本发明涉及使用蛋白质纳米孔识别分析物的方法。
背景技术：
：：生物纳米孔是市售测序仪的核心组成部分[1]，能够从dna和许多其他生物大分子(包括rna[6]、肽[7]和蛋白质[8])解码出大量信息，包括长度[2]、序列[3,4]、碱基修饰[5]。这种卓越的传感性能源于其作为离子通道的生物学作用[9]。由于这是离子穿过膜的唯一途径，因此生物纳米孔可以解析单个离子在孔限制内的化学结合[10]，表明其精密度远高于固态纳米孔[11]。由bayley等人开创，自1997年[10]以来，基于纳米孔的单离子(诸如co2+、ag+或cd2+)直接传感通过在工程化的α-溶血素(α-hl)突变体中设计的离子-氨基酸配位[10,12,13]或离子-螯合剂相互作用[14]实现。但是，不同特性的单个单原子离子对α-hl的阻断表现出一致的浅电阻脉冲(～2-3pa)，这是由于圆柱孔的几何形状和分析物离子的小尺寸所致[10,12,13]。另外，金属离子的间接传感可以通过分子接头如dna[15]、肽[16]或环糊精[17]进行，但信号特异性降低且系统复杂性增加。氯金酸(haucl4)是一种公知的金化合物[18]，作为前体广泛用于制造金纳米材料[18]。在缓冲水溶液中，解离的四氯金(iii)酸盐离子([aucl4]-)是方形平面的多原子离子，净电荷为-1，其中au-cl键的长度测量值为先前的报道表明四氯金(iii)酸盐离子是强效水通道蛋白抑制剂[21]，但单分子水平的研究尚未见报道。技术实现要素：本发明的一方面提供了嵌入金属的蛋白质纳米孔在识别样品中的分析物中的用途。在一些实施方式中，所述嵌入金属的蛋白质纳米孔是嵌入一个或更多个含金属的离子的蛋白质纳米孔。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子结合至纳米孔的内表面上的蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，在纳米孔的内表面上结合至蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合的一个或更多个含金属的离子的数量为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是α-hl或mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，所述分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子或核酸。在一些实施方式中，所述分析物是氨基酸或肽；优选地，所述氨基酸或肽包含硫。在一些实施方式中，所述氨基酸在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子或包含硫醇基；更优选地，所述氨基酸是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述肽包含在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子的氨基酸或包含硫醇基的氨基酸；更优选地，所述肽包含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述分析物是硫醇；优选地，所述分析物是生物硫醇；更优选地，所述生物硫醇是l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和/或l-谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述核酸是ssdna、dsdna、rna或其组合。本发明的另一方面提供了识别样品中的分析物的方法，所述方法包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的蛋白质纳米孔，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品，其中所述纳米孔嵌入有一个或更多个含金属的离子；施加穿过纳米孔的电场，并且使分析物移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中的分析物。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子结合至纳米孔的内表面上的蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，在纳米孔的内表面上结合至蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合的一个或更多个含金属的离子的数量为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是α-hl或mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，所述分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子或核酸。在一些实施方式中，所述分析物是氨基酸或肽；优选地，所述氨基酸或肽包含硫。在一些实施方式中，所述氨基酸在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子或包含硫醇基；更优选地，所述氨基酸是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述肽包含在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子的氨基酸或包含硫醇基的氨基酸；更优选地，所述肽包含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述分析物是硫醇；优选地，所述分析物是生物硫醇；更优选地，所述生物硫醇是l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和/或l-谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述核酸是ssdna、dsdna、rna或其组合。在一些实施方式中，所述方法包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的蛋白质纳米孔，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品和含金属的离子；施加穿过纳米孔的电场，并且使含金属的离子和分析物移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中的分析物。在另一实施方式中，所述方法包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的蛋白质纳米孔，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括含金属的离子；施加穿过纳米孔的电场，并且使含金属的离子移位通过纳米孔；将样品加入起初包括含金属的离子的导电液体介质中，并且使分析物移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中的分析物。在一些实施方式中，所述含金属的离子是选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组中的一个或更多个。在一些实施方式中，所述含金属的离子是选自由[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+离子组成的组中的一个或更多个。在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是α-hl或mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，所述分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子或核酸。在一些实施方式中，所述分析物是氨基酸或肽；优选地，所述氨基酸或肽包含硫。在一些实施方式中，所述氨基酸在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子或包含硫醇基；更优选地，所述氨基酸是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述肽包含在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子的氨基酸或包含硫醇基的氨基酸；更优选地，所述肽包含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述分析物是硫醇；优选地，所述分析物是生物硫醇；更优选地，所述生物硫醇是l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和/或l-谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述核酸是ssdna、dsdna、rna或其组合。本发明的另一方面提供了识别样品中的分析物的系统，所述系统包含蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品，其中所述纳米孔嵌入有一个或更多个含金属的离子。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子结合至纳米孔的内表面上的蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，在纳米孔的内表面上结合至蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合的一个或更多个含金属的离子的数量为1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是α-hl或mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，所述分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子或核酸。在一些实施方式中，所述分析物是氨基酸或肽；优选地，所述氨基酸或肽包含硫。在一些实施方式中，所述氨基酸在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子或包含硫醇基；更优选地，所述氨基酸是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述肽包含在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子的氨基酸或包含硫醇基的氨基酸；更优选地，所述肽包含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述分析物是硫醇；优选地，所述分析物是生物硫醇；更优选地，所述生物硫醇是l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和/或l-谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述核酸是ssdna、dsdna、rna或其组合。在一些实施方式中，所述系统包含蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品和含金属的离子。在另一实施方式中，所述系统包含蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括含金属的离子。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，所述一个或更多个含金属的离子选自由[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+离子组成的组。在一些实施方式中，所述蛋白质纳米孔是α-hl或mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，所述分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子或核酸。在一些实施方式中，所述分析物是氨基酸或肽；优选地，所述氨基酸或肽包含硫。在一些实施方式中，所述氨基酸在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子或包含硫醇基；更优选地，所述氨基酸是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述肽包含在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子的氨基酸或包含硫醇基的氨基酸；更优选地，所述肽包含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述分析物是硫醇；优选地，所述分析物是生物硫醇；更优选地，所述生物硫醇是l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和/或l-谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述核酸是ssdna、dsdna、rna或其组合。本发明的另一方面提供了识别分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：(1)含金属的化合物；和(2)可以形成纳米孔的蛋白质或可以表达可以形成纳米孔的蛋白质的核酸、表达载体或重组宿主细胞；所述含金属的化合物能够在溶液中形成含金属的离子。在一些实施方式中，所述含金属的化合物包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+。在一些实施方式中，所述含金属的化合物能够在溶液中形成[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+离子。在一些实施方式中，所述含金属的化合物是氯金酸或四氯金(iii)酸盐。在一些实施方式中，所述蛋白质是α-hl或mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性，并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，所述分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子或核酸。在一些实施方式中，所述分析物是氨基酸或肽；优选地，所述氨基酸或肽包含硫。在一些实施方式中，所述氨基酸在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子或包含硫醇基；更优选地，所述氨基酸是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述肽包含在氨基酸侧链上包含一个或更多个硫原子的氨基酸或包含硫醇基的氨基酸；更优选地，所述肽包含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸或l-高半胱氨酸。在一些实施方式中，所述分析物是硫醇；优选地，所述分析物是生物硫醇；更优选地，所述生物硫醇是l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和/或l-谷胱甘肽。在一些实施方式中，所述核酸是ssdna、dsdna、rna或其组合本发明的另一方面提供了mspa在识别样品中含金属的离子中的用途。在一些实施方式中，所述含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。本发明的另一方面提供了识别样品中含金属的离子的方法，所述方法包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的mspa，其中所述mspa包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品；施加穿过mspa的电场，并且使含金属的离子移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中含金属的离子。在一些实施方式中，所述含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。本发明的另一方面提供了识别样品中含金属的离子的系统，所述系统包含mspa，所述mspa位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述mspa包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品。在一些实施方式中，所述含金属的离子选自由包含au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+的离子组成的组。在一些实施方式中，mspa是突变八聚体mspa，所述突变八聚体mspa包括至少一个突变mspa单体，所述突变八聚体mspa在正电压下不具有自发门控活性并且在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合。在一些实施方式中，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第83-111位的一个或更多个突变；优选地，第83-111位的一个或更多个突变可以是第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括第88、91和/或105位的突变；更优选地，所述突变是突变为蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d91m、d91h或d91c突变；更优选地，与野生型mspa单体相比，至少一个突变mspa单体包括d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。附图说明图1显示了wtα-hl纳米孔内的[aucl4]-结合。(a)七聚体wtα-hl及其对[aucl4]-离子的传感机理。每个七聚体wtα-hl纳米孔在第113位具有七个相同的蛋氨酸残基(结构图中为黄色)。在单个[aucl4]-与七个蛋氨酸(m113)残基中的任何一个之间发生可逆配位相互作用。(b)使用wtα-hl进行[aucl4]-传感的具有全点直方图的代表性迹线。在1.5mkcl缓冲液中在+100mv进行电生理记录，其中cis侧含有终浓度为5μm的haucl4(方法)。单个[aucl4]-产生的连续孔阻断被清楚解析，其具有一致的阻断幅度(δi≈6pa)。(c)使用wtα-hl进行[aucl4]-传感的具有全点直方图的代表性迹线。在1.5mkcl缓冲液中在+100mv进行电生理记录，其中cis侧含有终浓度为15μm的haucl4(方法)。在该浓度下，观察到相同wtα-hl中多个[aucl4]-离子的顺序结合。此处，m-(aucl4-)n代表当前在孔中具有n个[aucl4]-。从未观察到m-(aucl4-)n和m-(aucl4-)n±2之间的直接转变。(d)由wtα-hl中[aucl4]-结合的10min记录生成的事件直方图，其中cis侧含有15μmhaucl4并施加+100mv电位。对不同数量[aucl4]-离子的结合事件进行gaussian拟合，并标记为m-aucl4-、m-(aucl4-)2和m-(aucl4-)3(m-aucl4-:6.28±1.03pa,n＝179；m-(aucl4-)2:12.21±0.99pa,n＝75；m-(aucl4-)3:18.88±0.99pa,n＝12)。图2显示了α-hlwt纳米孔内的多个[aucl4]-结合事件。(a-c)所有电生理记录均在1.5mkcl缓冲液中在+100mv进行，其中cis侧含有终浓度为5-15μm的haucl4(方法)。(d-f)不同haucl4浓度(1μm、10μm和15μm)的δivs.停留时间的散点图。所有散点图的数据均来自每个条件下的10min连续电生理记录。在f中清楚地观察到了阻断幅度的广泛分散。图3显示了七聚体α-hlm113g的纯化和表征。单体α-hlm113g经大肠杆菌bl21(de3)表达并通过镍亲和色谱法纯化(方法)。[51]细胞裂解后自发形成七聚体α-hlm113g。根据α-hlm113g单体与七聚体在镍柱上的结合亲和力的差异，可以分离单体和七聚体α-hlm113g。(a)细胞裂解液上清液在梯度洗脱(0mm至300mm咪唑)中的uv吸收光谱。在相应的凝胶电泳中确定洗脱样品的特性。(b)用7.5％sds-聚丙烯酰胺凝胶对洗脱的蛋白进行凝胶电泳。泳道：m，precisionplus蛋白质标准品(bio-rad)；1-5，(a)中相应的洗脱级分。基于先前发表的关于α-hlwt的结果，第2泳道被确认为α-hlm113g单体，第3、4、5泳道分别被确认为α-hlm113g七聚体。纯化的α-hlm113g七聚体可以直接用于电生理测量，也可以在-80℃下长期保存。(c)七聚体α-hlwt和α-hlm113g的iv曲线。使用1.5mkcl缓冲液(1.5mkcl,10mmtris-hcl,ph＝7.0)收集两条iv曲线。系统观察到α-hlwt和m113g之间的iv曲线略有变化，而m113g突变体的总体电导仍存在。图4显示了在有或没有haucl4的情况下，α-hlm113g的背景电流。在cis侧含有或不含有haucl4的情况下，在1.5mkcl缓冲液中在+100mv记录背景电流(方法)。(a)在没有haucl4的情况下，使用α-hlm113g记录的背景电流。在+100mvα-hlm113g保持开放状态，无自发门控，这表明突变后形成了未改变的七聚体孔装配物。(b)使用α-hlm113g并在cis侧的haucl4终浓度达到50μm的条件下记录的背景电流。在+100mv下的连续记录显示，由于m113g突变，根本未发生[aucl4]-离子结合事件，其中引入的甘氨酸的侧基与四氯金(iii)酸盐没有任何可检测的相互作用。这种现象证实了在wtα-hl中观察到的四氯金(iii)酸盐传感源自au(iii)和蛋氨酸113之间的配位相互作用。图5显示了在有或没有haucl4的情况下，m2mspa的背景电流。在cis侧含有或不含有haucl4的情况下，在1.5mkcl缓冲液中在+100mv记录背景电流(方法)。(a)在没有haucl4的情况下，使用m2mspa记录的背景电流。在+100mvm2mspa保持开放状态，无自发门控。(b)使用m2mspa并在cis侧的haucl4终浓度达到50μm的条件下记录的背景电流。在+100mv下连续记录显示，由于在孔限制区域附近缺少含硫的氨基酸残基(蛋氨酸或半胱氨酸)，因此m2mspa未发生[aucl4]-结合事件。因此，无[aucl4]-结合的m2mspa可以作为理想的孔模板引入蛋氨酸。图6显示了[aucl4]-与蛋氨酸(d91m)在工程化的mspa纳米孔(mspa-m)中的可逆顺序结合。(a)mspa(pdbid:1uun)[22]的结构及其对[aucl4]-离子的传感机制。根据公开的方法[20]，进行孔工程化(d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k)，除了用于[aucl4]-传感的d91m。突变体mspa(mspa-m)在第91位具有八个相同的蛋氨酸残基，并且能够同时结合多个[aucl4]-离子。(b,c)在+100mv以及cis侧分别含有1μm和10μmhaucl4的条件下，使用mspa-m下进行[aucl4]-传感的带有全点直方图的代表性迹线。当在cis侧含有1μmhaucl4时(b)，大多数结合事件来自单个[aucl4]-离子，而在cis侧含有10μmhaucl4时(c)，来自多个[aucl4]-的顺序结合事件占主导。m-(aucl4-)n代表在孔中同时具有n个[aucl4]-离子。(d)在cis侧含有10μmhaucl4的条件下，使用mspa-m结合[aucl4]-的5min记录的事件直方图。对不同数量[aucl4]-的结合事件进行gaussian拟合，并分别标记为m-aucl4-、m-(aucl4-)2和m-(aucl4-)3。(m-aucl4-):11.31±0.20pa,n＝280；m-(aucl4-)2:23.95±0.29pa,n＝94；m-(aucl4-)3:40.09±0.16pa,n＝13)。(e)单个[aucl4]-结合事件的平均事件间间隔(τon)的倒数和平均停留时间(τoff)的倒数与cis侧[aucl4]-离子浓度的关系的图。在1μm下观察到事件检测率突然增加。cis侧haucl4浓度的进一步增加导致来自多个[aucl4]-的更多顺序结合(图8)。τon、τoff的平均值±标准差来自三个独立实验(n＝3)，每个条件记录10min。图7显示了八聚体mspa-m的纯化和表征。单体mspa-m经大肠杆菌bl21(de3)表达并通过镍亲和色谱法纯化(方法)。[51]八聚体mspa-m在细胞裂解后立即自组装。可以基于单体和八聚体mspa-m与镍柱的不同结合亲和力对其进行分离。(a)细胞裂解液上清液在梯度洗脱(0mm至300mm咪唑)中的uv吸收光谱。在相应的凝胶电泳中确定洗脱样品的特性。出现在洗脱体积16至20ml之间的一个明显峰，来自细胞裂解过程中的非特异性蛋白质。虽然几乎注意不到，但标记为1-4的区域表示基于先前的m2mspa纯化经验，八聚体mspa-m有望被洗脱。[51](b)在7.5％sds-聚丙烯酰胺凝胶上进行不同洗脱级分的凝胶电泳。泳道：m，precisionplus蛋白质标准品(bio-rad)；1-4，(a)中相应的洗脱级分。尽管几乎不可见，但通过以m2mspa为标记，可以确认泳道1-3包含八聚体mspa-m。纯化的八聚体mspa-m可直接用于电生理学测量，或在-80℃下可长期保存。图像插图经过对比度调整，因此可以看到条带。(c)m2mspa和mspa-m纳米孔的iv曲线。在1.5mkcl缓冲液(1.5mkcl，10mmtris-hcl，ph＝7.0)中收集两条iv曲线。系统观察到m2mspa和mspa-m之间的iv曲线略有变化，而mspa-m的总体电导保持不变，没有明显的门控，表明成功构建了突变的孔。图8显示了mspa-m中多个[aucl4]-离子的结合。在相同mspa-m纳米孔内由多个[aucl4]-离子产生的顺序的且可逆的阻断显示了相似的阻断间隔。从未观察到m-(aucl4-)n和m-(aucl4-)n±2之间的直接转变。此处，m-(aucl4-)0表示开放孔的水平i0。使用+100mv，在1.5mkcl缓冲液中进行电生理记录。图9显示了停留时间分析。如果没有另外说明，则本发明中的所有平均停留时间均根据该定义得出。(a)四氯金(iii)酸盐结合的实时迹线实例。τon表示事件间持续时间。(b)单次指数拟合的事件间持续时间(τon)的直方图。黑线是根据等式y＝y0+a*exp(-x/τ)的指数拟合，平均事件间间隔(τon)由拟合参数τ得出。图10显示了mspa-m纳米孔内的[aucl4]-结合动力学。(a-c)不同haucl4浓度(1μm、5μm和10μm)的代表性电流记录。(d-f)不同haucl4浓度的相应阻断事件直方图。(g-i)不同haucl4浓度的平均事件间间隔(τon)的直方图。所有统计数据(d-i)均来自在每个条件下以280s进行的连续电生理记录。(j)平均事件间间隔(τon)的倒数相对于haucl4离子浓度的图。随haucl4浓度的增加，1/τon值的增加证实了该事件是由四氯金(iii)酸盐结合引起的，其中较高的haucl4浓度导致分析物结合更频繁。(k)在10μmhaucl4离子存在下，m-aucl4-、m-(aucl4-)2和m-(aucl4-)3的对数停留时间直方图。停留时间的平均值和标准差分别为295.81±276.44ms，120.82±117.39ms，52.72±41.79ms。m-(aucl4-)3的平均停留时间大大减少，表示孔同时容纳3个四氯金(iii)酸盐的可能性很小。图11显示了wtα-hl和mspa-m之间用于单个[aucl4]-传感的比较。(a)wtα-hl(红色，蘑菇形)和mspa-m(蓝色，圆锥形)之间的几何比较。黄色圆点(中间的四个圆点)指示蛋氨酸在孔上的位置。(b)在+100mv的条件下，wtα-hl或mspa-m纳米孔内单个[aucl4]-的代表性结合事件。(c)对wtα-hl(红色，左图)或mspa-m(蓝色，右图)纳米孔内单个[aucl4]-结合进行gaussian拟合的事件幅度(δi)直方图。mspa-m表现出更深的阻断深度和更窄的分布宽度(wtα-hl:5.63±0.33pa；mspa-m:11.25±0.19pa)，其[aucl4]-传感性能显著改善。(d)wtα-hl(红色，较深)和mspa-m(蓝色，较浅)的单个[aucl4]-结合的对数停留时间直方图。mspa-m内单个[aucl4]-结合显示出系统性的事件停留时间减少，这可能是由于锥形mspa孔具有更狭窄的限制(wtα-hl:12.30±19.23s；mspa-m:0.40±0.36s)。(c)和(d)中的统计数据取自于在100mv和cis侧含有1μmhaucl4的条件下的10min连续电生理学记录。(e-g)在+20mv(e)、+100mv(f)和+180mv(g)和cis侧含有1μmhaucl4的条件下，mspa-m中的[aucl4]-离子结合的代表性迹线。通过clampfit用200hz低通bessel滤波器(八极)对所有迹线(e-g)进行数字滤波，以便可以显示(e)中的浅结合事件。(h)在不同电压下，mspa-m和wtα-hl中[aucl4]-离子的平均阻断深度图(补充表s5)。统计数据来自三个独立的实验(n＝3)，每个条件下wtα-hl记录15min，mspa-m记录5min。与mspa-m相比，wtα-hl需要更长的采集时间来补偿减少的事件计数。图12显示了在wtα-hl中具有波动的[aucl4]-结合。(a-c)在+60mv(a)、+100mv(b)和+180mv(c)施加电位下以及在cis侧含有15μmhaucl4的条件下，在1.5mkcl中的wtα-hl中[aucl4]-结合的代表性迹线。通过clampfit用200hz低通bessel滤波器(八极)对所有记录的迹线(a-c)(方法)进行数字滤波，以便可以显示(a)中的浅结合事件以及(b)和(c)中的基线波动。当施加高电位(>+100mv)时，在[aucl4]-传感中使用wtα-hl在所有电生理记录中系统地观察到基线波动。我们得出结论，[aucl4]-在α-hl的长的圆柱状限制内的潜在非特异性结合应导致该现象。图13显示了mspa-m中[aucl4]-结合事件的代表性迹线。(a)在+100mv在mspa-m中10μmhaucl4结合的代表性迹线。(b)在放大时间标尺下显示的来自迹线(a)的带有编号的阻断。为了更好地比较m-aucl4-、m-(aucl4-)2和m-(aucl4-)3之间的阻断深度，已对基线进行偏移补偿。(c)m-aucl4-、m-(aucl4-)2和m-(aucl4-)3的平均阻断深度图。这三个水平的阻断之间的间距大致相等。(d)峰幅度差异的直方图规律δi3＞δi2＞δi1被系统性地观察到，这来自于进一步缩窄的孔限制伴随的信号放大。(c)和(d)中的统计结果(平均值±标准差)来自三个独立的实验(n＝3)，每个条件下使用mspa-m记录10min。(表5)图14显示了有限元法(fem)模拟。用fem模拟进行半定量研究，以展示如何通过具有更窄限制的圆锥形孔来放大电场强度。fem模拟使用类似于报告的comsol5.3a进行。[51,52]使用nernstplanckpoisson模型进行模拟。模型几何形状是轴对称的，以简化计算。在充满1.5mkcl缓冲液的cis和trans室之间构建10nm厚的膜。构建穿过该膜的圆锥形几何形状，该几何形状的较大端直径为6nm，在限制处直径为2nm。构建厚度为0.2nm且具有可变宽度(0.2-0.8nm)的环状阻断物，以缩窄孔的限制。计算电场强度的z分量并在模型中进行展示。(a)孔几何形状内的z分量电场强度具有宽的剩余限制尺寸(直径为1.6nm)。电场强度分布广泛。(b)孔几何形状内的z分量电场强度具有窄的剩余限制尺寸(直径为0.4nm)。电场强度在孔限制部位周围呈尖锐分布。(c)具有不同孔限制尺寸的z分量电场强度。显然，电场强度显示出较窄孔限制而呈现出较尖锐的分布。(d)具有不同孔限制尺寸时的沿z轴的电位。图15显示了通过[aucl4]-嵌入的mspa-m的增强poly(da)10移位。(a)具有收缩限制的锥形纳米孔内电场的有限元模拟。左图：在宽的孔限制(直径1.6nm)内的模拟电场。右图：在窄的孔限制(直径0.4nm)内的模拟电场。(图14)(b)poly(da)10移位通过[aucl4]-嵌入的mspa-m纳米孔。在cis侧加入8μmpoly(da)10和10μmhaucl4，在+100mv记录电流迹线。mspa纳米孔中的顺序[aucl4]-结合逐渐缩小孔腔，以增强dna传感。水平n(n＝0-3)表示当前在mspa-m收缩中嵌入n个[aucl4]-离子。从水平1到水平3可以观察到poly(da)10具有提高的移位率和阻断幅度。(c)最上面一行显示了不同水平n下poly(da)10传感的放大视图(200ms)。最下面一行了不同编号的水平下绝对阻断深度与停留时间的散点图。统计中每个水平有1500个事件。(d)对编号的水平进行单指数拟合的平均事件间间隔(τon)的直方图。同样，每个水平均计数1500个事件。水平3降低的τon表示[aucl4]-嵌入的mspa纳米孔的移位率提高。(e-g)平均δi/i0，停留时间以及每个编号的水平的平均事件间间隔(τon)的倒数。所有平均值和标准差均来自三个独立的实验(记录10min，n＝3，表7)。图16显示了使用嵌入au的mspa-m进行的78ntssdna传感。(a)78-ntssdna(表6)移位通过嵌入[aucl4]-的mspa-m纳米孔的代表性迹线。使用cis侧的4μm78-ntssdna和10μmhaucl4在+100mv记录电流迹线。mspa纳米孔内的顺序且可逆的[aucl4]-结合精细地调节用于ssdna移位的孔腔。水平n(n＝0-3)表示孔限制部位中同时嵌入n个[aucl4]-离子。从具有较大n值的水平n观察到ssdna移位的增大的阻断幅度和延迟的停留时间。(b)绝对阻断深度相对停留时间的散点图以及不同编号的水平的相应电流下降幅度直方图。(c,d)不同水平n的ssdna移位事件的平均δi/i0和停留时间。所有平均值和标准差均来自三个独立的实验(记录10min，n＝3，表8)。d中的图像插图显示了水平0-2的放大图。图17显示了加入l-蛋氨酸的m2mspa的背景电流。(a)m2mspa的动画方案。黄色的第91位代表天冬酰胺的位置。(b)电生理记录，其中使用m2mspa并且l-蛋氨酸在cis侧达到1mm的终浓度。在这种配置下根本未观察到直接传感信号，因为在分析物和孔之间不能形成相互作用。(c)电生理学记录，其中使用m2mspa，并向(b)进一步加入haucl4，达到10μm的终浓度。在(b)和(c)中未观察到l-蛋氨酸事件的特异性识别，这是由于在限制位点附近缺乏含硫的残基。以上电生理记录在1.5mkcl缓冲液中施加+100mv电位进行(方法)。图18显示了单个au(iii)嵌入的mspa-m中l-蛋氨酸的特异性识别。(a)l-蛋氨酸与[aucl4]-嵌入的mspa-m的可逆顺序结合。在cis侧加入80μml-蛋氨酸和4μmhaucl4，在+100mv记录电流迹线。达到状态3的深度阻断对应于l-蛋氨酸结合。观察到四种具有相同幅度的信号(i-iv)。(b)从(a)中的迹线中提取的四种类型的l-蛋氨酸阻断事件。每个事件均可以分解为状态1、2和3的各种组合。(c)l-蛋氨酸与蛋氨酸残基91结合的分子模型。状态3表示以au(iii)作为原子桥与孔限制部位结合的l-蛋氨酸的分子构型。(d)δi1-3相对于停留时间的散点图及相应的幅度直方图。δi1-3代表i0与[m]-(aucl4-)-m之间的幅度差异。(表9)。图19显示了使用mspa-m进行l-蛋氨酸传感的详细解释。(a)mspa-m中[aucl4]-传感的机制。(b)当预混合在一起时，l-蛋氨酸和[aucl4]-可自发形成复合物。(c)当嵌入au(iii)作为原子桥时，mspa-m可以自由结合移位的l-蛋氨酸。(d)如(b)所示的自发形成的分子复合物可与孔上的蛋氨酸相互作用。c和d中所示的任何一种反应都会导致图18c中的状态3。为简单起见，[m]代表在mspa-m中引入的蛋氨酸残基，m代表自由移位的l-蛋氨酸，[au]代表离解的四氯金(iii)酸盐离子。图20显示了l-蛋氨酸结合事件的放大图。当与au(iii)原子桥接时，mspa-m中的l-蛋氨酸结合导致深度阻断，在任一类型的结合事件中电流均从i0下降～48pa(图18b)。与开放孔的水平或四氯金(iii)酸盐的结合水平不同，l-蛋氨酸的结合水平系统地显示出剧烈的基线波动，并带有三角形的噪声。怀疑当与mspa-m结合时，可能已观察到l-蛋氨酸的潜在构型转换。这种波动形状可以被用作l-蛋氨酸识别的信号特性。可以在单独的研究中进一步研究此现象。图21显示了l-天冬酰胺和l-甘氨酸的记录，其中使用mspa-m。(a)使用1.5mkcl中的mspa-m，在施加+100mv电位以及cis侧含有10μmhaucl4的条件下记录的代表性电流迹线。n＝1-3的m-(aucl4-)n结合水平被清楚地识别出(图8)。(b)如(a)所示的电生理学记录，其中进一步向cis侧中加入l-天冬酰胺至终浓度为1mm。(c)如(a)中所示的电生理学记录，其中进一步向cis侧加入l-甘氨酸达到1mm终浓度。如(b)和(c)所示，在m2mspa中未观察到l-天冬酰胺和l-甘氨酸的额外传感信号。由使用l-天冬酰胺和l-甘氨酸所证实的负传感结果推断，l-蛋氨酸的含硫侧基是与au(iii)桥原子的关键结合部位。这种现象可以通过先前用α-hlm113g和m2mspa进行负四氯金(iii)酸盐传感的展示得到双重证实，其中孔限制部位上的氨基酸残基分别为甘氨酸和天冬酰胺。图22显示了在工程化的mspa纳米孔中嵌入不同类型的金属离子。(a)用于金原子嵌入的mspa的n91m突变。n代表天冬酰胺，m代表蛋氨酸。左图：mspa纳米孔(mspa-m)的n91m突变体的俯视图。中图：蛋氨酸与aucl4-离子在孔收缩部位上的结合机理。aucl4-是金原子的多原子形式。右图：代表性迹线，包含对单个和多个aucl4-离子的电流阻断。此处，[m]-(aucl4-)n代表不同结合水平，其中脚注n代表同时在孔限制部位中的aucl4-离子数量。(b)用于(zn2+、cd2+、co2+、ni2+、pb2+)嵌入的mspa的n91h突变。左图：mspa纳米孔(mspa-h)的n91h突变体的俯视图。n代表天冬酰胺，h代表组氨酸。中图：组氨酸与所列离子的结合机理。右图：代表性电流迹线，分别包含单个zn2+、cd2+、co2+、ni2+、pb2+离子结合的阻断事件。(c)用于(zn2+、cd2+、pb2+)嵌入的mspa的n91c突变体。n代表天冬酰胺，c代表半胱氨酸。左图：mspa纳米孔(mspa-c)的n91c突变体的俯视图。中图：半胱氨酸与所列金属离子的结合机理。右图：分别代表结合zn2+、cd2+、pb2+离子的代表性电流阻断事件。n91m、n91h或n91c的突变是相对于m2mspa。图23显示了用于在不同位置嵌入aucl4-的工程化的mspa纳米孔。(a)定点诱变位置的示意图。第88、91或105位的氨基酸突变为蛋氨酸。右侧的插图代表纳米孔收缩部位附近的单体肽链的一条链中的突变位置。(b)在第91位嵌入aucl4-的代表性电流阻断。(c)在第88位嵌入aucl4-的代表性电流阻断。(d)在第105位嵌入aucl4-的代表性电流阻断。原则上，mspa纳米孔内的每个氨基酸可经工程化以嵌入金属。由于mspa纳米孔的圆锥形几何形状，形成孔收缩部位的位点83至位点111是优选的工程化位点。图24显示了mspa-m和生物硫醇。连续施加+100mv电压时，使用mspa-m记录背景电流(方法)。对于这组测量，未在cis侧加入haucl4。(a)使用mspa-m记录的背景电流，未加入任何生物硫醇。在该条件下，mspa-m保持开放状态，无任何自发门控活动。(b-d)使用mspa-m并在trans侧含有40μmcys(b)、40μmhcy(c)或40μmgsh(d)的条件下记录的背景电流。未观察到cys、hcy或gsh结合事件。在没有au(iii)嵌入作为原子桥的情况下，无法直接使用mspa-m进行生物硫醇的单分子检测。图25显示了使用嵌入au(iii)的mspa-m进行的l-半胱氨酸的随机传感。(a)使用嵌入au(iii)的mspa-m传感生物硫醇的一般示意图。将单个mspa-m纳米孔插入分隔双层纳米孔系统的cis和trans隔室的脂质双层中(方法)。在cis侧加入haucl4，同时在trans侧加入生物硫醇(r-sh)。此处，r表示除硫醇基团以外的特定类型的生物硫醇的化学结构。(b)使用嵌入au(iii)的mspa-m传感生物硫醇的分子模型。状态0或1代表位于孔限制部位周围的蛋氨酸残基(n91m)，没有或有[aucl4]-嵌入。状态1sh表示通过嵌入的au(iii)作为原子桥而与孔限制部位结合的生物硫醇的分子构型。(c)l-半胱氨酸(cys)的化学结构。l-半胱氨酸是一种特定类型的生物硫醇。(d)cys与嵌入[aucl4]-的mspa-m的可逆顺序结合。当同时在cis侧存在4μmhaucl4和在trans侧存在40μmcys时，以+100mv的施加电压记录所示迹线。迹线中的电阻性脉冲信号来自于[aucl4]-结合或以已结合的au(iii)作为原子桥的cys结合。红色三角形标记来自cys的事件。灰星号表示[aucl4]-的事件。其他未标记的事件是背景信号，如图26所示。(e)代表cys阻断事件。从该放大展示中，代表性cys阻断事件由与b中的分子模型相关的三个状态组成。状态1sh表现为特征性抖动信号。较高的灰色标记区域或较低的粉红色标记区域分别表示状态0-1或状态1-1sh的转变分布区域。(f)[aucl4]-和cys结合事件的相对阻断幅度δi/i0相对停留时间的散点图。[aucl4]-或cys的事件幅度(δi)被定义为状态1或状态1sh相对于状态0之间的电流差异(图27)。i0是开放孔的电流，由状态0的平均值得出。(g)单个[aucl4]-结合和cys结合的δi/i0直方图。(h)从一系列cys结合事件得出的状态1sh的停留时间(toff,cys)的直方图。平均停留时间τoff,cys是从单个指数拟合结果得出。(f)、(g)和(h)中的统计数据来自连续10min的记录(方法)。(表10、11)图26显示了生物硫醇传感的信号类型。(a)使用mspa-m记录的背景电流，未加入任何分析物。尽管未观察到mspa-m的自发门控，但是在连续施加+100mv电压进行长期测量期间，仍然可以观察到瞬时孔阻断。但是，这些瞬时事件的阻断深度分布广泛。(b)连续施加+100mv电压时，使用mspa-m记录的代表性电流迹线。在cis侧置入4μmhaucl4并在trans侧置入40μmcys。[aucl4]-或cys结合事件显示了阻断幅度的窄分布，可以很容易地与背景事件区分。(c)如b中所述的测量过程中，所有可能的事件类型的放大视图。1型是代表性[aucl4]-结合事件，通过其形状和阻断幅度进行判断(图6b)。由于明显没有生物硫醇与孔结合，因此从生物硫醇传感的统计数据中排除了1型事件。2型事件是如图25e所讨论并包括在生物硫醇传感的统计数据中的代表性生物硫醇事件。3型事件也是代表性生物硫醇事件。有时可观察到[aucl4]-结合状态上方的瞬时尖峰信号。3型事件也包括在统计信息中。根据事件的形状和阻断深度判断，4型和5型事件在孔中同时包含多于1个[aucl4]-的结合(图8)。为避免使统计信息复杂化，这些事件已从统计信息中排除。6型是背景事件，如a中所观察的。6型事件已从统计信息中排除。图27显示了数据分析。除非另有说明，否则所有纳米孔事件([aucl4]-、cys、hcy或gsh)都是通过clampfit的单通道搜索特性提取的。以连续的cys传感为例，在该图中展示了提取结果(图25d)。状态0、1、1sh的平均值分别用大间隔虚线、小间隔虚线和实线标记。在图上标出了事件停留时间toff,[au]和dtoff,cys的定义。δi0-1表示i0和i1之间的幅度差异。δi1-1,cys代表i0和i1,cys之间的幅度差异。图28显示了加入cys后状态1的停留时间。(a)当在cis侧置入4μmhaucl4时，使用mspa-m的单个[aucl4]-结合的代表性迹线。灰色星号标记[aucl4]-结合的事件。(b)当在cis侧置入4μmhaucl4并在trans侧置入40μmcys时，使用mspa-m的[aucl4]-结合的代表性迹线。红色三角形标记cys的信号。而灰色星号标记[aucl4]-结合事件。其他未标记的事件是背景信号(图26)。(c)在反式加入40μmcys之前和之后，单个[aucl4]-结合的停留时间(toff)直方图。由于au(iii)与半胱氨酸的硫醇竞争性结合孔限制部位周围的蛋氨酸的硫醚，大大缩短了状态1的停留时间。(d)在trans侧加入40μmcys之前和之后，单个[aucl4]-结合的平均停留时间(τoff)的柱状图。所有平均值和标准差均来自三个独立的实验。(之前：530±90ms；之后：38±3ms)图29显示了mspa-m和除生物硫醇以外的氨基酸。当连续施加+100mv电压并在cis侧加入10μmhaucl4时，使用mspa-m进行电生理学记录。(a)未加入任何氨基酸的代表性电流迹线。如图11所示，清楚地识别出三个[aucl4]-的顺序结合。当在cis侧进一步加入l-天冬酰胺(b)、l-甘氨酸(c)、l-谷氨酸(d)至达到1mm终浓度时，记录代表性电流迹线。如b-d所示，l-天冬酰胺、l-甘氨酸和l-谷氨酸未观察到从l-半胱氨酸观察到的清楚的传感事件(图25e)。这表明硫醇基在事件的产生中至关重要，如图25e所示。图30显示了嵌入au(iii)的mspa-m对l-高半胱氨酸的随机传感。(a)l-高半胱氨酸(hcy)的化学结构，为cys的同系物，在其结构中带有额外的碳(绿色阴影标记部分)。(b)hcy与嵌入[aucl4]-的mspa-m的可逆顺序结合。当同时在cis侧存在4μmhaucl4并在trans侧存在反式40μmhcy时，施加+100mv电压记录所示迹线。迹线中的电阻性脉冲信号是由[aucl4]-结合或hcy结合(通过将结合的au(iii)作为原子桥)产生的。绿色菱形标记hcy的事件。灰色星号标记[aucl4]-的事件。其他未标记的事件是背景信号，如图26中所述。(c)代表性hcy阻断事件。与图25e相似，通过该放大展示，代表性hcy阻断事件由与图25b中的分子模型相关的三个状态组成。特征抖动信号可以识别为状态1sh。但是，hcy的状态1sh的平均阻断幅度在系统上比cys深。较高的灰色标记区域和较低的绿色标记区域分别表示状态0-1或状态1-1sh的转变分布区域。(d)[aucl4]-和hcy结合事件δi/i0_0相对停留时间的散点图。δi和i0的定义与图25f中描述的相同。(e)单个[aucl4]-结合和hcy结合的δi/i0直方图。(d)和(e)中的统计数据来自使用+100mv施加电压的连续10min记录(表12、13)。(f)使用嵌入[aucl4]-的mspa-m同时识别hcy和cys。当在cis侧存在4μmhaucl4时，以+100mv施加电压记录所示迹线。在trans侧置入cys和hcy，每种分析物的浓度为20μm。红色三角形标记cys的事件，而绿色菱形标记hcy的事件。灰色星号标记[aucl4]-的事件。虚线框中显示了hcy或cys的事件的放大视图。(g)δi/i0与停留时间的散点图以及hcy和cys传感的相应幅度直方图。(图27)图数据来自f中描述的连续10min记录。图31显示了停留时间分析。统计数据来自当在cis侧存在4μmhaucl4并在trans侧存在40μmcys、hcy或gsh时，mspa-m的电生理记录。(a)cys、hcy和gsh的代表性阻断事件。停留时间分别标记在事件上。(b)如图中不同标记的，当分别在trans侧置入40μmcys(toff,1)、hcy(toff,2)或gsh(toff,3)时，，[aucl4]-结合停留时间(τoff,1-3)的直方图。此处，toff,1-3代表状态1的停留时间(图25e)。平均停留时间(τoff,1-3)来自单指数拟合结果(图32)。(c)cys(toff,cys)、hcy(toff,hcy)或gsh(toff,gsh)的生物硫醇结合停留时间的直方图。此处，τoff,cys、τoff,hcy或toff,gsh代表状1sh的停留时间(图25e)。平均停留时间τoff从单个指数拟合结果得出(图32)。(d)[aucl4]-结合事件的平均停留时间。cis侧haucl4浓度保持在4μm。τoff、τoff,1、τoff,2或τoff,3代表未分别加入生物硫醇、cys、hcy或gsh时[aucl4]-结合状态的停留时间。含硫醇的氨基酸或肽的结合已显著缩短了[aucl4]-与孔限制部位周围的蛋氨酸结合的停留时间。对于cys，该作用最明显，其次是hcy和gsh。对于每个条件，所有平均值和标准差均来自三个独立的实验(表10、12、14)。(e)在孔中结合的cys、hcy和gsh的平均停留时间。所有平均值和标准差均来自三个独立的实验(记录10min，n＝3，表10、12、14)图32显示了停留时间和事件间间隔的分析。(a)四氯金(iii)酸盐与mspa-m纳米孔结合的代表性电生理学迹线。ton表示事件间持续时间。而toff表示事件的停留时间。(b-c)事件间持续时间(ton)和事件停留时间(toff)分别进行相应的单指数拟合的直方图。根据等式y＝a*exp(-x/τ)进行单指数拟合。平均事件间间隔(τon)或平均停留时间(τoff)分别从拟合结果中得出。如果没有另外说明，则本发明中的所有平均停留时间和事件间间隔值均按所述方法得出。图33显示了嵌入au(iii)的mspa-m对l-谷胱甘肽的随机传感。(a)l-谷胱甘肽(gsh)的化学结构。gsh是含有半胱氨酸残基的三肽(蓝色阴影标记的部分)。(b)gsh与嵌入[aucl4]-的mspa-m的可逆顺序结合。当同时在cis侧存在4μmhaucl4并在trans侧存在40μmgsh时，以+100mv施加的电压记录所示迹线。迹线中的电阻性脉冲信号代表gsh与孔的结合。蓝点标记有关gsh的事件。其他未标记的事件是背景信号，如图26中所述。(c)代表性gsh阻断事件。类似于cys或hcy的特征性抖动信号可以被识别为状态1sh。但是，gsh的状态1sh的平均阻断幅度系统性地比cys或hcy的平均阻断幅度更深。灰色和蓝色标记区域分别表示状态0-1或状态1-1sh的转变分布区域。(d)来自于[aucl4]-或gsh结合事件的δi/i0相对于停留时间的散点图以及相应的幅度直方图。δi和i0的定义与图25f中描述的相同。(d)中的统计数据来自b中所述的连续10min记录。(表14、15)(e)使用嵌入[aucl4]-的mspa-m同时识别gsh和cys。分别在trans侧置入10μm和30μm浓度的cys和gsh。而cis侧haucl4的浓度保持在4μm。在虚线框中，展示了gsh和cys事件的放大图。红色三角形标记cys的事件，蓝色点标记gsh的事件。灰星号标记来自一个或两个[aucl4]-的结合事件。(f)停留时间相对δi/i0的散点图以及相应的幅度直方图，来自对作为混合物的cys和gsh的同时记录，所述混合物分别为在trans侧的10μm和30μm的cys和gsh。统计数据来自连续10min的记录。图34显示了使用嵌入au(iii)的mspa-m区分l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和l-谷胱甘肽。(a)使用嵌入au(iii)的mspa-m纳米孔获得的cys、hcy或gsh的代表性结合事件。(b)来自cys、hcy和gsh事件的δi/i0的直方图和相应的gaussian拟合。(每个配布n＝330)(c)cys、hcy和gsh的平均δi/i0值的柱形图。(cys:0.104±0.0006,hcy:0.128±0.004,gsh:0.154±0.011)。所有平均值和标准差均来自于每种分析物的三个独立实验(连续记录10min，表11、13、15)。具体实施方式本发明证明了野生型(wt)α-hl是天然的[aucl4]-传感器，这是由于au[iii]与蛋氨酸(113)配位的结果。这种传感机制可以被移植到mspa纳米孔[22,23]，其事件幅度(eventamplitude)显著放大，高达～54.88pa。嵌入au(iii)的mspa通过具有原子精度的孔限制的几何调节继续允许ssdna(例如表6)移位。借助au(iii)嵌入，还证明了mspa对l-蛋氨酸的高度特异性识别，这可能启发基于纳米孔的蛋白质测序的新方法。据我们所知，au(iii)与生物纳米孔的单离子相互作用尚未被研究。在工程化的mspa纳米孔中结合四氯金(iii)酸盐也是单个离子报告的最大事件幅度。通过结合生物纳米孔和金的传感特征以产生“金生物纳米孔”，对这种首次出现的嵌入au(iii)种类的杂化生物孔的研究可能进一步启发新的应用。蛋白质纳米孔可用于检测单个分子。一些蛋白质可以在脂质双层膜中自组装以形成具有前庭(vestibule)和限制孔的纳米孔。纳米孔的限制孔允许单分子，诸如单离子或单链核酸分子通过。在离子盐水溶液(诸如kcl)中，当在膜上施加适当的电压时，由纳米孔通道形成的孔传导足够强且稳定的离子电流。单个分子被施加的电场驱动通过孔，从而阻断或减少了可以检测到的离子电流。阻断的持续时间和信号强度与单个分子的特性有关，诸如含金属的离子的特性或核酸的四个碱基(a、c、g和t)组成。阻断的持续时间和信号强度还可能与单个分子的特性有关，诸如任何氨基酸(如l-蛋氨酸)的特性。在本发明中，术语“纳米孔”是指在其最窄点处具有一定直径的开口的孔，在目标分子穿过该开口时，该分子的穿过可以通过信号的变化来检测，例如电信号，例如电流。在某些情况下，纳米孔由膜内的蛋白质形成，可以称为蛋白质纳米孔。蛋白质纳米孔或可以形成纳米孔的蛋白质的实例包括α-溶血素、mspa、csgg、ompg、溶细胞素a、clya、气溶素、frac或phi29连接子。蛋白质纳米孔可以被修饰或未被修饰。可以通过突变一个或更多个氨基酸来修饰蛋白质纳米孔。在一些实施方式中，蛋白质纳米孔可以在内表面上的一个或更多个氨基酸中突变。通常，蛋白质纳米孔具有前庭和收缩区。在某些情况下，纳米孔位于膜或脂质双层中。在一些实施方式中，蛋白质具有圆锥形的通道，其充当圆锥形的生物纳米孔。在本发明中，所使用的蛋白质优选地可以自发地插入膜中以形成纳米孔。本发明中使用的蛋白质纳米孔优选在正电压(高达+200mv)下不具有自发门控活性和/或优选在正的施加电压下保持开放并具有开放孔的电导。用于本发明的蛋白质纳米孔优选可以在纳米孔通道的内表面上具有一个或更多个可与金属离子相互作用的氨基酸残基。可以修饰蛋白质纳米孔以在纳米孔通道的内表面上具有一个或更多个可以与金属离子相互作用的氨基酸残基。蛋白质纳米孔的内表面上的一个或更多个氨基酸残基可以突变为可以与金属离子相互作用的氨基酸残基，诸如蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施方式中，蛋白质纳米孔可在内表面上具有蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在本发明中，术语“α-溶血素”也称为α-hl，可以选自由野生型α-溶血素、突变α-溶血素、野生型α-溶血素旁系同源物或同系溶血素、以及突变α-溶血素旁系同源物或同系溶血素组成的组。在一些实施方式中，α-溶血素可以是野生型α-溶血素。可以在本发明中使用的α-溶血素应该能够形成纳米孔。在本发明中，术语“mspa”、“mspa孔蛋白”和“mspa纳米孔”可以互换使用，是指耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白a(mspa)。如本领域技术人员已知的，mspa孔蛋白可以包括两个或更多个彼此结合并形成通道的mspa单体(例如，八个单体)，其中每个单体可以相同或不同。mspa可以是八聚体mspa。可用于本发明的mspa孔蛋白应能够形成纳米孔。形成mspa孔蛋白的任何一个mspa单体可以选自由野生型mspa单体、突变mspa单体、野生型mspa旁系同源物或同系物单体、或突变mspa旁系同源物或同系物单体组成的组。在一些实施方式中，mspa孔蛋白中的所有单体是相同的，诸如相同的突变mspa单体。在本发明中，术语“突变mspa”是指野生型mspa的突变体。野生型mspa由野生型mspa单体组成。突变mspa可以包括至少一个突变mspa单体，并且突变mspa中的其余单体可选自由野生型mspa单体、突变mspa单体、野生型mspa旁系同源物或同源单体、或突变mspa旁系同源物或同系物单体组成的组。突变mspa可以包括两种或更多个mspa单体(例如，八个单体)，并且突变mspa可以是八聚体mspa。在一些实施方式中，在突变mspa孔蛋白中，一个或更多个单体是突变mspa单体，而其他单体是野生型mspa单体。在一些实施方式中，mspa孔蛋白由八个突变体mspa-m单体组成。当mspa包括多于一个突变mspa单体时，所述多于一个突变mspa单体可以相同或不同。mspa孔蛋白可被突变以用于金属嵌入。原则上，mspa纳米孔中的每个氨基酸经工程化以进行金属嵌入。由于mspa纳米孔具有圆锥形几何形状，形成孔收缩的位点83至位点111是优选的工程化位点。因此，在位点83至位点111的任何一个或更多个残基处引入适合于金属嵌入的一个或更多个氨基酸，诸如蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸，将显著放大这些残基处的孔限制周围的结合信号。残基91是mspa的最窄点，在残基91处引入适合金属嵌入的氨基酸将导致出色的信号放大。残基88至105处的突变将与残基91产生相似的作用。在一些实施方式中，突变mspa单体可在mspa的第83-111位包括一个或更多个突变。在一些实施方式中，突变体mspa中的至少一个突变mspa单体(例如，全部八个突变mspa单体)可以在第83-111位包括一个或更多个突变。在一些实施方式中，在第83-111位的一个或更多个突变可以是在第83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110和/或111位的一个或更多个突变。在一些实施方式中，在第83-111位的一个或更多个突变可以是在第88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104和/或105位的一个或更多个突变。在一些实施方式中，在第83-111位的一个或更多个突变可以是在第88、91和/或105位的一个或更多个突变。在一些实施方式中，在位点83-111的突变可以独立地是从天然残基到适合于金属嵌入的氨基酸诸如蛋氨酸、半胱氨酸或组氨酸的突变。除了在第83-111位的一个或更多个突变外，突变mspa单体还可以在任何其他位置上包括一个或更多个突变。与野生型mspa单体相比，突变mspa单体可以仅在第83-111位具有突变。在第83-111位的一个或更多个突变可以是蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸或它们的任何组合的突变。在一些实施方式中，突变mspa单体可以是包括d91m、d91h或d91c突变的突变mspa单体。在一些实施方式中，突变mspa中的至少一个突变mspa单体(例如，全部八个突变mspa单体)可以包括d91m、d91h或d91c突变。在一些实施方式中，突变mspa单体可以是包括与野生型mspa单体相比，d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k的突变mspa-m单体。在一些实施方式中，突变mspa中的至少一个突变mspa单体(例如，所有八个突变mspa单体)可以包括与野生型mspa单体相比，d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，突变mspa单体可以是与野生型mspa单体相比，仅具有d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。在一些实施方式中，突变mspa中的至少一个突变mspa单体(例如，所有八个突变mspa单体)可以是与野生型mspa单体相比，仅具有d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k突变。d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k、d93n/d91h/d90n/d118r/d134r/e139k或d93n/d91c/d90n/d118r/d134r/e139k表示该突变体同时包括所有这六个突变。此处使用的数字标识位点诱变的位置，其中起始密码子后紧接的第一个氨基酸定义为1。野生型mspa单体的序列是本领域技术人员已知的。例如，可以在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上的genbank中找到野生型mspa单体的序列。在一些实施方式中，野生型mspa孔蛋白单体可具有以下氨基酸序列：gldnelslvdgqdrtltvqqwdtflngvfpldrnrltrewfhsgrakyivagpgadefegtlelgyqigfpwslgvginfsyttpniliddgditappfglnsvitpnlfpgvsisadlgngpgiqevatfsvdvsgaeggvavsnahgtvtgaaggvllrpfarliastgdsvttygepwnmn(seqidno:1)。在一些实施方式中，野生型mspa孔蛋白单体可以由seqidno:1组成。α-溶血素或mspa的制备方法是本领域技术人员已知的，例如，可以通过原核生物表达来制备并容易地色谱法纯化。在本发明的一方面，发明人发现，由于mspa的集聚的几何形状，mspa可以以更加放大的电阻脉冲(高达54.88pa)感知四氯金(iii)酸盐离子。因此，认为mspa纳米孔可用作良好的含金属的离子传感器。可以通过mspa纳米孔识别的离子可以是任何含金属的离子。所述含金属的离子可以包括金属离子和由金属和其他离子形成的配位离子。在一些实施方式中，可以通过mspa纳米孔识别的含金属的离子可以包含au(iii)，即三价金离子，诸如au3+。在一些实施方式中，可以通过mspa纳米孔识别的含金属的离子可以是四氯金(iii)酸盐离子。在一些实施方式中，可以通过mspa纳米孔识别的含金属的离子可以包括zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)诸如[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+。在本发明的另一方面，发明人发现嵌入四氯金(iii)酸盐的mspa纳米孔能够使[aucl4]-或ssdna移位并具有更大的阻断幅度和提高的捕获率，这是由于通道孔隙已经通过嵌入含金属的离子微调所致。因此，认为嵌入金属的蛋白质纳米孔可用于以更高的灵敏度识别分析物。在本发明中，蛋白质纳米孔可以是嵌入金属的蛋白质纳米孔。当分析物移位通过纳米孔时，蛋白质纳米孔内表面上的金属粘附会缩小纳米孔的通道并放大信号变化。所述金属可以与纳米孔通道内表面上的一个或更多个氨基酸残基(诸如蛋氨酸、半胱氨酸和/或组氨酸)相互作用。本发明中使用的金属可以是可与纳米孔通道的内表面上的任何氨基酸残基(诸如蛋氨酸、半胱氨酸和/或组氨酸)相互作用的金属。原则上，任何金属-氨基酸相互作用均可用于本发明的方法。如果金属能够与氨基酸相互作用，则包含所述金属的离子可以用于修饰在内表面上包含所述氨基酸的纳米孔，以形成本发明的嵌入金属的蛋白纳米孔。应当理解，可以使用许多含金属的离子和许多蛋白质纳米孔，并且不限于本发明中说明的实例，条件是含金属的离子能够与纳米孔的内表面上的氨基酸相互作用。已知许多金属离子能够与氨基酸基团或由几种氨基酸形成的结构相互作用，诸如过渡金属离子易于与氨基酸配位。本发明中使用的含金属的离子包括但不限于含过渡金属离子，诸如过渡金属离子。金属离子与特定基团的配位可以通过例如pearson在1963年首次提出的hsab理论来预测[64]，其原理是：“硬酸优先于硬碱配位，软酸优先于软碱配位”。hsab理论主要用于对配位结果进行定性预测或解释。金属离子与特定基团的配位也可以通过相互作用实验来证明。在本发明中，术语“与……相互作用”是指金属可以以任何方式，例如以可逆方式或以不可逆方式结合至蛋白质纳米孔的内表面上的任何氨基酸残基或由氨基酸形成的任何结构。嵌入在纳米孔的内表面上的金属可以是含金属的离子的形式，并且可以是任何合适的含金属的离子。所述含金属的离子包括金属离子和由金属和其他离子形成的配位离子。与蛋白质纳米孔的内表面上的氨基酸残基结合的含金属的离子的类型可以是一个或更多个。与蛋白质纳米孔的内表面上的氨基酸残基结合的含金属的离子的数量可以是一个或更多个，例如，1、2、3、4、5、6、7或8。发明人发现，当分析物通过纳米孔移位时，与纳米孔的内表面结合的大量含金属的离子将导致更大的孔阻断幅度和信号变化的更显著放大。许多含金属的离子可以结合至纳米孔内表面的氨基酸上，并缩窄孔限制，从而由于分析物结合的传感点周围电场的增加而放大孔的阻断幅度。在一些实施方式中，结合至纳米孔的内表面的含金属的离子可以包含au(iii)，诸如au3+。在一些实施方式中，结合至纳米孔的内表面的含金属的离子可以是四氯金(iii)酸盐离子(即[aucl4]-)。[aucl4]-离子可与纳米孔内表面的蛋氨酸和/或半胱氨酸结合。在一些实施方式中，在纳米孔的内表面上结合至蛋氨酸和/或半胱氨酸的[aucl4]-离子分子的数量为1、2、3、4、5、6、7或8。基于相似原理，在一些实施方式中，结合至纳米孔的内表面的含金属的离子可以包含或为zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)诸如[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+。zn2+、cd2+、co2+、ni2+或pb2+离子可与纳米孔内表面上的组氨酸结合。zn2+、cd2+或pb2+离子可与纳米孔内表面的半胱氨酸结合。在一些实施方式中，一个或更多个含金属的离子可以与蛋白质纳米孔的内表面上的多于一个的氨基酸残基结合以增强放大效果。因此，蛋白质纳米孔的内表面上可能具有多于一个氨基酸残基可以与含金属的离子相互作用。结合至相同位点的含金属的离子可以相同或不同。结合至不同位点的含金属的离子可以相同或不同。嵌入金属的蛋白质纳米孔和本发明的方法可用于检测单个分子分析物。在本发明中，所述分析物可能能够在电场下以单个分子通过纳米孔通道并引起通过纳米孔的电流变化。在本文的任何实施方式中，分析物可以是核苷酸、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、聚合物、药物、离子、污染物、纳米物体或生物战剂。在一些实施方式中，分析物可以是含金属的分析物，诸如含金属的离子。所述含金属的离子可以包括金属离子和由金属和其他离子形成的配位离子。在一些实施方式中，可以被嵌入金属的蛋白质纳米孔识别的含金属的离子可以包含au(iii)，诸如au3+。在一些实施方式中，可以被嵌入金属的蛋白质纳米孔识别的含金属的离子可以是四氯金(iii)酸盐离子。在一些实施方式中，可以被嵌入金属的蛋白质纳米孔识别的含金属的离子可以包含zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)诸如[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+。在一些实施方式中，分析物是聚合物，诸如蛋白质、肽或核酸。任选地，聚合物是核酸。核酸可以是ssdna、dsdna、rna或其组合。任选地，聚合物是肽或蛋白质。根据本发明，嵌入纳米孔中的金属可以是含金属的离子。待检测的分析物可以是含金属的分析物，诸如含金属的离子。嵌入纳米孔中的金属可以与待检测的金属相同或不同。例如，嵌入纳米孔中的金属和待检测的金属可以独立地选自由au(iii)、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、au(i)、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)和pb2+组成的组，例如[aucl4]-或[aucl2]-离子。当分析物是核酸(诸如ssdna)时，不同的核苷酸穿过纳米孔时可能引起不同的电流变化，从而可以对核酸进行测序。因此，嵌入金属的蛋白质纳米孔和本发明的方法可以用于核酸(诸如ssdna)测序。在一些实施方式中，ssdna可以具有任何长度，例如，长度为1个或更多个核苷酸，长度为2个或更多个核苷酸，长度为3个或更多个核苷酸，长度为4个或更多个核苷酸，长度为5个或更多个核苷酸，长度为10个或更多个核苷酸，长度为20个或更多个核苷酸，长度为30个或更多个核苷酸，长度为40个或更多个核苷酸，长度为50个或更多个核苷酸，长度为70个或更多个核苷酸，长度为100个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，ssdna是短寡核苷酸，诸如mirna、sirna或短dna探针。待检测的分析物可以是氨基酸，诸如含硫的氨基酸。氨基酸可以是天然的或非天然的。氨基酸可以包含天然碱性基团或非天然碱性基团。氨基酸可以选自构成蛋白质的20种氨基酸或其他种类的氨基酸。在一些实施方式中，待检测的分析物可以是在侧链上具有一个或更多个硫原子的氨基酸。在一些实施方式中，待检测的分析物可以是具有-sh基团的氨基酸。在一些实施方式中，待检测的分析物可以是l-蛋氨酸、l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸或任何其他氨基酸。待检测的分析物可以是肽或蛋白质。当分析物是肽或蛋白质时，不同的氨基酸通过纳米孔时可能引起不同的电流变化，从而可以对肽或蛋白质进行测序。因此，嵌入金属的蛋白质纳米孔和本发明的方法可以用于肽或蛋白质测序。在一些实施方式中，待检测的分析物可以是含硫的肽或蛋白质。在一些实施方式中，待检测的分析物可以是肽或蛋白质，其包含在侧链上具有一个或更多个硫原子的氨基酸或具有-sh基团的氨基酸。待检测的分析物可以是含l-蛋氨酸、l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸或任何其他氨基酸的肽或蛋白质。基于au(iii)-硫醇之间的强相互作用，待检测的分析物可能是硫醇。术语“硫醇”是指包括一个或更多个末端-sh基团的任何分子。在一些实施方式中，分析物可以是生物硫醇，其是在生物系统中通常发现的任何硫醇。生物硫醇的实例包括含巯基(-sh)的氨基酸或肽，例如半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽等；几种类型的抗氧化剂(诸如n-乙酰半胱氨酸)和多种类型的维生素(诸如硫胺素)。在一些实施方式中，待检测的分析物可以是含生物硫醇或硫醇的肽或蛋白质。本发明的方法、系统和试剂盒可用于区分不同的分析物，诸如不同的ssdna、不同的生物硫醇或含不同生物硫醇或硫醇的肽等。在本发明中，术语“识别”包括检测或分析分析物的类型或组成。例如，嵌入金属的蛋白质纳米孔和本发明的方法可用于检测含金属的分析物或分析核酸(a、c、g和t)的核苷酸组成。同样，嵌入金属的蛋白质纳米孔和本发明的方法可以用于检测氨基酸的类型或分析肽或蛋白质的氨基酸组成(每种氨基酸)。本发明还提供了使用蛋白质纳米孔识别样品中分析物的系统和方法。当蛋白质纳米孔是mspa纳米孔并且分析物是含金属的离子时，提供了使用mspa纳米孔识别样品中含金属的离子的系统和方法。当蛋白质纳米孔嵌入有金属并且分析物是本文讨论的任何分析物时，使用嵌入金属的蛋白质纳米孔来识别样品中分析物的系统和方法。使用蛋白质纳米孔识别分析物的方法是本领域技术人员已知的，其可用于本发明中。当前已知和常用的方法包括将包含蛋白质纳米孔的膜放置在第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中纳米孔包括提供液体连通的开口，跨纳米孔施加电场，让分析物移位穿过纳米孔，测量分析物移位通过纳米孔的阻断电流，将实验阻断电流与阻断电流标准进行比较并确定分析物等。这些步骤中的任何一个都可以用于本发明的方法中，并且本领域技术人员知道如何在本发明的方法中使用这些步骤中的任何一个。本发明的特征在于所用的蛋白质嵌入有金属。嵌入金属的蛋白质纳米会放大分析物的电流，因为纳米孔的通道因金属粘附而变窄。在本发明中，出于识别分析物的目的，蛋白质纳米孔可以位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中纳米孔包括提供液体连通的开口。可选地，第一导电液体介质和第二导电液体介质可以相同或不同，任一个或两个可以包括盐、去污剂或缓冲剂中的一个或更多个。例如，在本发明中，第一导电液体介质和第二导电液体介质可以相同，并包括由1.5mkcl和10mmtris-hcl在ph＝7.0下组成的1.5mkcl缓冲液。在本发明中，蛋白质纳米孔可以在膜(诸如脂质双层)中。膜可以位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间。借助于施加到纳米孔上的电场使分析物电泳移位通过纳米孔。向纳米孔施加电场的方法和设备是本领域技术人员已知的。例如，一对电极可以用于向纳米孔施加电场。电场足以使分析物穿过纳米孔。将理解的是，可以使用的电压范围可以取决于纳米孔系统的类型和所使用的分析物。例如，在一些实施方式中，对于蛋白质纳米孔，施加的电场在约20mv至约200mv之间。在一些实施例中，施加的电场在约60mv至约200mv之间。在一些实施例中，施加的电场在约100mv至约200mv之间。在一些实施例中，施加的电场为约180mv和约200mv。如本领域技术人员已知的，当分析物移位通过纳米孔的通道时，它与纳米孔相互作用，从而导致通过纳米孔的电流发生变化，这通常是显著的电流减小，称为阻断电流。不同的分子将导致不同的阻断电流，这可用于表征通过纳米孔的分析物的组成信息。通常，“阻断”由离子电流的变化来证明，该变化可以明显地与噪声波动区分，并且通常与纳米孔内存在分析物分子有关。阻断的强度或电流的变化将取决于分析物的特性。本领域技术人员可以区分何种电流变化是阻断。在本发明中，更具体地，“阻断”可以指离子电流下降至比未阻断电流水平低约5-100％的水平，保持一段时间并自发返回至无阻断水平。例如，阻断电流水平可以为比无阻断电流水平低约、至少约或至多约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。测量阻断电流的方法在本领域中是众所周知的。通过纳米孔的阻断电流的测量可以通过光信号或电流信号进行。例如，一个或更多个测量电极可以用于测量通过纳米孔的电流。这些可以是例如膜片钳放大器或数据采集设备。例如，可以使用axopatch-ib膜片钳放大器(axon200b，moleculardevices)来测量流过纳米孔的电流。本领域技术人员已知如何基于测得的阻断电流来确定分析物的特性。例如，在获得测量的阻断电流之后，将所述测量的阻断电流与阻断电流标准进行比较并确定分析物。例如，当分析物是含金属的分析物时，在相同的检测条件下，将测得的阻断电流与含金属的分析物的阻断电流标准进行比较，并确定分析物是否为含金属的分析物。例如，当分析物是核酸时，在相同的检测条件下，将测得的阻断电流与a、t、c和/或g或其组合的阻断电流标准进行比较，并确定核酸的组成。例如，当分析物是氨基酸或肽时，在相同的检测条件下将测得的阻断电流与氨基酸或肽的阻断电流标准进行比较，并确定氨基酸的类型或肽的组成。本发明的方法可以是定性的或定量的。因此，本发明的方法可以用于确定分析物的身份(identity)或分析物的浓度。在一些实施方式中，本发明的方法可用于确定分析物的身份，诸如含金属的离子(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)或氨基酸。例如，当分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子时(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)，将测得的阻断电流与含金属的离子(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)在相同的检测条件下的阻断电流标准相比较，并确定含金属的离子的身份(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)。例如，当分析物是氨基酸时，将测得的阻断电流与相同检测条件下氨基酸的阻断电流标准进行比较，并确定氨基酸的身份。在一些实施方式中，本发明的方法可用于确定分析物的浓度，诸如含金属的离子(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)或氨基酸。例如，当分析物是含金属的分析物，诸如含金属的离子时(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)，将测得的阻断电流与具有标准浓度的含金属的离子(例如[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)在相同检测条件下的阻断电流比较，并确定含金属的离子(例如，[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+)的浓度。例如，当分析物是氨基酸时，将测得的阻断电流与具有标准浓度的氨基酸在相同的检测条件下的阻断电流进行比较，并确定氨基酸的浓度。根据本发明，提供了识别样品中含金属的离子的方法，所述方法包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的mspa，其中所述mspa包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品；施加穿过mspa的电场，并且使含金属的离子移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中含金属的离子。根据本发明，提供了识别样品中的含金属的离子的系统或装置，所述系统包含mspa，所述mspa位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述mspa包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品。根据本发明，提供了识别样品中分析物的方法，所述方法包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的蛋白质纳米孔，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品，其中所述纳米孔嵌入有一个或更多个含金属的离子；施加穿过纳米孔的电场，并且使分析物移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中的分析物。根据本发明，提供了识别样品中分析物的系统或装置，所述系统或装置包含蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品，其中所述纳米孔嵌入有一个或更多个含金属的离子。嵌入的金属(诸如一个或更多个[aucl4]-离子)与纳米孔内表面上的氨基酸之间的相互作用可以通过施加电场并使含金属的离子在纳米孔中移位来实现。因此，在一些实施方式中，含金属的离子可以与待检测的分析物一起包含在第一导电液体介质或第二导电液体介质中，含金属的离子和分析物都在电场下通过纳米孔移位，所述含金属的离子与纳米孔的内表面结合，从而识别分析物。因此，识别样品中分析物的方法的一个特定实施方式包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的蛋白质纳米孔，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品和含金属的离子；施加穿过纳米孔的电场，并且使含金属的离子和分析物移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中的分析物。因此，识别样品中分析物的系统或装置的一个特定实施方式包含蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括样品和含金属的离子。在另一实施方式中，首先，使含金属的离子结合到纳米孔的内表面，然后，将样品加入到第一导电液体介质和第二导电液体介质中，并通过纳米孔移位。因此，识别样品中分析物的方法的另一特定实施方式包括：提供位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间的蛋白质纳米孔，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括含金属的离子；施加穿过纳米孔的电场，并且使含金属的离子移位通过纳米孔；将样品加入起初包括含金属的离子的导电液体介质中，并且使分析物移位通过纳米孔；测量穿过纳米孔的阻断电流；以及根据测得的阻断电流识别样品中的分析物。因此，识别样品中的分析物的系统或装置的另一个特定实施方式包含蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔位于第一导电液体介质和第二导电液体介质之间，其中所述纳米孔包括开口，所述开口提供所述第一导电液体介质和所述第二导电液体介质之间的液体连通，其中所述第一导电液体介质或所述第二导电液体介质包括含金属的离子。在一些实施方式中，将结合至纳米孔的内表面的所述含金属的离子包含au(iii)，诸如au3+。在一些实施方式中，所述含金属的离子是四氯金(iii)酸盐离子(即[aucl4]-)。在一些实施方式中，将氯金酸加入到第一或第二导电液体介质中以形成含金属的离子。在一些实施方式中，第一导电液体介质或第二导电液体介质中的[aucl4]-或氯金酸的浓度等于或大于200nm、等于或大于1μm、等于或大于15μm、或等于或大于10μm。在一些实施例中，第一导电液体介质或第二导电液体介质中的含金属的离子的终浓度为至少200nm、至少1μm、至少4μm、至少5μm、至少8μm、至少10μm、至少15μm、至少50μm。本发明还涉及识别分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：(1)含金属的化合物；和(2)可以形成纳米孔的蛋白质或可以表达可以形成纳米孔的蛋白质的核酸、表达载体或重组宿主细胞。所述含金属的化合物能够在溶液中形成含金属的离子。所述含金属的离子包括金属离子和由金属和其他离子形成的配位离子。在一些实施方式中，所述含金属的化合物能够在溶液中形成[aucl4]-、zn2+、co2+、ag+、cd2+、ni2+、[aucl2]-、cu2+、cr3+、fe2+、fe3+、pt(ii)、pd(ii)、mn2+、hg2+、ru(ii)或pb2+离子。在一些实施方式中，所述含金属的化合物能够在溶液中形成[aucl4]-或[aucl2]-离子。在一些实施方式中，所述含金属的化合物可以是氯金酸或四氯金(iii)酸盐。可以形成纳米孔的所述蛋白质的定义与上述蛋白质纳米孔的描述相同。通过参考下面的详细描述、实施例和权利要求以及它们的先前和随后的描述，可以更容易地理解本文描述的实施方式。应当理解，本文描述的实施方式不限于特定用途、方法和/或产品。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在限制。此外，提供以下描述作为各实施方式在其最佳的、当前已知的方面的可行教导。相关领域的技术人员将认识到，可以对所描述的方面进行许多改变，同时仍获得本公开的有益结果。还将显而易见的是，通过选择各实施方式的一些特征而无需利用其他特征，可以获得本发明的一些期望的益处。因此，本领域技术人员将认识到，对本文所述的各种实施方式的许多修改和改变是可能的，并且在某些情况下甚至可能是期望的，并且是本公开的一部分。因此，提供以下描述作为对本文描述的实施方式的原理的说明，而不是对其的限制。在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的系统或方法的标准误或标准差。在结合术语“约”使用的数值的上下文中讨论的任何实施方式中，特别地考虑到可以省略术语“约”。在整个本说明书中应该理解，除非另外提及，否则单数形式的表达包括其复数的概念。因此，例如，应当理解，除非另外提及，否则单数冠词(例如，英文中的“a”、“an”、“the”)包括复数形式的概念。还应该理解的是，除非另有说明，否则本文所用的术语具有本领域通常使用的定义。因此，除非另外定义，否则所有科学和技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常使用的含义相同的含义。如有矛盾，以本说明书(包括定义)为准。本文所引用的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，均明确地通过引用并入本文。实施例实施例1观察wtα-hl内单个四氯金(iii)酸盐结合七聚体wtα-hl是一种蘑菇状离子通道蛋白，具有狭窄的圆柱形茎，在最狭窄的位置直径约1.4nm[9]。由于膜片钳放大器(axon200b，moleculardevices)的采集带宽有限(100khz)，除非能够建立离子与孔之间的相互作用，否则单个无机离子通过纳米孔的移位是无法解析的。基于已知的硫-金(s-au)配位相互作用[24]，位于孔的第一个限制位点附近[28]并且是α-hl单体内表面内唯一含硫氨基酸的蛋氨酸(113)[25-27]，有望与自由移位穿过膜的四氯金(iii)酸盐离子形成可逆相互作用。实验上，除非另有说明，否则所有电生理学测量均应使用膜片钳放大器(axon200b，moleculardevices)在ph7.0的由1.5mkcl和10mmtris-hcl组成的水性缓冲液中进行(方法)。将氯金酸加入cis室(cischamber)(电接地的一侧)中，以达到预期终浓度。通过将单个wtα-hl插入膜中，阴离子[aucl4]-被电泳驱动通过孔。在+100mv下，当将氯金酸加入到cis室中达到终浓度5μm时，[aucl4]-的结合产生特征性电阻脉冲信号(δi≈6pa,τoff≈10-20秒，表1)(图1、2)。此处δi代表电阻脉冲幅度，τoff代表事件的停留时间(dwelltime)。表1使用α-hlwt测量δi1的统计数据。在100mv下使用1μmhaucl4进行测量，δi1代表i0和m-(aucl4-)1之间的幅度差异。为了验证这种传感机制，通过孔工程化引入met→gly突变(m113g)(图3，方法)。即使将cis侧中的累积氯金酸浓度提高到50μm，也无法通过α-hlm113g检测到使用wtα-hl观察到的[aucl4]-离子结合事件(图4)。因此，在m113g突变体中没有离子结合事件是wtα-hl内au(iii)和蛋氨酸(113)之间配位相互作用的证据。据我们所知，尽管先前已经从整体上对该主题进行了系统的研究[25-27]，但这是首次观察到在受限的孔限制部位中au(iii)与蛋氨酸之间的单分子配位相互作用。四氯金(iii)酸盐在α-hl中的结合在阻断幅度的统计数据中显示出较大的分散性(图1)，这可能是由于四氯金(iii)酸盐与wtα-hl的长的、圆柱形的限制部位范围内的其他残基(诸如k147和k131)的非特异性结合所致[13]。这种长的限制部位使α-hl进一步工程化以进行四氯金(iii)酸盐传感复杂化。但是，此新发现的机制可能适用于其他通道蛋白，以增强传感性能。实施例2将四氯金(iii)酸盐离子结合能力转移到mspa中受到纳米孔测序(其中具有单个的、几何形状是尖锐的限制部位，如mspa[22]或csgg[29]中的限制部位的纳米孔是有利的，因为它具有更高的空间分辨率[3])的启发，直接单离子传感也可以在几何形状尖锐的纳米孔上进行，以获取更大的信号幅度，并避免与远离识别位点的残基的非特异性结合。突变体m2mspa[22](d93n/d91n/d90n/d118r/d134r/e139k)，是首个报道的用于dna测序的纳米孔，是一种漏斗形的八聚离子通道蛋白，最窄点的直径约为1.2nm(方法)[30]。m2mspa中的突变旨在中和wtmspa的原始负电荷(pdbid:1uun[31])，以提高对阴离子，诸如dna[22]或四氯金(iii)酸盐的捕获率。根据对相应蛋白质结构的可视分析，m2mspa的内表面不存在蛋氨酸或半胱氨酸，使其成为可以通过孔工程引入蛋氨酸的干净“模板”。在实验中，如在α-hlm113g中(图4)，即使将cis侧的累积氯金酸浓度提高到50μm，使用m2mspa也未检测到[aucl4]-结合事件(图5)。通过在m2mspa中进行单点定向诱变，在残基91引入蛋氨酸(方法)，该残基处直径为1.2nm[23]，是mspa的最窄点(图6a)。此mspa突变体即mspa-m(d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k)，其制备方法与其前体(m2mspa)(方法)相同，并且在表征过程中显示出相似的通道特性(图7)，表明八聚体孔组装未因突变而改变。使用+100mv施加电位，在1.5mkcl缓冲液中的连续电生理记录期间(方法)，当cis侧的haucl4的终浓度达到200nm时，出现mspa-m的[aucl4]-阻断事件(图6b)。当cis侧的haucl4浓度达到1μm时，事件计数显著增加(图6b，表2)。表2使用mspa-m测得的δi1的统计数据在100mv下使用1μmhaucl4进行测量，δi1代表i0和m-(aucl4-)1之间的幅度差异。考虑到由于八聚体孔的不对称性，存在八个相同的蛋氨酸残基，当haucl4浓度进一步提高时，逐渐出现间距大致相等的多级阻断事件(图6c)，表示同时被同一孔内的多于一个[aucl4]-离子阻断。这些阻断水平称为m-(aucl4-)n，其中n代表同时在孔中的[aucl4]-离子数(图6b，c)。类似于使用wtα-hl进行[aucl4]-传感(图2)，从未观察到从m-(aucl4-)n到m-(aucl4-)n±2的直接转变(图8)。wtα-hl和mspa-m之间的相似性证明了[aucl4]-传感能力已从wtα-hl成功移植到mspa-m。从10min连续记录的代表性迹线得出的事件阻断幅度的统计数据显示了完全解析的峰，形式为窄gaussian峰(图6d)，对应于不同的m-(aucl4-)n阻断。明显从未观察到非特定事件，诸如统计计数不符合gaussian分布(图6d)。据推测，来自远离限制部位的可能的非特异性相互作用的信号贡献被减弱为可忽略的“离焦(off-focus)”贡献，并且这提示了使用几何形状尖锐的离子通道来传感单离子或小分子的显著优势，其中孔的工程化被简化与文献报道的α-hl[13]相比，减少在孔限制部位周围的氨基酸数量。有时会遇到因高度突变的寡聚通道蛋白而导致的表达产量降低或孔组装失败的高风险。尽管在cis侧含有200nmhaucl4浓度可以检测到四氯金(iii)酸盐事件，但是当cis侧的累积haucl4浓度达到1μm时，观察到的检测频率急剧增加(图6e)。但是，m-(aucl4-)1事件的1/τoff值在所有haucl4浓度下均保持不变，表明在各种分析物浓度下的结合类型相同。当haucl4浓度进一步提高到1-15μm时，m-(aucl4-)n>1事件占主导地位(图6c)，由此可以推断出统计值τon(事件间持续时间，图9)和相应的导通速率(on-rate)(图10，表3)。表3[aucl4]-与mspa-m的缔合速率常数n＝3以形成统计量。在工程化mspa纳米孔中嵌入不同的金属离子类型如图22所示。图23显示了在不同位置工程化的以用于aucl4-嵌入的mspa纳米孔。实施例3在不同限制空间中单个四氯金(iii)酸盐离子的结合到目前为止，单个四氯金(iii)酸盐的结合已被证明涉及两种通道蛋白，它们具有相似的外部尺寸但几何形状不同(图11a)。从技术上讲，通过适当的蛋白质工程，任何生物纳米孔都可以适应这种新发现的机制，从而与[aucl4]-结合。但是，当受到例如限制部位附近的几何形状、电荷或电场的不同限制时，不同孔中的[aucl4]-结合可能产生变化的单离子行为。这些现象可能提示了如何对单个离子传感器进行进一步优化，或者启发新的含金化合物作为药物分子的设计，这些药物分子以高特异性靶向离子通道蛋白。尽管实验的进行方式相同，但wtα-hl中的[aucl4]-阻断事件表现为浅的(δi＝5.63±0.33pa)电阻脉冲，但持续时间较长且分散宽(12.30±19.23s)(图1)。另一方面，在mspa-m中的[aucl4]-结合显示出较深阻断(δi＝11.25±0.19pa)，但该事件更短且分布更窄(0.40±0.36s)(图11b)。通过分析来自wtα-hl或mspa-m的m-(aucl4-)1事件的δi，可以由不同的研究人员在独立测量中系统地观察到这些差异(表1、2)。尽管从mspa-m观察到较大的δi绝对值，但两个孔的阻断百分比(δi/i0)却非常相似。我们得出结论，这是孔几何形状的影响，其中两个孔中四氯金(iii)酸盐结合的最窄区域的大小相似(图11a)，并决定δi/i0。mspa的开口更宽，导致更高的开放孔电导率，导致绝对幅度的δi更大。较大的δi幅度以及窄得多的分散(图11c)表明，对于单离子传感，mspa优于α-hl。圆锥形的几何形状同时导致更快的电位降和更强的电场(ez＝-dv/dz)。增强的电泳力和电渗流应有助于缩短mspa-m中四氯金(iii)酸盐结合的持续时间(图11d)。孔内表面内的局部电荷分布对于吸引分析物至关重要。发现mspa-m比wtα-hl更有效地捕获四氯金(iii)酸盐，其中从mspa-m观察到200nm的检出限，比α-hl的检出限低5倍。这可能是由于在最初设计为吸引ssdna的mspa-m的较大前庭(d118r/d134r/e139k)周围引入正电荷引起的。[22]当孔中的过量正电荷导致更有效的dna捕获率时，在其他生物纳米孔中也观察到类似现象[32-34]。通过测量由wtα-hl(图12)或mspa-m(图11e-g)获得的m-(aucl4-)1结合事件的电压依赖性，在+200mv使用mspa获得最大的δi＝～54.88pa，远远超出了先前报道的来自单个离子的任何孔阻断信号(图11h)[10,12-14]。特别是对于[aucl4]-在+200mv时的结合，mspa-m超出wtα-hl约30.49pa(图11h，表4)。表4不同电压下的平均电流阻断相反，当以超过+100mv的偏置电位记录时，wtα-hl中的[aucl4]-结合产生明显的基线波动(图12)，这限制了其在高施加电压下的使用。这种现象应归因于当在高施加电压下增加数量的阴离子被驱动进入孔收缩部位中时，[aucl4]-在α-hl圆柱状茎部内的非特异性结合。在低电压测量中，尽管几乎检测不到(0.90±0.08pa)，但在+20mv施加电位下仍能看到mspa-m中的[aucl4]-结合(图11e)，wtα-hl至少需要+60mv以解析事件。总之，使用[aucl4]-作为模型分析物，mspa-m在许多方面都明显胜过wtα-hl，诸如较大的事件幅度、较窄的事件分散度、较高的传感特异性和较低的检测限。实施例4ssdna移位通过嵌入四氯金(iii)酸盐的mspa通过对事件统计中峰值幅度差异的定量分析(图6d)，其中m-(aucl4-)0代表开孔电流(i0)，对于所有已完成的独立实验(表5)进行系统观察可以看出规则δi3＞δi2＞δi1(图13)。表5平均电流阻断和峰幅度差异此处据推测，[aucl4]-离子的连续附着逐渐使mspa的剩余孔腔变窄，从而使孔限制部位更加尖锐，结果是，相对于先前积聚的[aucl4]-结合，任何进一步的[aucl4]-阻断信号都被放大。可以使用comsol的有限元法(fem)建模来半定量地解释这种现象(图14)。简而言之，构建具有可变的限制尺寸的圆锥形孔几何形状。然后可以证明，具有非常狭窄限制的孔几何结构导致限制位点周围的电场强度增加，从而使其对分析物的结合更加灵敏(图15a)。这意味着嵌入多于一个[aucl4]-的生物孔可以更有效地解析[aucl4]-的进一步结合。mspa的限制部位几何形状最初被研究用于dna测序的目的23，但迄今为止尚未报道过其微调。对于嵌入[aucl4]-的mspa-m，保持阻断<10％，留下90％的孔腔开放，并且能够仍允许ssdna移位。对于由于嵌入了au(iii)而具有较窄限制的mspa，放大的ssdna传感信号被预期。选择dna均聚物poly(da)10(表6)作为模型分析物移位通过具有动态变窄的au嵌入的mspa。选择这种短的ssdna均聚物以避免dna二级结构引起的复杂情况。表6核酸的缩写和序列在实验方面，将氯金酸和poly(da)10加入到cis侧，终浓度分别为10μm和8μm。电生理记录1.5mkcl缓冲液中在+100mv进行(方法)。如图15b所示，[aucl4]-与mspa-m的顺序结合略微降低其剩余的开放孔电流，称为水平n，其中n是同时在孔中的[aucl4]-离子的数量(图6)。另一方面，对于n值更大的水平n，ssdna移位信号显示出较大的孔阻断幅度和检测频率(图15b)。考虑到在水平0几乎未检出poly(da)10移位信号，嵌入[aucl4]-离子的mspa-m纳米孔显示出由于微调孔腔中的离子嵌入而具有提高的灵敏度和放大信号的优点。从不同水平n提取的ssdna移位事件的散点图如图15c所示，其中观察到对于n值较大的水平n，高幅度阻断的事件计数显著增加。事件计数的增加通过τon(ssdna移位的事件间持续时间)的统计数据进行了验证，其中观察到捕获率提高了5-10倍(图15d)。尽管在散点图中分布广泛(图15c)，即使使用有离子嵌入的孔，但平均阻断百分数δi/i0幅度和ssdna移位事件的平均停留时间明显显示出随n值的增加呈线性增加(图15e-g，表7)，表明了随着限制部位的原子调整，对ssdna移位特性受到显著调节。表7poly(da)10统计在存在10μmhaucl4的情况下，poly(da)10与mspa-m的缔合速率常数、平均停留时间和δi/i0。n＝3以形成统计量。如先前报道[23]，将ssdna捕获到mspa纳米孔中需要最小长度的ssdna(>50个核苷酸)，这将其直接传感的应用限制在短寡聚核酸(诸如mirna、sirna或短dna探针)。由动态au(iii)嵌入调节的孔限制显示了对短至10个核苷酸长度的短核酸寡聚体的有效传感。对于由随机序列组成的78个核苷酸的ssdna，也观察到了类似的现象(图16，表8)，这表明具有狭窄孔限制的mspa一般性地对ssdna更敏感。表878-nt事件统计在存在10μmhaucl4的情况下，78-ntssdna与mspa-m的平均停留时间和δi/i0。据报道，m2mspa虽然具有圆锥形的几何形状，但它不能真正解析单个核苷酸而不受到相邻碱基的信号干扰[3]，而是依赖于复杂的生物信息学程序1来进行序列解码。与下一代测序平台相比，解码的准确性仍然不能令人满意。纳米孔测序可在原子调节的mspa纳米孔中进行，其中更收紧的孔限制可产生更高的空间分辨率，减少分子振动引起的热波动或产生更多的信号特征以进行单核苷酸识别。然而，具有永久性原子嵌入的孔的进一步工程化很重要。实施例5使用嵌入au(iii)的mspa高度特异性地检测l-蛋氨酸除调节孔限制的大小外，au(iii)嵌入还赋予mspa纳米孔新的识别功能，诸如通过使用嵌入的au(iii)原子作为原子接头对l-蛋氨酸进行高特异性检测。尽管人们已经非常关注如何使用纳米孔对蛋白质进行测序[35]，但是当前的挑战是获得，其具有直接从孔阻断事件中完全区分20个氨基酸的传感特异性的孔限制。在实验方面，m2mspa未报道l-蛋氨酸或四氯金(iii)酸盐的任何信号(图17)，因为在任何一种分析物和孔之间都无法建立相互作用。突变体mspa-m相对于m2mspa具有单个n91m突变，与四氯金(iii)酸盐强烈相互作用(图6)，但未报道l-蛋氨酸的直接传感信号。但是，在+100mv施加电位下1.5mkcl缓冲液中连续记录期间(方法)，当将l-蛋氨酸和氯金酸分别以80μm和4μm的浓度加入cis侧时，mspa-m报告发生深阻断事件(～48pa)(图18a)。当加入氯金酸作为唯一的分析物时，从未观察到这些深阻断(图6)。详细的检查表明，这些深阻断事件可以分为四种类型，可以理解为三种事件状态的各种组合(图18b)。在图18c中展示了解释所有四种类型的l-蛋氨酸诱导的阻断事件的分子模型。根据该模型，状态3表示l-蛋氨酸与第91位的结合状态，使用au(iii)作为桥原子(图19)。通过获取状态3的持续时间以及状态1和状态3之间的幅度变化(δi1-3)来生成散点图，以演示事件统计信息(图18d)。为了避免由于四氯金(iii)酸盐多次结合而引起的复杂情况，统计中仅包括具有一个四氯金(iii)酸盐结合的事件。从相应的幅度直方图中，所有四种事件的δi1-3重叠并且分布在48pa附近。三个独立的测量结果表明，δi1-3的幅度为48.67±0.91pa，停留时间为10.05±1.73ms(表9)。表9l-蛋氨酸传感的统计在存在4μmhaucl4的情况下，在100mv下l-蛋氨酸与mspa-m的δi1-3统计。δi1-3代表i0与[m]-(aucl4-)-m之间的幅度差异。如果单个四氯金(iii)酸盐的结合在这些测量条件下导致电流下降约11pa(表2)，则单个l-蛋氨酸的绝对阻断幅度约为37pa，其幅度比以前报道的使用工程化的α-hl进行氨基酸检测时观察到的幅度大约10倍。[36,37]l-蛋氨酸导致的孔阻断幅度增大，部分原因是mspa的圆锥形几何形状[36]。但是，，au(iii)嵌入缩窄了孔限制，也因分析物结合的传感点周围的电场增加进一步放大孔阻断的幅度(图15a)。在状态3下对阻断事件的详细检查显示出一致的和特征性的水平波动(图20)，这可能源于分析物的振动或非特异性结合的形成。使用l-天冬酰胺和l-甘氨酸进行的相似测量完全没有报告如状态3的事件(图21)，这表明嵌入的au(iii)对氨基酸侧链上的硫原子具有高度特异性。该展示提出了一种新的策略，用于使用具有设计的原子接头的纳米孔进行高度特异性的氨基酸传感或蛋白质测序。然而，四氯金(iii)酸盐嵌入的动态结合和解离继续使数据分析复杂化。通过使用不可逆的配位相互作用将金属离子永久嵌入，可以进一步利用这种方法进行工程化。[36]通过设计针对分析物氨基酸不同侧基的原子接头，可以完全区分其他氨基酸。这些接头在锥形生物纳米孔中的位置也可以广泛分布，以调节信号幅度，从而优化信号识别能力。然而，由于不可避免地存在异构体，即mspa的八聚体对称性，如果要将2-6个au(iii)原子引入具有特定定位要求的mspa孔中，则纯化可能具有挑战性。另一种解决方案可以通过将单体通道蛋白ompg[38-40]作为金属离子嵌入的模板来简化这种情况。各种生物纳米孔中的其他离子氨基酸组合，诸如溶细胞素a[41]、phi29马达蛋白[42]或气溶素[2]，也可能适用于不同的应用。实施例6使用嵌入au(iii)的mspa直接传感l-半胱氨酸当与蛋氨酸结合时，au(iii)原子在mspa的限制部位附近保持约0.5s，形成一个瞬时au(iii)嵌入物作为传感接头。如先前报道[53]，除了已证明的au(iii)-硫醚相互作用外，还期望au(iii)-硫醇之间有更强的相互作用[53]，这表明嵌入au(iii)的mspa可能传感多种含硫醇的分子。丰度最高的生物硫醇包括l-半胱氨酸(cys)、l-高半胱氨酸(hcy)和l-谷胱甘肽(gsh)，它们直接参与关键的生理过程[54,55,56]，诸如蛋白质合成[57]、自由基清除[54]和维持正常的免疫系统[58]。尽管这些生物硫醇在血浆中的丰度很高，在～μm范围内[59]，但对于直接同时识别这些生物硫醇提出了巨大的挑战。具有独特的生理作用，这些生物硫醇的判别传感在生物医学诊断中可能具有重要意义。传统上，生物硫醇的检测是通过高效液相色谱-质谱[60]或设计的荧光探针[61]进行的，但是却需要耗时费力的样品制备过程或探针设计的挑战。纳米孔传感便宜、快速并且在解决小分子中的微小结构差异方面具有优势，可以为直接传感生物硫醇提供另一种解决方案。但是，未在分析物和孔之间建立相互作用时，生物纳米孔(诸如八聚体mspa-m)通常不会直接报告所有生物硫醇的信号(图24)。另一方面，已证明的au(iii)嵌入使mspa可以通过au(iii)-硫醇配位化学与生物硫醇相互作用。与已建立的au(iii)-硫醚配位相比，au(iii)-硫醇配位形成更强的键，与现有的au(iii)-硫醚键竞争，因此加速了au(iii)从孔的解离。尽管所描述的化学过程迅速发生，但是可以通过纳米孔传感器进行监视，这构成了传感的基础。作为概念的证明，如方法中所述，使用mspa-m进行了基于纳米孔的生物硫醇传感。具体而言，将haucl4加入到cis隔室中，而将生物硫醇加入到trans隔室中。将两种分析物加入到纳米孔的不同侧，以最大程度地降低进入孔限制前au(iii)和生物硫醇之间的自发氧化还原反应(图25a)。通过这种配置，首先将阴离子型[aucl4]-电泳驱动到孔中，并在孔限制处与蛋氨酸结合。随后，作为原子桥的结合的au(iii)捕获自由移位的生物硫醇分子，并被刺激从孔上的硫醚基团解离。随后，每当下一个au(iii)结合时，就会启动一个新的传感周期(图25b)。l-半胱氨酸(cys)是参与蛋白质合成的必需氨基酸[57]，是最著名的生物硫醇(图25c)。作为可行性检测，通过分别以4μm和40μm的浓度将氯金酸加入cis侧和将cys加入trans侧，进行基于纳米孔的生物硫醇传感(方法)。从电生理记录来看，mspa-m报告了新型的两步形阻断事件(图25d)，当haucl4是唯一加入的分析物时，它可以与结合事件明显区分(图11)。这种类型的代表事件由三个状态组成，即0、1和1sh，它们对应于开孔状态，[aucl4]-结合状态和cys结合状态，如图25b的分子模型所述。状态1sh可以从其特征性抖动信号中识别，这从未从[aucl4]-结合事件中观察到(图25e)。特征性抖动信号可能表示cys与结合的au(iii)之间的氧化还原反应。尽管如此，当反式加入cys时，可以通过状态1的停留时间显著减少来间接监测au(iii)与巯基之间的相互作用(图28)。新形成的au(iii)-硫醇相互作用促进au(iii)从纳米孔的解离。通过其特征事件形状，可以立即将cys传感事件与其他非特异性结合类型区分。为了确保可读性，仅基于统计算法对cys传感事件进行计数，该统计基于简单的算法，即事件必须包含所有三个状态，如图25e所示。其他非特异性事件类型被忽视，包括没有捕获生物硫醇的一个[aucl4]-的结合和解离，两个[aucl4]-离子的顺序结合，以及mspa-m的固有噪声(图26)。尽管如此，从连续记录的结果来看，cys传感事件占所有可检测事件的96％(图27)。图25f显示了[aucl4]-和cys传感事件的相对阻断幅度δi/i0相对于停留时间的散点图。尽管cys事件的分散度比[aucl4]-的分散度稍宽(图25f)，但cys事件形成了清晰的单分散分布。在δi/i0(图25g，表10、11)和停留时间τoff(图25h)的直方图中可以清楚地证明这一点，从中可以看出cysδi/i0为0.104±0.008(表11，n＝364)，状态1sh的平均停留时间为3.18ms(图25g-h)。使用l-天冬酰胺、l-甘氨酸和l-谷氨酸也进行了类似的测量(图29)，没有观察到如图25e所示的事件。这表明该传感构型对氨基酸的硫醇侧链具有高度特异性。表10l-半胱氨酸传感的统计。统计数据来自当在cis侧置入4μmhaucl4和在trans侧置入40μmhcy时使用mspa-m连续记录10min的统计数据。施加+100mv电压。δi0-1代表i0和i1之间的幅度差异。δi0-1,cys代表i0和i1,cys之间的幅度差异。τoff代表i1的停留时间，τoff,cys代表i1,cys的停留时间。每个条件进行三个独立的测量以形成统计量。表11l-半胱氨酸传感的δi0-1,cys/i0的统计。统计数据来自当在cis侧置入4μmhaucl4和在trans侧置入40μmhcy时使用mspa-m连续记录10min的统计数据。施加+100mv电压。δi0-1代表i0和i1之间的幅度差异。δi0-1,cys代表i0和i1,cys之间的幅度差异。每个条件进行三个独立的测量以形成统计量。实施例7使用au(iii)嵌入的mspa对l-高半胱氨酸的直接传感l-高半胱氨酸(hcy)是cys的同系物，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢的重要中间体[62]。血清中hcy水平升高表明患心血管疾病的风险很高，是诊断的关键参数[63]。但是，hcy与仅含一个亚甲基的cys不同(图30a)，并且cys与hcy之间的区分是一个挑战。当在cis侧置入4μm氯金酸和在trans侧置入40μmhcy时，按图25a(方法)中所述进行hcy传感。从连续记录的迹线中观察到，与cys相比，系统性的阻断事件更深(～33pa，用绿色方块标记)(图30b)。代表性hcy事件也由三个状态组成(图30c)，类似于cys的行为(图25e)。但是，这些在ish状态中有所不同。δi/i0相对于来自[aucl4]-和hcy传感事件的停留时间的散点图显示事件的分散(图30d)。从相应的δi/i0直方图中，hcy阻断事件的测量值为0.13±0.01(n＝330)(图30e，表12、13)，证实了与cys相比，观察到的相对阻断幅度更深。另一方面，hcy的状态1sh的平均停留时间为2.94ms(表12)，与cys相似(图31)。为了证明直接从单分子读数中同时区分cys和hcy，使用反式20μmcys和20μmhcy的混合物进行纳米孔测量。cis侧haucl4的浓度保持在4μm。从连续记录的迹线中可以看出，加入两种类型的生物硫醇立即报告两种可区分的事件类型(图30f)。δi/i0相对于停留时间的散点图以及相应的幅度直方图(图30g)清楚地显示了两种不同的事件类型。从相应的gaussian拟合结果中，δi/i0的直方图中的两个峰分别为cys为0.105±0.005和hcy为0.128±0.013，这与分别测量的值一致。上述证明表明，可以从直接的纳米孔读数中直接区分cys和hcy，差异仅在于一个亚甲基基团。表12l-高半胱氨酸传感的统计。统计数据来自当顺式置入4μmhaucl4和反式置入40μmhcy时使用mspa-m连续记录10min的统计数据。施加+100mv电压。δi0-1代表i0和i1之间的幅度差异。δi0-1,hcy代表i0和i1,hcy之间的幅度差异。τoff代表i1的停留时间，τoff,cys代表i1,hcy的停留时间。每个条件进行三个独立的测量以形成统计量。表13δi0-1,hcy/i0l-高半胱氨酸传感的统计。统计数据来自当在cis侧置入4μmhaucl4和在trans侧置入40μmhcy时使用mspa-m连续记录10min的结果。施加+100mv电压。δi0-1代表i0和i1之间的幅度差异。δi0-1,hcy代表i0和i1,hcy之间的幅度差异。每个条件进行三个独立的测量以形成统计量。表14l-谷胱甘肽传感的统计。统计数据来自当在cis侧置入4μmhaucl4和在trans侧置入40μmgsh时使用mspa-m连续记录10min的统计数据。施加+100mv电压。δi0-1代表i0和i1之间的幅度差异。δi0-1,gsh代表i0和i1,gsh之间的幅度差异。τoff代表i1的停留时间，τoff,cys代表i1,gsh的停留时间。每个条件进行三个独立的测量以形成统计量。实施例8使用au(iii)嵌入的mspa对l-谷胱甘肽的直接传感l-谷胱甘肽(gsh)是一种三肽(glu-cys-gly)(图33a)，对维持免疫系统至关重要。它也是人血清中发现的最丰富的三肽硫醇[58]。如cys和hcy所证实的，gsh中的内部硫醇使其与所述生物硫醇传感策略相容。在cis侧含有4μm氯金酸和在trans侧含有40μmgsh时，观察到特征性的生物硫醇传感事件，幅度约为～36pa(图33b)。从代表性事件来看，gsh(状态1sh)的特征性抖动信号报告的阻断幅度(图5c)比cys(图25e)大得多。根据分别用谷氨酸和甘氨酸进行的阴性对照(图29)，已证实gsh的内部半胱氨酸对事件的发生至关重要。gsh和[aucl4]-的δi/i0相对于停留时间的散点图以及相应的幅度直方图如图5d所示。gsh测量的δi/i0为0.15±0.02(表14、15)，在状态1sh(图31，表14)中的平均停留时间为2.82ms，表明可以通过直接单分子读数将其与cys清楚地区分。通过在trans侧分别加入终浓度为10μm和30μm的cys和gsh混合物，而使cis侧的haucl4保持在4μm，进行cys和gsh的同时识别。与cys或hcy相比，gsh分子量更大，并且在ph中性缓冲液中带负电荷。施加+100mv电压后，发现cys比gsh更有可能被au(iii)嵌入的纳米孔捕获，因此混合物中gsh的浓度增加，以平衡两个事件的出现速率。从电生理迹线中，根据幅度差异可以清楚地识别出两种类型的事件(图33e)。gsh和cys的停留时间相对于δi/i0的散点图以及相应的幅度直方图如图33f所示，从中可以清楚地看到两个事件群。这清楚地证实，可以将cys和gsh与直接的纳米孔读数清楚地区分。实施例9比较au(iii)嵌入的mspa的生物硫醇传感图34a总结了三种类型的生物硫醇的传感事件。尽管[aucl4]-状态(状态1)似乎相同，但这些事件在其状态1sh的幅度上不同。从单分子观察，在trans隔室中加入生物硫醇也显著减少了[aucl4]-的结合时间。在不加入生物硫醇的情况下，结合的[[aucl4]-的停留时间为530±90ms。在以40μm的浓度在trans侧加入cys、hcy或gsh后，状态1的停留时间立即减少，这表明来自生物硫醇分子的硫醇基团与既存的au(iii)-硫醚相互作用强烈竞争。时间减少似乎不同，这可能是由于cys、hcy或gsh与au(iii)相互作用时空间位阻的差异所致。从单分子结果来看，在三种检测的生物硫醇中，cys与au(iii)的反应最为强烈(图31)。cys、hcy和gsh事件的δi/i0的直方图以及相应的gaussian拟合如图34b所示，并且i1,gsh>i1,hcy>i1,cys的顺序可以被清楚地观察到。这是可预期的，因为与cys相比，gsh明显大于其他两个氨基酸，并且hcy具有额外的亚甲基。从图34b的直方图中可以明显看出，通过它们各自δi/i0值，cys、hcy和gsh可以被明确区分。但是，主要由于状态1sh的抖动信号，使δi/i0值出现较宽的分布，并且不可避免地出现信号重叠。通过永久金接头可以实现进一步的优化，该永久金接头可以延长状态1sh的持续时间，以使事件幅度最终收敛。但是，平均δi/i0直方图的统计数据表明，可以通过独立的测量来实现cys、hcy和gsh之间的区分(图34c)(每个条件n＝3个孔，表11、13和15)。这些结果表明，au(iii)嵌入的mspa可以用作区分gsh、hcy和cys的高度灵敏的探针。与使用纳米孔识别半胱氨酸和高半胱氨酸的最近报道(其中需要耗时的样品制备并且原则上无法检测到gsh)不同[64]，本发明中描述的方法提出了一种简单明了的策略，该方法可以使用带有设计的原子接头的纳米孔传感多种含生物硫醇或硫醇的蛋白质。但是，动态结合和解离au(iii)嵌入继续使数据分析复杂化，这使得难以可靠地定量生物硫醇。通过使用不可逆配位接头将金属离子永久嵌入，可以进一步对这种方法进行工程化[65]。通过设计针对氨基酸分析物不同侧基的原子接头，可以完全区分其他氨基酸。这些接头在圆锥形生物纳米孔中的位置也可以稍微分散，以便可以调整来自不同分析物的信号幅度，以助于完全区分。表15δi0-1,gsh/i0l-谷胱甘肽传感的的统计。统计数据来自当在cis侧置入4μmhaucl4和在trans侧置入40μmgsh时使用mspa-m连续记录10min的结果。施加+100mv电压。δi0-1代表i0和i1之间的幅度差异。δi0-1,gsh代表i0和i1,gsh之间的幅度差异。每个条件进行三个独立的测量以形成统计量。结论我们已经展示了使用wtαhl进行的首个多原子离子传感。观察到的au(iii)和蛋氨酸之间的单分子配位相互作用可能启发设计新的含金化合物作为靶向离子通道蛋白的药物。这种分子机制也可以转移到其他生物纳米孔中，诸如mspa。由于几何优化，单个四氯金(iii)酸盐离子的结合导致增大、一致且尖锐分布的阻断信号。在+200mv的mspa中观察到的四氯金(iii)酸盐结合事件还包括有史以来最大的单个离子阻断信号(～54.88pa)。mspa的尖锐限制以及简单的诱变提示它作为一种新型工程化模板的作用，以传感各种各样的单离子和其他小分子，与其在纳米孔测序中的已知用途互补。当嵌入au(iii)时，通过进一步[aucl4]-嵌入使限制部位在原子上变窄时，ssdna的移位特性可以逐渐被调节。我们还展示了当mspa-m嵌入单个四氯金(iii)酸盐离子时对l-蛋氨酸的高度特异性识别，这提示了基于纳米孔的蛋白质测序中的新识别功能化策略。凭借其独特的物理和化学特性，金已广泛用于广泛的科学和工业应用中，诸如纳米颗粒的生产[43]、通道电极[44]、表面增强拉曼光谱探针[45]和表面等离子体共振基质[46]。然而，这些技术缺乏与生物纳米孔相当的单分子控制精密度，其中孔和分析物的几何形状[47]、方向[48]、极性[41]和化学修饰[10]都可操作。通过将嵌入的au(iii)用作原子桥，mspa具有生物硫醇传感能力，可直接从单分子读数中区分l-半胱氨酸、l-高半胱氨酸和l-谷胱甘肽。尽管已证明是原理性证明，但该传感机制简单、无标签、快速且经济，可以设计为便携式传感器芯片。首次报道将au插入具有原子精密度和灵活性的工程化的生物纳米孔中，这项技术可能有益于需要单分子精密度以及金[49,50]甚至其他金属元素的特性的广泛科学研究项目(如果设计合理)。方法材料十六烷、戊烷、乙二胺四乙酸(edta)、tritonx-100、genapolx-80和四氯金(iii)酸水合物(99.99％)和还原型l-谷胱甘肽获自sigma-aldrich。1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dphpc)获自avantipolarlipids。不含二恶烷的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)、硫酸卡那霉素、咪唑和三(羟甲基)氨基甲烷(tris)获自solarbio。4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(hepes)获自shanghaiyuanyebiotechnology(中国)。大肠杆菌菌株bl21(de3)获自biomed。lb肉汤和lb琼脂获自hopebio(中国)。盐酸(hcl)获自sinopharm(中国)。l-蛋氨酸、l-天冬酰胺、l-甘氨酸、l-半胱氨酸和l-谷氨酸获自bbilifesciences(中国)。l-高半胱氨酸获自j&kchemicaltechnology。用milli-q水制备氯化钾缓冲液(1.5mkcl，10mmtris-hcl，ph7.0)，并在使用前过滤膜(0.2μm，whatman)。将hplc纯化的ssdna(genescript，newjersey，表6)溶于milli-q水中，无需进一步纯化。将四氯金(iii)酸水合物溶解在milli-q水中作为原液(30mm)，用于随后的实验。将l-蛋氨酸、l-天冬酰胺和l-甘氨酸溶解在milli-q水中，作为原液(20mm)用于随后的实验。将l-半胱氨酸、l-天冬酰胺、l-甘氨酸、l-谷氨酸、l-高半胱氨酸和还原型l-谷胱甘肽溶解在氯化钾缓冲液中，终浓度为5mm，用于随后的实验。α-hl制备定制合成编码α-hlwt和α-hlm113g的基因，并构建在用于原核蛋白表达的pet30a(+)质粒(genescript，newjersey)中。如先前的发表[51]，七聚体α-hl经大肠杆菌bl21(de3)表达，并用镍亲和色谱法纯化。用编码α-hlwt或α-hlm113g的质粒基因进行热激转化后，将细胞在37℃的lb培养基中生长直至od600＝0.7。然后加入异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，使其终浓度为1mm，以进行诱导。在18℃振荡过夜后，通过离心(4000rpm，20min，4℃)收集细胞。收集沉淀并重悬于裂解缓冲液1(0.5mnacl，20mmhepes，1％tritonx-100，ph＝8.0)中，超声处理15min，然后离心(14,000rpm，4℃，40min)以去除完整的细胞。注射器过滤后，将上清液加到镍亲和柱(histraptmhp，gehealthcare)上。用缓冲液a1(0.5mnacl，20mmhepes，5mm咪唑ph8.0)洗涤色谱柱后，用咪唑线性梯度洗脱至缓冲液b1(0.5mnacl，20mmhepes，500mm咪唑，ph8.0)。用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳对目标级分进行进一步表征和确认(图3)。仅收集α-hl七聚体级分用于随后的电生理。mspa制备定制合成编码m2mspa(d93n/d91n/d90n/d118r/d134r/e139k)和mspa-m(d93n/d91m/d90n/d118r/d134r/e139k)的基因并构建在用于原核蛋白表达的pet30a(+)质粒(genescript,newjersey)中，如先前的发表[51]。用编码m2mspa或mspa-m的质粒基因进行热激转化后，将细胞在lb培养基中生长至od600＝0.7，用1mm异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导，并在16℃振荡过夜。通过离心(4000rpm，20min，4℃)收获细胞，并将沉淀重悬于裂解缓冲液2(100mmna2hpo4/nah2po4，0.1mmedta，150mmnacl，0.5％(w/v)genapolx-80，ph6.5)，并加热至60℃持续10min。将悬浮液在冰上冷却10min，并在4℃下以13,000rpm离心40min。注射器过滤后，将上清液加到镍亲和柱(histraptmhp,gehealthcare)上。用缓冲液a2(0.5mnacl，20mmhepes，5mmimidazole，0.5％(w/v)genapolx-80，ph＝8.0)洗涤色谱柱后，用咪唑线性梯度洗脱结合蛋白至缓冲液b2(500mm咪唑，0.5mnacl，20mmhepes，0.5％(w/v)genapolx-80，ph＝8.0)。收集mspa八聚体的级分，并通过12％sds-page进行表征(图7)，并直接用于电生理学测量。电生理记录和数据分析所有电生理学结果均由axopatch200b膜片钳放大器获得，并由digidata1550a1数字转换器(moleculardevices,uk)进行数字化。定制的测量室由带有孔的特氟龙薄膜(30μm厚)隔开。在使用前，将孔口用戊烷中的0.5％(v/v)十六烷进行预处理，然后风干以蒸发戊烷。1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dphpc)用于形成自组装的脂质双层，密封孔口。该脂质双层将室分为cis和trans隔室，两者均充满0.5ml的1.5mkcl缓冲液(1.5mkcl，10mmtris-hcl，ph7.0)。一对ag/agcl电极分别置于反应室的cis侧和trans侧，分别与水性缓冲液接触。将生物纳米孔(wtα-hl、α-hlm113g、m2mspa或mspa-m)加入至trans侧以自发形成孔插入。对于[aucl4]-结合实验，采集的单通道数据以25khz采样，并以1khz的转折频率进行滤波。对于[aucl4]-结合事件，使用200hz低通bessel滤波器(八极)对记录的电流轨迹进行数字滤波，并通过clampfit10.7(axoninstruments)中的单通道搜索特性检测到该事件。对于ssdna移位实验，以250khz采样数据并以100khz的转折频率进行过滤。对于ssdna移位事件，使用10khz低通bessel滤波器(八极)对记录的电流轨迹进行数字滤波，并通过clampfit10.7(axoninstruments)中的单通道搜索特性检测到该事件。在origin9.1(originlab)中进行进一步分析(直方图、曲线拟合和制图)。对于l-蛋氨酸的特异性传感，以25khz采样数据，并以1khz的转折频率进行滤波。通过clampfit10.7中的单通道搜索特性检测到事件状态1-3。在origin9.1中进行进一步分析。对于l-谷氨酸、l-高半胱氨酸和l-谷胱甘肽的特异性传感，所有测量在+100mv连续施加电压下进行。采集的单通道数据以25khz采样，并以1khz的转折频率进行滤波。使用0.2khz低通bessel滤波器(八极)对记录的电流迹线进行数字滤波。事件状态通过clampfit10.7中的单通道搜索特性进行检测，并在origin9.1(originlab)中进行进一步分析(直方图、曲线拟合和制图)。参考文献1.jain,m.,olsen,h.e.,paten,b.&akeson,m.theoxfordnanoporeminion:deliveryofnanoporesequencingtothegenomicscommunity.genomebiology17,239(2016).2.cao,c.etal.discriminationofoligonucleotidesofdifferentlengthswithawild-typeaerolysinnanopore.naturenanotechnology11,713-718(2016).3.laszlo,a.h.etal.decodinglongnanoporesequencingreadsofnaturaldna.naturebiotechnology32,829-833(2014).4.manrao,e.a.etal.readingdnaatsingle-nucleotideresolutionwithamutantmspananoporeandphi29dnapolymerase.naturebiotechnology30,349-353(2012).5.wallace,e.v.etal.identificationofepigeneticdnamodificationswithaproteinnanopore.chemicalcommunications46,8195-8197(2010).6.ayub,m.,hardwick,s.w.,luisi,b.f.&bayley,h.nanopore-basedidentificationofindividualnucleotidesfordirectrnasequencing.nanoletters13,6144-6150(2013).7.sutherland,t.c.etal.structureofpeptidesinvestigatedbynanoporeanalysis.nanoletters4,1273-1277(2004).8.nivala,j.,marks,d.b.&akeson,m.unfoldase-mediatedproteintranslocationthroughanα-hemolysinnanopore.naturebiotechnology31,247-250(2013).9.song,l.etal.structureofstaphylococcalα-hemolysin,aheptamerictransmembranepore.science274,1859-1865(1996).10.braha,o.etal.designedproteinporesascomponentsforbiosensors.chemistry&biology4,497-505(1997).11.mayne,l.j.,christie,s.d.r.&platt,m.atunablenanoporesensorforthedetectionofmetalionsusingtranslocationvelocityandbiphasicpulses.nanoscale8,19139-19147(2016).12.braha,o.etal.simultaneousstochasticsensingofdivalentmetalions.naturebiotechnology18,1005-1007(2000).13.choi,l.s.,mach,t.&bayley,h.ratesandstoichiometriesofmetalionprobesofcysteineresidueswithinionchannels.biophysicaljournal105,356-364(2013).14.hammersteinanne,f.,shin,s.h.&bayley,h.single-moleculekineticsoftwo-stepdivalentcationchelation.angewandtechemieinternationaledition49,5085-5090(2010).15.wen,s.etal.highlysensitiveandselectivedna-baseddetectionofmercury(ii)withalpha-hemolysinnanopore.journaloftheamericanchemicalsociety133,18312-18317(2011).16.roozbahani,g.m.etal.peptide-mediatednanoporedetectionofuranylionsinaqueousmedia.acssensors2,703-709(2017).17.guo,y.,jian,f.&kang,x.nanoporesensorforcopperiondetectionusingapolyaminedecoratedβ-cyclodextrinastherecognitionelement.rscadvances7,15315-15320(2017).18.sun,y.&xia,y.mechanisticstudyonthereplacementreactionbetweensilvernanostructuresandchloroauricacidinaqueousmedium.journaloftheamericanchemicalsociety126,3892-3901(2004).19.shankar,s.s.,rai,a.,ahmad,a.&sastry,m.rapidsynthesisofau,ag,andbimetallicaucore–agshellnanoparticlesusingneem(azadirachtaindica)leafbroth.journalofcolloidandinterfacescience275,496-502(2004).20.williams,j.m.&peterson,s.w.exampleofthe[h5o2]+ion.neutrondiffractionstudyoftetrachloroauricacidtetrahydrate.journaloftheamericanchemicalsociety91,776-777(1969).21.niemietz,c.m.&tyerman,s.d.newpotentinhibitorsofaquaporins:silverandgoldcompo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