通过红外吸收的宽场光热传感的超快化学成像的制作方法

通过红外吸收的宽场光热传感的超快化学成像
1.相关申请
2.本技术要求于2018年12月10日提交的，申请号为62/777,421的美国临时申请的优先权，其通过引用完全并入本文。
技术领域
3.本文公开的实施例涉及通过使用光学手段(即，使用红外光、可见或紫外光)对材料进行研究或分析。更具体地，实施例涉及在基板上的光热效应的快速检测，其促进跨宽场的热反射率的测量以进行化学键分析。


背景技术：

4.振动成像方法基于化学键的光谱特征为表征样品提供了新窗口。拉曼光谱和红外(ir)光谱长期以来一直用于通过探测分子振动而无需外源标记来检验材料。
5.自发的拉曼显微技术提供亚微米空间分辨率成像能力，但受到低采集率的影响。随着相干拉曼散射技术的出现，视频率(video
‑
rate)成像速度已被证明可以表征生物和药物样品。然而，极小的拉曼截面(10
‑
30
cm2sr
‑1)的检测限制了灵敏度。
6.红外吸收提供了更大的截面(10
‑
22
cm2sr
‑1)，可实现足够的灵敏度。傅里叶变换红外(ftir)光谱仪及其衰减全反射附件是该技术的典型仪器，并且已广泛应用于从高分子科学、制药到生物研究等领域。将焦平面阵列检测器耦合到ftir系统允许同时获取空间分辨光谱，极大地提高了用于非均匀样品的表征的通量。与基于干扰度量法和低亮度碳化硅棒激发进行操作的传统ftir仪器不同，离散ir光谱成像技术利用具有更高的每波数光子通量的可调谐量子级联激光器(qcl)，实现实时红外成像。然而，中红外区域中的长入射波长将空间分辨率限制在几到几十微米，这不足以解析微结构，例如在生物细胞中的微结构。
7.为了解决分辨率问题，近场方法通过将原子力显微技术(afm)与ir光谱相结合，提供了超越基本限制的方法，其中由于中红外光的吸收引起的表面热膨胀，afm悬臂改变振荡幅度。通过记录振幅变化同时扫描中红外光源的波长以获得纳米级定位的光谱。凭借提供高空间分辨率化学映射的能力，afm
‑
ir已成为研究域尺寸通常为数十纳米的嵌段共聚物系统的重要工具。这种技术共有低采集速度的基于尖端的成像形式的固有缺点。此外，虽然一些工作表明使用ir棱镜的全内反射来研究水相环境中的样品以最小化水的影响的能力，但复杂的设置和数据处理程序使其不适合常规使用。
8.期望进行带有增强的分辨率的超快化学成像，在一些实施例中其还能够在水相环境中使用，但是上述解决方案都不能实现该结果。


技术实现要素：

9.根据实施例，用于检测样品中的光热效应的系统包括配置为产生泵浦脉冲序列的泵浦源、配置为产生与泵浦脉冲序列同步的探测脉冲序列的探测源、以及相机。相机配置为收集对应于热帧的第一信号，其中热帧包括由泵浦光束修改的探测光束的脉冲；以及收集
对应于冷帧的第二信号，其中冷帧包括未经泵浦光束修改的探测光束的脉冲。系统还包括配置为从第一信号确定第二信号以检测光热效应的处理器。
10.根据另一实施例，一种用于检测样品中的光热效应的方法包括提供泵浦脉冲序列、提供与泵浦脉冲序列同步的探测脉冲序列、收集对应于热帧的第一信号(其中热帧包括由泵浦光束修改的探测光束的脉冲)、收集对应于冷帧的第二信号(其中冷帧包括未被泵浦光束修改的探测光束的脉冲)、以及从第一信号确定第二信号以检测光热效应。
11.以上概述并非旨在描述其主题的每个图示实施例或每个实施方式。下面的附图和详细描述更具体地举例说明了各种实施例。
附图说明
12.结合附图考虑各种实施例的以下详细描述，可以更完整地理解本文的主题，其中：
13.图1是根据实施例的用于快速的宽场光热感测(wps)的系统的示意图。
14.图2a是根据实施例的更通用的wps系统的框图。
15.图2b是使用2a中描绘的系统获取的数据的处理的示意图。
16.图3描绘了四个时间延迟t1、t2、t3和t4下的特定样品的成像。
17.图4a
‑
4f描绘了聚合物膜和珠子的wps成像图案。
18.图5a
‑
5f示出了在散粒噪声极限处纳米级薄膜的超快化学成像。
19.图6a
‑
6d示出了根据实施例的使用wps显微镜的活细胞成像。
20.图7是根据实施例的基板上的样品的示意图。
21.虽然各种实施例可适用于各种修改和替代形式，但其细节已通过在附图中的示例示出并将详细描述。然而，应当理解，其意图不是将要求保护的发明限制于所描述的特定实施例。相反，意图是覆盖落入由权利要求限定的主题的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
具体实施方式
22.本文中描述的实施例解决了提高分辨率、跨越宽场样品并且可在水性环境中使用的问题。在各种实施例中，非接触式探针(例如，可见激光器)可以减少样品制备的限制，并提供更高的成像速度。我们开发了一种中红外光热(mip)显微镜，该显微镜使用可见激光探测样品中的ir吸收引起的热透镜效应，提供具有亚微米分辨率和深度分辨率的化学成像能力，填补了ftir显微技术和afm
‑
ir显微技术之间的空白。当ir波长被调谐到样品的吸收峰时，由于热诱导的局部折射率变化，共同传播的探测光束将改变其分散度。该技术已成功用于展示活细胞和生物体的化学选择性成像。对于不透明的样品，后向检测光热显微技术可以促进活性药物成分和药片赋形剂的化学映射。
23.在以下公开内容中，提供了宽场光热感测(wps)显微技术，其允许以高达每秒1250帧的速度进行超快化学成像。为了实现红外吸收的高通量检测，需要多元素光电探测器(例如相机)。然而，通用相机的速度不足以分辨微秒级(即每秒一百万帧)的瞬态热过程。为了使用常规相机实现高时间分辨率，展示了使用脉冲光的时间门控检测来映射集成电路中的电子电流。此概念可用于构建虚拟锁定(lock
‑
in)相机，其中帧以具有精确控制的时间延迟的相同重复率同步于探测脉冲和ir脉冲。在实施例中，一种方法能够使用常规相机对瞬态
热过程进行时间分辨成像，其时间分辨率由探测脉冲宽度确定。
24.在另一个实施例中，为了能够高效地将ir激光传送到样品并将探测光子反射到相机，使用硅片作为基板(因为硅片在ir窗口中的透明度和对可见光波长的高反射率)。硅基板通过加速散热来进一步增强wps信号。与其他ir透明材料，例如caf2(10wm 1k 1)相比，硅具有高导热性(150wm 1k 1)，可避免热量积聚并且允许更快的成像。总而言之，这些实施例能够超快检测宽场方式的ir诱导的光热信号。
25.图1是根据实施例的用于快速宽场成像的系统100的示意图。如图1所示，系统100包括产生光束104的纳秒中红外激光器102，该光束104被发射通过光学斩波器106并微弱地聚焦在样品108上。通过caf2板p对ir光束104部分采样并发送到碲镉汞(mct)检测器110。
26.同时，探测光束112由450nm型led 114提供，其通过4
‑
f透镜系统和50:50分束器(bs)成像到成像物镜116的后孔。样品反射光由物镜116收集并发送到具有相应管透镜的图像传感器118。金镜gm、离轴抛物面镜oapm和透镜l协作以将探测光束112和泵浦光束104引导到适当的位置。
27.虽然本领域的普通技术人员将理解可以使用各种替代方案，但图1中所示的泵浦源由中红外光学参量振荡器(firefly
‑
lw，m
‑
squared激光器)提供，重复率为20khz，脉冲宽度为约34ns，可调范围为1175至1800cm
‑
1(8.51m至5.56m)，在指纹区域。caf2板可用于截取一部分ir光束并将其发送到碲镉汞(mct，pvm
‑
10.6，vigo系统)检测器。由于传统相机不具有足够的快门速度来捕捉每个单脉冲响应，因此添加了光学斩波器(mc2000b
‑
ec，thorlabs)以调制泵浦脉冲，如与图1中相应光束104和114相邻描绘的泵浦脉冲序列和探测脉冲序列的示意图所示。
28.在此特定实施例中(如脉冲序列示意图中所描绘的)，泵浦脉冲被调制为八个脉冲开启，随后八个脉冲关闭。图1的斩波器因此在1250hz下工作，且占空比为50％。在替代实施例中，使用具有标准快门速度的常规可用相机，占空比的频率可以在大约25％到75％之间的任何地方。为了减少斩波器叶片边缘处脉冲的上升和下降时间，可以使用焦距约为101.6mm的镀金离轴抛物面镜(oapm)以将泵浦光束聚焦在叶片上。可以为适中的焦点尺寸和简单调整选择合适的焦距，如果未对准，则考虑强像散。设置另一个具有相同焦距的oapm用于校准ir光束。调制的泵浦光束由金镜引导，随后使用caf2弯月透镜将其微弱地聚焦在样品上。使用旋涂法将不同的样品压印在硅片上。
29.可见探测光束可以由在脉冲操作模式(uhp
‑
t
‑
sr，prizmatix)下工作的高功率发光二极管(led)提供。在替代的实施例中，可以使用其他光源。由于热扩散过程的瞬态性质，led输出能够以亚微秒水平跳动以获得时间解析信号。在图1所示的实施例中，led的中心波长为450nm，光谱宽度为22.6nm，但在替代的实施例中，led114的中心波长和光谱宽度可以是不同的波长和宽度。图1所示的led 114通过一对4
‑
f透镜和50:50平板分束器在物镜(slmpln olympus，20x，na 0.25，440leica，40x，na 0.66)的后焦平面上成像，但是本领域普通技术人员将认识到可以使用替代的物镜和相机。可通过平行光束对样品进行照射，并且20x物镜的视场为136μm
×
108.8μm。样品反射的光可以由相同的物镜收集并通过分束器返回，以由管透镜系统在互补金属氧化物半导体(cmos、il5、fastec imaging)上成像。在一个实施例中，在上述视场下，相机快门速度可以设置为每秒2500帧。
30.图2a是更通用的wps系统200的框图。mct检测器202用于捕捉ir激光脉冲以在ir激
光的重复频率下生成主时钟频率f，从而触发函数发生器204，该函数发生器204将方波触发发送至相机206、斩波器208和led 210。相机206的内部的分频器设置为以每秒f/8帧的速度曝光。斩波器208将触发脉冲除以16以调制泵浦源(见图1)。计算机212用于控制相机206并存储数据。
31.图2b是使用大致在图2a中描绘的系统获取的数据的处理的示意图。如图2b所示，中红外泵浦信号214和可见探测信号216以协调脉冲施加到样品。在每个特定脉冲内(例如，脉冲π)，样品通过短暂暴露到中红外泵浦源而被加热，如箭头指示的分解图所示。在脉冲π期间，可见探测信号受样品加热的影响。
32.如向下的箭头所示，相机曝光在第一组八个脉冲π上捕获净可见信号(在图2b中表示为“热帧”)，而第二次相机曝光在第二组八个脉冲π上捕获净可见信号(在图2b中表示为“冷帧”)。这两次净曝光之间的差异220提供了样品内净光热效应的指示。
33.由于对两种状态之间的差异进行测量，因此时序控制对于该技术的各种实施例至关重要。如果泵浦脉冲和探测脉冲没有相互锁定，相机将捕获随机脉冲数目或处于不同热弛豫状态的脉冲，这可能会导致测量结果不正确。
34.在图2a和图2b的一个实施例中，mct检测器直接从ir激光端口捕获中红外脉冲序列作为时钟，并且mct检测器的输出连接到双通道函数发生器(afg1062，tektronix)作为外部触发器。一个通道用作led触发器，而另一个则用于同步相机和光学斩波器。这两个通道设置为生成方波(其频率与激光重复率相等)和针对不同实验条件可调整的脉冲宽度。单个中红外脉冲与其后续可见脉冲之间的相对时间被定义为时间延迟，这是泵浦探测技术中的常用符号，并且可以通过改变函数发生器输出相对于外部触发输入的相位延迟从而控制时间延迟。相机提供可在2500hz以下以20khz外部触发频率进行曝光的分频功能。此外，光斩波频率被锁定为相机曝光周期。
35.为了验证时序配置，在光斩波器之后安装了另一个mct检测器来监控泵浦，并将si pin光电二极管耦合到探测光束路径中。使用图2b中所示的示波器记录一组示例波形。使用示波器预先测量泵浦探测延迟并将其作为后续实验的参考。使用标记有度数的相位移动的函数发生器调制该延迟。整个360
°
的周期对应于50μs的泵浦脉冲周期。
36.在一个实施例中，八个可见脉冲中的每一个都触发相机开始曝光新帧，因此每个捕获的帧都是同步的并且恰好包含八个可见脉冲。这种锁定检测方案是准确数据采集的基础。由于温度会因吸收而升高，因此具有中红外脉冲的图像被定义为“热”帧，而没有中红外脉冲的图像被定义为“冷”帧。因此，最终的图像堆栈是热帧和冷帧之间的差异220，其显示了泵浦和探测延迟的放大图像。通过变换延迟，映射了热耗散曲线。
37.图3描绘了在四个时间延迟t1、t2、t3和t4处的特定样品的成像。用于生成图3所示图像的样品是486纳米厚的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)样品。
38.为了表征时间分辨率，在硅基板上的pmma膜上进行了时间分辨wps成像。将ir泵浦调谐到1728cm
‑
1，即pmma中的c＝o吸收峰。探测宽度为914ns，并且以2hz的速度捕获每幅图像。样品处的泵浦功率和探测功率约为5.1mw和1.6mw。通过用前述图2a和2b中的热帧减去冷帧，获得了各种延迟下的wps成像。在时间延迟t1、t2、t3、和t4中视场中心的亮点对应于弱聚焦的ir点。每个图像中心的信号强度用于绘制wps信号的时间脉冲波形，时间延迟范围为
‑
0.97μs到3.89μs。数据点良好地拟合成表明快速冷却时间的指数衰减e
‑
t/τ
，其中t是时
间延迟且τ＝1.1μs是衰减常数。注意，衰减常数不应与时间分辨率混淆，时间分辨率在wps中由探测脉冲宽度(即914ns)决定，受led限制。
39.在各种实施例中，可以提高我们的wps显微镜的光谱保真度。泵浦波长在固定的时间延迟下扫描，wps信号在该时间延迟下是最大的。原始光谱由泵浦功率归一化。曲线是使用商用ftir光谱仪测量的参考ftir光谱。如图3所示，两个测量之间获得了良好的一致性。
40.为了评估空间分辨率，进行了如图4a
‑
4f所示的聚合物膜图案和珠子的wps成像。图4a示出了图案的反射图像，其中蚀刻掉的部分显示出更高的反射率。图4b示出了相同区域的wps图像。图4c示出了沿图4b中的线的强度分布的一阶导数(以方形形式)。高斯拟合(红线)显示0.51μm的fwhm。
41.图4d示出了1μm pmma颗粒的反射图像。图4e示出了泵浦在1728cm
‑
1下的相同区域的wps图像。图4f示出了没有对比度的非共振图像。
42.图4a
‑
4c的“mip”字母是使用电子束光刻法从约310nm厚的pmma膜上蚀刻掉的，与其余区域相比，裸露的硅显示出更高的反射率。宽场反射图像如图4a所示。字母“i”的宽度为2μm，长度为10μm。图案的wps成像是在0.5秒内用冷帧减去热帧获得的，在蚀刻边界处显示出清晰的对比度(图4b)。提取了沿线的强度分布，如图4b所示。九条相邻线被平均以执行一阶求导(图4c)。使用0.66na物镜和450nm照明的光学分辨率的理论值计算为0.42μm。高斯拟合结果显示了0.51μm的半峰全宽(fwhm)，表明与计算值一致的亚微米分辨率。
43.为了测试wps显微镜的检测极限，使用固定的泵浦探测延迟在不同厚度下测量wps信号。结果为，最小可检测厚度约为159nm，与典型的共焦拉曼显微技术相比大约小一个数量级。值得注意的是，检测极限可与afm
‑
ir技术比较，并且可以通过耦合低噪声相机来提高检测极限。
44.为了证明微粒成像的能力，对1μm的pmma珠子进行了wps成像。硅片上珠子的反射图像如图4a所示。尽管系统的放大倍数没有针对这样的小颗粒进行很好地优化，但图像对于每个珠子仍然具有足够的像素。使用平均为0.5秒的信号获得相同区域的wps成像(图4b)。单个珠子在1728cm
‑
1的pmma c＝o峰下清晰分辨，而在1808cm
‑
1的偏共振波长下没有显示对比度(图4e、f)。此处，为保持一致性，wps成像使用相同的设置。请注意，视场仅为图4a
‑
c中先前的“mip”图案的四分之一，这在不改变仪器的情况下为成像速度潜在地提供了四倍增长。
45.图5示出了在散粒噪声极限处纳米级薄膜的超快化学成像。使用厚度为100μm的双侧抛光硅片作为薄膜和图案成像的基板。在旋涂工艺之前，通过溶剂冲洗的多个步骤清洗硅片，以甲苯、丙酮、异丙醇和去离子水，随后是o2等离子体(300sccm o2流速，300w和15分钟)的顺序。为了制造pmma薄膜，将pmma 950a4溶液以1000rpm/s的速度旋涂到清洁的硅片上45秒。在180℃下软性烘烤处理5分钟后，使用椭圆计测量薄膜厚度。为了制作图案，将pmma950a4溶液以4000rpm/s的速度旋涂到硅片上45秒，以获得电子束抗蚀剂层。在180℃下软性烘烤处理5分钟后，使用配备有电子束消隐装置的zeiss supra 40vp sem，通过电子束光刻法在pmma层上制作“mip”图案，并随后使用甲基异丁基酮/异丙醇溶剂混合物(体积为1:3)进行显影。
46.展示了薄pmma膜(约486nm)的wps成像，并评估了作为成像速度的函数的信噪比(snr)。在410毫秒内共捕获了1054帧(即每帧曝光时间为0.39毫秒)，视场为136μm
×
108.8μ
m。这导致每秒1250帧的wps成像速度。对于噪声测量，在泵浦关闭的情况下进行了参考实验。因此，减去的结果是来自相机的纯粹的噪声和探测光子的波动。snr是从中心区域(25个像素)通过信号和参考之间的平均差异与噪声标准偏差的比率计算的。图5a示出了来自时间轨迹的单个帧，计算出的snr为2.3。值得注意的是，单帧化学图像仅基于八个ir泵浦脉冲。为了进一步提高snr，使用帧平均值作为成像速度的折中(图5b
‑
e)。测量和计算每一帧的snr，并将结果与幂函数拟合(图5f)。实线是不同累积帧的拟合结果。指数项为0.48，接近理论极限0.5，表明该设置已针对在散粒噪声极限附近工作进行了优化。信号强度在0.42秒的记录期间相对稳定，表明没有样品损坏或光漂白的迹象。
47.图6示出了由根据实施例的wps显微镜进行的活细胞成像。图6所示的skvo3细胞在双抛光硅片上培养24小时。洗去细胞培养基并用pbs冲洗2次后，将细胞移至显微镜进行立即成像。
48.为了证明wps显微技术对生物样品的能力，对活的skvo3人类卵巢癌细胞进行了wps成像。图6a示出了反射明场图像，显示了细胞核周围有脂滴的细胞。在1744cm
‑
1下的wps图像显示了脂滴的分布，其中单个液滴与反射图像共定位，并且在细胞核区域没有出现明显的信号(图6b)。通过将ir调整到蛋白质酰胺i带的1656cm
‑
1，蛋白质含量出现在图6c中的对比度中。与脂滴相比，蛋白质更均匀地分布在细胞中。在此波长下有一些残留的水吸收，由于细胞外的介质区域没有显示出对比度，因此没有被观察到。与水缺乏对比是由于水的热容量大，导致温度变化很小。因此，当将ir调谐到1808cm
‑
1处的偏共振波长时，没有观察到对比(图6d)。为了仪器的一致性，使用相同的视场进行细胞成像，速度为2hz。为了更好的可视化，最终图像被裁剪为40μm
×
40μm。总之，这些数据突出了对活细胞内化学成分进行高速成像的能力。
49.在各种实施例中，wps显微镜用通过锁定检测的相机来探测热诱导的反射率变化。通过同步于用调制的ir泵浦和脉冲可见探测的帧捕获，使热耗散的时间分辨映射成为可能。鉴于亚微秒时间分辨率、超快化学成像速度(高达每秒1250帧)和亚微米空间分辨率的结果，这些技术可以提供使用无运动模糊观察进行研究高动态过程的新方法。各种实施例可以为用于从制药工业到细胞生物学的领域的无试剂、高通量筛选打开一扇门。另一个潜在的应用是根据信号水平和衰减速度区分样品的化学和形态特征，这与吸收系数等属性直接相关。
50.wps系统的性能仍然有很大的提升空间。为了进一步提高成像速度，可以采用具有高井深度像素的相机。由于wps信号来自强直流背景之上的小交流信号，因此增加图像传感器的满井位能有助于减少平均时间。当前的相机提供58db的动态范围，满井位能为19ke
‑
，暗噪声为23e
‑
。例如，商用相机(q
‑
2hfw
‑
cxp，adimec)具有200万的满井位能和63db的动态范围，可以用于保持相同的snr水平的同时将速度提高10倍。此外，可以应用去噪方法进一步去除x
‑
y
‑
时间数据立方体中的噪声。
51.在一个实施例中，可以使用反向传播来检测薄的或相对透明的样品的特性。为了拓宽应用范围，可以使用共同传播方案，其中ir和可见光束向同一方向传播，为厚样品留出空间。之前在后向检测mip中的工作已经展示了与共享物镜的ir和可见光束共同传播的实现。为了分离ir和可见的光学元件，ir光束的倾斜照明是有吸引力的选择。
52.对于生物或药物环境中纳米尺寸的颗粒的化学图像，可能需要对基材和嵌入介质
进行严格的设计。si和sio2结构的双层基板已成功用于干涉反射成像传感器，以探测生物量积累和单个病毒。因此，通过比较热态和冷态的干扰强度，可以潜在地绘制具有化学特异性的生物纳米颗粒。
53.图7是包括布置在基板704上的样品702的系统700的简化截面图。如上所述，基板提供优于常规系统的额外优点：其由相对便宜的材料(例如，硅)制成、易于制造、并且具有为光热光谱提供益处的光学和机械特性。
54.图7进一步描绘了入射在样品702上的红外光束706和可见光束708。在交叉点710处，红外光束706和可见光束708交叉，并且可通过返回的可见光束708的偏转来检测可测量的光热效应。在传统的系统中，返回的光可能包括可见信号和红外信号，并且难以分离这些信号或者会给测量带来误差。然而，因为基板704由对红外光几乎透明的材料制成，所以该信号在很大程度上不返回。
55.类似地，如果传统系统中的基板704对可见光是透明的，则返回的信号将不包括一些关于光热效应的期望响应信息。硅和其他对可见光具有高反射性的材料的优势在于信号不会以这种方式丢失。
56.基板704布置在交叉点710附近，使得光热信号不会丢失，同时不需要的红外光和热量通过基板704从交叉点710传输出去。基板704可由具有高导热率的材料制成，这提高了可测量的光热效应的循环速度。
57.本文中已经描述了系统、设备和方法的各种实施例。这些实施例仅通过示例的方式给出并且不旨在限制要求保护的发明的范围。此外，应当理解，已经描述的实施例的各种特征可以以各种方式组合以产生许多额外的实施例。此外，虽然已经描述了公开的实施例使用的各种材料、尺寸、形状、构造和位置等，但是可以在不超出要求保护的发明的范围的情况下利用除了公开的那些之外的其他材料。
58.相关领域的普通技术人员将认识到，本文的主题可以包括比上述任何单独实施例中示出的特征更少的特征。本文中描述的实施例并不意味着可以将其主题的各种特征组合的方式的详尽呈现。因此，实施例不是相互排斥的特征组合；相反，如本领域普通技术人员所理解的，各种实施例可以包括选自不同单独实施例的不同单独特征的组合。此外，参照一个实施例描述的元件可以在其他实施例中实现，即使在这样的实施例中没有描述，除非另有说明。
59.尽管从属权利要求在权利要求中可以指与一个或多个其他权利要求的特定组合，但其他实施例还可以包括从属权利要求与每个其他从属权利要求的主题的组合，或者一个或多个特征与其他从属或独立权利要求的组合。在本文中提出了这些组合，除非声明了特定的组合是不期望的。
60.对以上文件的任何引用并入都受到限制，使得没有与本文明确公开内容相反的主题被并入。对以上文件的任何引用并入进一步受到限制，从而没有包括在文件中的权利要求通过引用并入本文。对以上文件的任何引用并入还受到进一步限制，使得文件中提供的任何定义不通过引用并入本文，除非明确包括在本文中。
61.为了解释权利要求，除非在权利要求中列举了特定术语“手段”或“步骤”，否则不应援引35u.s.c.
§
112(f)的规定。