成分分析，并在所获得的主成分与响应变量之间进行基于最小二乘法的多元回归分析。
98.多元回归分析是在解释变量与响应变量之间适用最小二乘法的方法，具有与主成分回归分析不同的特征。
99.另外，上述的各种分析方法本身是众所周知的，本发明在进行模型化时不需要特殊的处理，因此对处理内容的细节进行省略，但关于pls，其与校准曲线的制作之间的关联见后述。
100.<关于识别四种tsnas的总和作为荧光指纹的峰，并提取该峰的方法>
101.如上述那样，本发明能够通过采用识别四种tsnas的总和作为荧光指纹的峰，并提取该峰的方法，从而对还考虑了如nnk、nab那样的难以单独定量的成分的定量值的四种tsnas的总量进行定量，并基于该总量和各tsna的已知的存在比率对四种tsnas进行定量。
102.参照图5和图6，对在将四种tsnas的四个峰作为整体，看作是一个峰的情况下，与
峰的高低无关地，峰的形状在同一烟草种类的烟草原料中成为大致相似的形状的情况进行说明。
103.图5是表示样品的荧光指纹的一例的图。使用白肋烟种作为样品，该样品中含有的四种tsnas的总和为2.856μg/g。另外，对于样品，实施了基于后述那样的调整条件的处理。
104.图6是表示含有tsnas试剂的标本的荧光指纹的一例的图。样品是将四种tsnas的试剂按照与白肋烟种大致相同的比率与乙醇溶液混合而制作的，该标本中含有的四种tsnas的总和为1.28μg/g。
105.另外，关于荧光指纹的测量条件，两者均相同，激发光200nm
‑
600nm、荧光200nm
‑
700nm、分辨率2.5nm、狭缝宽度2.5nm、光电倍增管灵敏度950v。
106.对比图5的荧光指纹信息和图6的荧光指纹信息，大体得到了以下认识。
107.·
在图6的标本中被确认的四种tsnas的荧光指纹信息(参见图6的被标记为“a'”的椭圆形框的区域(“区域a'”))也在图5的样品中被确认(参见图5的被标记为“a”的椭圆形框的区域(“区域a”))。
108.·
与图5的区域a相比，虽然图6的区域a'的荧光指纹信息的峰的高度不同，但两者具有大致相似的形状。
109.·
在图5中，由于样品中的其它材料的荧光带来的影响，大量的区域发生了饱和(由于灵敏度取最大值)，但即使在这样的情况下，也能够识别区域a，认为夹杂物带来的影响较低。
110.·
认为在实际测量时，删除被预测为会发生饱和的区域的荧光指纹信息，对于tsnas的荧光指纹信息的差异化的实现是有效的。此外，认为预处理对于避免例如二次微分等饱和有可能对其它波长产生影响的处理也是有效的。
111.下面，对本发明的一实施方式的各工序进行说明。
112.〔试验试样(烟草原料)的准备〕
113.关于四种tsnas的含量已知的各个样品，作为试验试样，准备了粉碎为粒径1mm以下并充分混合的样品。
114.由于四种tsnas也有可能局部存在于烟草原料中，因此，优选以这种方式：在测量前将试样粉碎为一定粒径(直径1mm)以下并充分混合，然后获取荧光指纹。另外，对于各个样品中的四种tsnas的含量，事先通过高效液相色谱法(hplc
‑
ms/ms)进行了定量。
115.此外，对于试验试样而言，使用了为了事先使水分量固定而被贮存的试验试样。为了使试验试样的水分量固定，优选在调和条件(22度60％的室内)下贮存24小时以上。这样，通过以这种方式在测量前预先使水分量固定，使得荧光的峰移位难以发生。
116.〔荧光指纹信息的获取〕
117.为了获取试验试样的荧光指纹信息，使用日立高新技术公司制造的f
‑
7000作为荧光指纹测量装置，通过反射法(frontface)进行了测量。
118.测量条件为激发光200nm
‑
600nm、荧光200nm
‑
700nm、分辨率2.5nm、狭缝宽度2.5nm、光电倍增管灵敏度950v。另外，若考虑分辨率为5nm，测量波长允许至少5nm左右的误差。
119.〔针对荧光指纹信息的预处理〕
120.在获取试样的荧光指纹信息时，虽然可以直接使用荧光指纹的测量值(各激发波
长的荧光光谱)，但有时根据需要，需要进行各种预处理。
121.作为从测量出的荧光指纹中去除噪声并获取有效的荧光指纹信息的预处理方法，可以采用例如非荧光成分的去除处理、散射光的去除处理、低灵敏度区域的删除处理中的一种或多种的组合。此外，也可以采用针对所获取的荧光指纹信息的中心化、规格化、标准化、基线校正、平滑化、自动定标(auto
‑
scaling)、对数转换(log10)、二次微分处理等运算处理中的一种或多种的组合作为预处理。此外，作为组合了多个运算处理时的处理顺序，可以采用例如对数转换(log10)
→
二次微分
→
规格化(normalize)
→
自动定标(autoscale)。
122.另外，作为去除对成分信息无用的波长的处理，可以采用例如以下的方法，但各处理方法本身是已知的，省略有关其详细的说明。
123.(a)变量投影重要性(variable important projection，vip)
124.(b)区间偏最小二乘法(interval pls，ipls)
125.(c)遗传算法(genetic algorithms，ga)
126.(d)刀切分析(jack
‑
knife analysis)
127.(e)前向区间偏最小二乘法(forward interval pls)
128.(f)后向区间偏最小二乘法(backward interval pls，bipls)
129.(g)协同区间偏最小二乘法(synergy interval pls，sipls)
130.(h)lasso类型方法(lasso type method)
131.预处理的适用顺序可以适宜地设定，但从处理的效率化的观点来看，优选先执行非荧光成分的去除处理、散射光的去除处理、低灵敏度区域的删除处理等处理。
132.这样的预处理中可以使用例如matlab、pls#工具箱等专用软件。
133.另外，在本方式中，仅使用自动定标作为预处理，但预处理并非限于该方法。
134.〔校准曲线的制作、验证〕
135.校准曲线具体是将所获取的荧光指纹信息设为解释变量、将四种tsnas的总量设为响应变量、并使用例如pls回归分析(以下，有时也仅称为“pls”)来制作的。
136.关于制作校准曲线时使用的pls回归分析，先对其概略进行简单地说明。
137.在pls中，解释变量x(矩阵)和响应变量y(向量)满足以下两个基本式(1)、(2)。
138.x＝tp
t
+e
ꢀꢀꢀ
(1)
139.y＝tq+f
ꢀꢀꢀꢀ
(2)
140.式中，t表示潜在变量(矩阵)，p表示载荷(loading)(矩阵)，e表示解释变量x的残差(矩阵)，q表示系数(向量)，f表示响应变量的残差(向量)，p
t
表示p的转置矩阵。
141.顺带一提，pls并非将解释变量x的信息直接用于响应变量y的模型化，而是将解释变量x的信息的一部分转换为潜在变量t，并使用潜在变量t对响应变量y进行模型化。另外，对于潜在变量的数量，例如，可以确定基于交叉验证的预测性解释方差值(predictive explanatory variance value)作为指标。此外，潜在变量有时也被称为主成分。
142.尤其在单成分模型的情况下，上述的(1)、(2)由以下的(3)、(4)表示。
143.x＝t1p
1t
+e
ꢀꢀꢀ
(3)
144.y＝t1q1+f
ꢀꢀꢀꢀ
(4)
145.式中，t1表示潜在变量(向量)，p1表示载荷(向量)，q1表示系数(标量)。
146.这里，若假设t1由x的线性组合表示，则以下的(5)成立。
147.t1＝xw1ꢀꢀꢀꢀ
(5)
148.式中，w1表示被规格化的权重向量。
149.pls求出使y与t1的协方差y
t
t1在w1的范数(norm)为1(|w1|＝1)的条件下最大化的t1，且为了计算t1，可以使用所谓的拉格朗日的未定乘数法。由于使用了拉格朗日的未定乘数的计算方法是众所周知的，因此省略计算细节，仅示出与w1、p1、q1相关的计算结果作为以下的(6)～(8)。
150.w1＝x
t
y/|x
t
y|
ꢀꢀꢀ
(6)
151.p1＝x
t
t1/t
1t
t1ꢀꢀꢀ
(7)
152.q1＝ytt1/t
1t
t1ꢀꢀꢀ
(8)
153.另外，式(7)、(8)的t1是通过将式(6)中求出的w1代入式(5)而计算出的向量。
154.对于多成分模型，也可以利用同样的方法进行计算，但由于计算方法是众所周知的，因此省略其细节。
155.为了制作校准曲线，并验证所制作的校准曲线，将试样中的四种tsnas的含量已知的多个样品分为用于制作校准曲线的校准用样品组和用于验证校准曲线并确认有效性的验证用样品组，进行准备。另外，在本例中，准备了40个样品作为校准用样品，准备了19个样品作为验证用样品。此外，通过vip进行了波长限定，限定为1000波长左右，但本发明不限于此。
156.对于校准用样品组，适用例如上述pls回归分析(例如潜在因子数为6)，制作根据所获取的荧光指纹信息估计四种tsnas的总量的校准曲线。另外，对于用于制作校准曲线的各个样品的四种tsnas的总量，通过将事先利用高效液相色谱法(hplc
‑
ms/ms)进行了定量的各个样品中的四种tsnas的含量相加而求得。
157.接着，对于验证(validation)用样品组，根据所获取的荧光指纹信息，利用所述校准曲线来估计四种tsnas的总量，并进行校准曲线的验证。
158.图7是横轴取基于高效液相色谱法(hplc
‑
ms/ms)的实测值(化学分析值)、纵轴取基于荧光指纹的四种tsnas的总量的估计值，针对属于验证用样品组中的各个样品，描绘了对应的点的曲线图。
159.在校准用样品组中，决定系数r2＝0.99(sec＝0.08μg/g)，化学分析值与校准曲线的估计值之间具有高相关，确认了良好的估计精度。此外，根据图7，对于验证用样品组中的估计精度，决定系数r2＝0.86(sep＝0.22μg/g)，确认了该校准曲线的有效性。
160.〔四种tsnas的含量未知的试样(烟草原料)中的四种tsnas的总量的估计〕
161.使用确认了有效性的校准曲线，基于四种tsnas的含量未知的试样(烟草原料)的荧光指纹信息，估计所述试样中含有的四种tsnas的总量。
162.另外，对于四种tsnas的含量未知的试样，可以省略针对所获取的荧光指纹的预处理，但也可以进行与获取校准曲线时实施的预处理相同内容的预处理。
163.〔未知试样中的四种tsnas的各自的含量的估计〕
164.基于估计出的四种tsnas的总量和各tsna的已知的存在比率，估计四种tsnas的含量。
165.顺带一提，如上述那样，由于各tsna的存在比率在同一烟草种类中基本上一定，因此在将各tsna的已知的存在比率设为a：b：c：d的情况下，通过将四种tsnas的总量分别乘以
a/(a+b+c+d)、b/(a+b+c+d)、c/(a+b+c+d)、d/(a+b+c+d)的方式计算四种tsnas的含量。
166.〔本发明的优选的一实施方式〕
167.本发明人等进行了详细的研究，结果发现，在上述那样的实施方式中的荧光指纹信息获取工序中，通过经由用于减少特定波长范围的光的强度的滤光器来测量荧光，有望进一步提高预测精度。下面，对此进行详细说明。
168.图9是表示对于含有与图6相同的tsnas试剂的标本，通过本方式获取的荧光指纹的一例的图。另外，标本是将四种tsnas试剂按照与白肋烟种大致相同的比率与乙醇溶液混合而制作的，该标本中含有的四种tsnas的总和为1.28μg/g。
169.图9中标记为“a
″”
的椭圆形框的区域(“区域a
″”
)是在标本中被确认的存在四种tsnas的荧光指纹信息的区域，是相当于图6的“区域a'”的区域。
170.此外，荧光指纹的测量条件除了经由滤光器测量荧光以外，与图6相同：激发光200nm
‑
600nm、荧光200nm
‑
700nm、分辨率2.5nm、狭缝宽度2.5nm、光电倍增管灵敏度950v。
171.所使用的滤光器具有使波长范围为400nm以上的光的强度减少的功能。换言之，所使用的滤光器具有使从样品发出的光(荧光)中的大致相当于可见光的波长范围的光以规定的减光率减光的功能。
172.图10是用于对具有这种功能的滤光器的配置的概要进行说明的示意图。另外，滤光器不限于1片，也可以是使规定的波长范围的光透射的带通滤光器和减光滤光器的组合。此外，滤光器的波长范围和减光率可以根据试样的种类、特征而适当地设定。
173.另外，对于荧光指纹信息获取时的预处理、使用了所获取的荧光指纹信息的校准曲线的制作、验证，采用了上述那样的方法，对省略其细节。
174.图11是横轴取基于高效液相色谱法(hplc
‑
ms/ms)的实测值(化学分析值)、纵轴取基于通过本方式获取的荧光指纹的四种tsnas的总量的估计值，针对属于验证用样品组中的各个样品描绘了对应的点的曲线图。另外，关于图11的曲线图，校准用样品组和验证用样品组使用了与获取了图7的结果的情况相同的曲线图，校准曲线也与图7同样地适用pls回归分析(潜在因子数为3)来制作。
175.根据图11，对于验证用样品组中的估计精度而言，决定系数r2＝0.92(sep＝0.19μg/g)，化学分析值与基于校准曲线的估计值之间具有高相关，实现了良好的估计精度。
176.将图11与图7进行对比，可以期待通过本方式进一步提高估计精度，本方式可进一步适用于试样中含有的四种tsnas的总量的估计。
177.另外，对于基于估计出的四种tsnas的总量和各tsna的已知的存在比率的四种tsnas的含量的估计，采用与上述相同的方法即可。
178.需要注意的是，本发明除了上述实施方式以外，可采用在权利要求书中记载的技术构思的范围内的各种不同的实施方式。
179.标号说明
180.100：tsnas定量装置
181.110：预处理单元
182.120：估计模型制作单元
183.130：总量估计单元
184.140：含量估计单元