包括尸胺嗅觉受体的石墨烯通道构件及包括其的传感器

1.本发明涉及包括尸胺嗅觉受体的石墨烯通道构件和包括其的传感器。


背景技术：

2.传统的肉类新鲜度的辨别平台是基于金属氧化物薄膜或纳米材料通过物理吸附来监测电阻变化的方法，所述金属氧化物薄膜或纳米材料具有用于检测小分子(small molecules：氢、乙醇、氨、甲醇、甲苯等)的合适结构，但是目前存在如下限制。
3.1.选择性——由于通过物理吸附对电阻变化的监测，在相同浓度下，材料a和材料b都可以反应，但是在不同浓度下(在过量材料b的情况下)，尽管材料a具有相对较高的灵敏度，但是却监测到材料b的反应性增加。
4.2.肉类新鲜度的间接辨别——如果肉类实际腐败了，产生的气体包括尸胺(cadaverine)和腐胺(putrescine)，但是这些是超分子(supermolecular)材料，而通过常规的基于物理吸附的平台绝对没有反应。因此，传统平台的局限性在于，它必须检测氨、甲苯等作为间接测量。
5.目前研究人员团队对检测尸胺的常规先例研究首次报道了碳纳米管与尸胺受体的组合(park,taehyeon,et al.,acs nano,2017,11,11847
‑
11855)。碳纳米管的检测限为10pm，但是电极上装上的碳纳米管的量不是恒定的，并且实验结果的不充分再现性成为商业化之路中的障碍。因此，为了克服这些问题，需要能够替代碳纳米管的下一代纳米材料。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明用于克服传统的肉类新鲜度检测器的上述限制，并通过使用包括石墨烯膜和固定到所述石墨烯膜的尸胺嗅觉受体(taar13c)的石墨烯通道构件提供具有再现性和高灵敏度的传感器。
8.技术方案
9.本发明提供了一种石墨烯通道构件，包括石墨烯膜和固定到所述石墨烯膜的尸胺嗅觉受体。
10.另外，本发明提供一种石墨烯晶体管，包括：基板；石墨烯通道构件；及一对电极。
11.此外，本发明提供了一种包括所述石墨烯晶体管的生物传感器。
12.有益效果
13.在使用石墨烯膜和固定到本发明的石墨烯膜的尸胺嗅觉受体(痕量胺相关受体13c(trace amine
‑
associated receptor 13c，taar13c))作为石墨烯晶体管的情况下，可以提高肉类腐败期间产生的尸胺的检测限，并可实现高灵敏度和再现性的检测效果。
14.特别是，与使用尸胺受体结合碳纳米管的常规传感器相比，可以实现优异的检测效率、检测限和再现性、以及可以实现同时检测气相尸胺和液相尸胺的效果。
15.此外，包括本发明的石墨烯通道构件的石墨烯晶体管可以以usim芯片类型制造，
并应用于小型化生物传感器(便携式电子气体传感器等)，并可实现非常简单和准确地辨别肉类新鲜度的效果。
附图说明
16.图1示出了根据本发明的一个实施方案的石墨烯晶体管。
17.图2示出了根据本发明的一个实施方案的精细图案化的石墨烯膜。
18.图3示出了本发明的制造实例1中表达且纯化的尸胺嗅觉受体的凝胶染色(gel staining)和western印迹(western blot)分析结果。
19.图4示出了本发明的实验例1的实施例2的石墨烯晶体管的尸胺的检测限的测定结果。
20.图5示出了根据本发明实验例2用肉眼观察牛肉腐败程度的照片。
21.图6示出了用本发明的实验例2的实施例2的石墨烯晶体管检测从牛肉产生的尸胺的检测结果。
22.图7示出了本发明的实验例3的实施例2的石墨烯晶体管的尸胺选择性的评价结果。
23.图8示出了no2、vbn和voc检测器中所示的结果，这些检测器可以在根据本发明实施例的生物传感器中商业化。
24.图9是根据本发明的一个实施方案的包括石墨烯晶体管的生物传感器的示意图。
25.图10示出了制造实例2的卡宾化合物1的1h
‑
nmr谱。
26.图11示出了制造实例3的卡宾化合物2的1h
‑
nmr谱。
27.图12示出了制造实例4的卡宾化合物3的1h
‑
nmr谱。
28.图13示出了制造实例5的卡宾化合物4的1h
‑
nmr谱。
29.图14示出了制造实例6的卡宾化合物5的1h
‑
nmr谱。
30.图15示出了使用比较实验例1的比较例1的石墨烯晶体管的尸胺检测限的测定结果。
具体实施方式
31.以下，将详细描述本发明。
32.1.石墨烯通道构件
33.本发明提供了一种石墨烯通道构件，包括石墨烯膜和固定到所述石墨烯膜的尸胺嗅觉受体。
34.所述尸胺嗅觉受体可与液相尸胺和/或气相尸胺反应。
35.所述尸胺嗅觉受体可包括痕量胺相关受体13c(taar13c)。taar13c是斑马鱼(zerafish)痕量胺相关受体之一，对尸胺会非常敏感的反应。
36.所述尸胺嗅觉受体既可以通过物理键固定在石墨烯膜的表面，也可以通过化学键固定。
37.特别地，通过物理键将尸胺嗅觉受体固定到石墨烯膜的表面上可以是通过物理吸附固定。在这种情况下，尸胺嗅觉受体可以通过物理吸附固定至石墨烯膜的表面，无需单独的接头。例如，在处理到石墨烯膜的表面之后，可以通过在约1至10℃的温度条件下反应12
至48小时的物理吸附方法来固定尸胺嗅觉受体。
38.或者，通过化学键将尸胺嗅觉受体固定到石墨烯膜的表面可以是通过包括由如下式1或式2表示的卡宾化合物作为接头的键合(固定)。即，卡宾化合物可以扮演将尸胺嗅觉受体化学固定到石墨烯膜的介质的角色。在使用这种卡宾化合物作为接头，并将尸胺嗅觉受体固定至石墨烯膜的情况下，在获得对外界环境变化的优异稳定性方面存在优势。
39.[式1][式2]
[0040]
在式1和式2中，
[0041]
r1、r2、r5和r6相同或不同，并各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、或2至30个碳原子的杂芳基，
[0042]
r3、r4、r7、r8、r9和r10相同或不同，并各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、2至30个碳原子的杂芳基，或由如下式3表示的结构，或者r7至r10中的两个或更多个相邻取代基结合形成烃环，
[0043]
r3和r4中至少一个是如下式3所示的结构，且
[0044]
在r7至r10中至少一个具有如下式3所示的结构或r7至r10中两个或多个相邻取代基结合形成烃环的情况下，与形成烃环的碳键合的至少一个氢被下式3所示的结构取代，
[0045]
[式3]
[0046]
在式3中，
[0047]
n是括号内单元的重复数，且是1至30的整数，且
[0048]
a是包括氮(n)原子的1至20个碳原子的烷基，或包括氮(n)原子的2至30个碳原子的杂芳基。
[0049]
r1、r2、r5和r6可以相同或不同，并可各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基或6至30个碳原子的芳基。
[0050]
r1、r2、r5和r6可以相同或不同，并可各自独立地为氢、1至10个碳原子的烷基或6至10个碳原子的芳基。
[0051]
r1、r2、r5和r6可以相同或不同，并可各自独立地为氢、或1至10个碳原子的烷基。
[0052]
r1、r2、r5和r6可以相同或不同，并可各自独立地为氢、异丙基或苄基。
[0053]
r1和r2中至少一个与r5和r6中至少一个可以相同或不同，并可各自独立地为1至20个碳原子的烷基或6至30个碳原子的芳基。
[0054]
r1和r2中至少一个与r5和r6中至少一个可以相同或不同，并可各自独立地为异丙基或苄基。
[0055]
r3、r4、r7、r8、r9和r10可以相同或不同，并可各自独立地为氢、1至20个碳原子的烷基、3至20个碳原子的环烷基、6至30个碳原子的芳基、2至30个碳原子的杂芳基或式3所示的结构，或者r7至r10中的两个或多个相邻取代基可以结合形成烃环。
[0056]
r3、r4、r7、r8、r9和r10可以相同或不同，并可各自独立地为氢、或式3所示的结构，
或者r7至r10中的两个或更多个相邻取代基可以结合形成烃环。
[0057]
在r7至r10中两个或多个相邻取代基结合形成烃环的情况下，至少一个与形成烃环的碳键合的氢可被式3所示的结构取代。
[0058]
r3和r4中至少一个可以具有式3所示的结构。此外，r7至r10中至少一个可以具有式3所示的结构。
[0059]
n是括号中的重复数，可以是1至30的整数，优选1至10。更优选地，n可以是1至3。
[0060]
a可以是包括氮(n)原子的1至20个碳原子的烷基，或包括氮(n)原子的2至30个碳原子的杂芳基。特别地，a可以是叠氮化物(azide)、邻苯二甲酰亚胺(phthalimide)、或胺(amine)。
[0061]
在本发明中，“相邻”基团可以指在与相应取代基被取代的原子直接连接的原子处被取代的取代基、在空间上与相应取代基最近的位置处的取代基、或在相应取代基被取代的原子处被取代的另一个取代基。例如，在苯环的邻位(ortho)取代的两个取代基和在脂族环中的相同碳原子上取代的两个取代基可以解释为彼此“相邻”的基团。
[0062]
烷基可以是直链或支链，并可具有1至20个碳原子，优选1至10个碳原子。更优选地，碳数可以是1至6。烷基的具体实例可以包括甲基、乙基、丙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、1
‑
甲基丁基、1
‑
乙基丁基、戊基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、正己基、1
‑
甲基戊基、2
‑
甲基戊基、4
‑
甲基
‑2‑
戊基、3,3
‑
二甲基丁基、2
‑
乙基丁基、庚基、正庚基、1
‑
甲基己基、环戊基甲基、环己基甲基、辛基、正辛基、叔辛基、1
‑
甲基庚基、2
‑
乙基己基、2
‑
丙基戊基、正壬基、2,2
‑
二甲基庚基、1
‑
乙基丙基、1,1
‑
二甲基丙基、异己基、4
‑
甲基己基、5
‑
甲基己基、或苄基，但不限于此。
[0063]
环烷基可以具有3至20个碳原子，优选3至10个碳原子。环烷基的具体实例可以包括环丙基、环丁基、环戊基、3
‑
甲基环戊基、2,3
‑
二甲基环戊基、环己基、3
‑
甲基环己基、4
‑
甲基环己基、2,3
‑
二甲基环己基、3,4,5
‑
三甲基环己基、4
‑
叔丁基环己基、环庚基、或环辛基，但不限于此。
[0064]
芳基可以具有6至30个碳原子，优选6至10个碳原子。芳基可以是单环芳基或多环芳基。单环芳基的具体实例可以包括苯基、联苯基或三联苯基，多环芳基的具体实例可以包括萘基、蒽基、菲基、芘基、苝基、基、芴基、或三亚苯基，但不限于此。
[0065]
杂芳基可以是芳环基，其包括选自n、o、p、s、si和se中的一种或多种作为杂原子，并可具有2至30个碳原子，优选2至20个碳原子。杂芳基的具体实例可以包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、噁二唑基、三唑基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、三唑基、吖啶基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、异喹啉基、吲哚基、咔唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并咔唑基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、或苯并呋喃基，但不限于此。
[0066]
另外，烷基、环烷基、芳基、杂芳基或烃环可以进一步被烷基、环烷基、芳基或杂芳基取代或未取代。
[0067]
在将卡宾化合物处理到石墨烯膜上之后，可以施加100℃或更高的温度，使得卡宾化合物的未共享电子对可以与石墨烯膜形成化学键(共价键)。
[0068]
尸胺嗅觉受体可以与卡宾化合物化学键合，例如卡宾化合物端基的官能团与尸胺嗅觉受体的官能团之间可以通过偶联剂(例如4
‑
(4,6
‑
二甲氧基
‑
1,3,5
‑
三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉鎓四氟硼酸盐(dmtmm)、n
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
n
′‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、n
‑
羟基琥
珀酰亚胺(edc
‑
nhs)、戊二醛等)形成化学键。
[0069]
特别地，在组合传统尸胺受体和碳纳米管之后使用的传感器具有10pm的检测限，并且安装在电极上的碳纳米管的量不是恒定的，因此，在石墨烯晶体管的实验结果的再现性方面存在问题。然而，在本发明的石墨烯通道构件中，尸胺嗅觉受体物理或化学地键合到具有高电荷迁移率的石墨烯膜上，并可显示出比基于碳纳米管的传感器提高约1,000倍或更高，特别是10,000倍或更高，更特别是100,000倍或更高的检测效率，并且具有的优点在于，具有比使用传统碳纳米管的情况更灵敏的传感器性能的0.1fm的检测限，并且同时检测气相尸胺以及液相尸胺。
[0070]
石墨烯膜可以具有单层或双层。如果使用具有双层的石墨烯膜，则可能由于表面电阻的降低而使得石墨烯晶体管的灵敏度降低，而在这点上，优选包括具有单层的石墨烯膜。
[0071]
石墨烯膜可以被图案化，特别是被精细地图案化。在图案化的石墨烯膜的表面上，尸胺嗅觉受体可以被键合(固定)。例如，石墨烯膜可以被图案化为各种形状，例如圆形、三角形、正方形、五边形和六边形(蜂窝)。在如上所述图案化石墨烯膜的情况下，可以提供具有各种形状的石墨烯膜的图案，生物传感器可以小型化并且易于携带，并可满足对具有各种形状的石墨烯晶体管的设计的要求。
[0072]
在图案化的石墨烯膜的表面上，尸胺嗅觉受体可以被键合。在这种情况下，尸胺嗅觉受体可以通过物理吸附通过物理键固定到石墨烯膜的表面，或者可以通过由式1或式2表示的卡宾化合物作为接头通过化学键固定到石墨烯膜。
[0073]
如上所述，石墨烯通道构件包括石墨烯膜，并且在使用石墨烯作为这种通道构件的情况下，当没有向栅极施加电压时，高电流在截止状态下流动，操作电流的导通/截止比非常低，并且在制造具有高性能的晶体管方面存在优势。
[0074]
在这种情况下，石墨烯膜的厚度可以是0.1至1nm，而这可以意味着单层的石墨烯膜的厚度。如果石墨烯膜的厚度满足上述范围，可以表现出高导电性和高电荷迁移率的特性，而可制造高灵敏度的石墨烯晶体管。
[0075]
2.石墨烯晶体管
[0076]
此外，本发明提供了一种包括所述石墨烯通道构件的石墨烯晶体管。
[0077]
本发明的石墨烯晶体管包括：基板；上述的石墨烯通道构件；及一对电极。
[0078]
所述基板扮演支撑本发明的石墨烯晶体管的构成部分的支撑物的角色，并可使用包括si基板、玻璃基板、gan基板、二氧化硅(sio2)基板等的绝缘无机基板，包括ni、cu、w等的金属基板，或者塑料基板。在使用绝缘基板的情况下，考虑到与石墨烯通道构件的优异亲和性，优选二氧化硅(sio2)基板或硅晶片。
[0079]
另外，基板可以选自能够在其上沉积石墨烯的各种材料，例如，可以由包括硅锗、碳化硅(sic)等的材料构成，并可包括外延层(epitaxial)、绝缘体上硅层(silicon
‑
on
‑
insulator)、绝缘体上半导体层(semiconductor
‑
on
‑
insulator)等。
[0080]
石墨烯通道构件可以形成在基板上。
[0081]
特别地，石墨烯膜可以通过使用烃气作为碳源通过化学气相沉积法在基板上生长石墨烯来形成。
[0082]
石墨烯膜可以通过使用例如化学气相沉积法形成，并且通过使用该方法，可以大
面积获得具有优异结晶性的单层至数层的石墨烯。化学气相沉积法是通过使具有高动能的气体或蒸气状态的碳前体吸附、分解或反应到基材表面上来分离碳原子，并使碳原子彼此形成原子键，来生长石墨烯的方法。
[0083]
化学气相沉积方法可以是选自由等离子体增强化学气相沉积(pecvd)、常压化学气相沉积(apcvd)和低压化学气相沉积(lpcvd)所组成的群组的至少一个，并且考虑到在大面积上沉积同时使缺陷最小化，优选的化学气相沉积方法是lpcvd。
[0084]
通过化学气相沉积的具体方法，例如，使用溅射装置和电子束蒸发装置在具有氧化硅层的晶片上沉积金属催化剂如镍、铜、铝和铁以形成金属催化剂层，将其与包括碳的气体如ch4和c2h2一起放入反应器中并加热以使碳被吸收到金属催化剂层中，然后冷却以使碳与金属催化剂层分离以结晶，最后除去金属催化剂层以形成石墨烯膜。
[0085]
然而，形成石墨烯膜的方法不限于化学气相沉积法，并且石墨烯膜可以使用各种方法形成。
[0086]
例如，石墨烯膜可以通过，通过机械力从由多层组成的石墨晶体剥离一层来形成石墨烯的物理剥离法、利用氧化还原性质的化学剥离法、或通过在1,500℃的高温状态下加热其中吸附有或包含碳的材料如sic的外延合成法，来形成。
[0087]
所述一对电极可以是单独形成在石墨烯膜上以向石墨烯通道构件施加电压的源电极和漏电极。
[0088]
源电极和漏电极可以通过石墨烯膜电连接，可以包括具有导电性的材料，并可使用例如金属、金属合金、导电金属氧化物、导电金属氮化物等形成。
[0089]
源电极和漏电极可以各自独立地包括从由cu、co、bi、be、ag、al、au、hf、cr、in、mn、mo、mg、ni、nb、pb、pd、pt、re、rh、sb、ta、te、ti、w、v、zr、zn及其组合所组成的群组中选择的至少一种，但不限于此。考虑到与石墨烯的接触和蚀刻的容易性，优选au、或cr/au合金。
[0090]
所述一对电极可以通过本领域公知的方法形成，并可通过包括例如光刻、热沉积、电子束沉积、等离子体增强化学气相沉积(pecvd)、低压化学气相沉积(lpcvd)、物理气相沉积(pvd)、溅射、原子层沉积(ald)等的沉积方法形成。
[0091]
在石墨烯通道构件中，尸胺嗅觉受体可以通过物理吸附直接键合(固定)到石墨烯膜，或者尸胺嗅觉受体可以通过卡宾化合物键合(固定)。关于石墨烯通道构件、尸胺嗅觉受体、卡宾化合物和石墨烯膜，可以应用与上述相同的解释。
[0092]
在通过包括卡宾化合物作为接头而将尸胺嗅觉受体键合(固定)至石墨烯膜的情况下，结合至石墨烯膜的卡宾化合物可以形成单层型的接头层，并且固定至卡宾化合物的尸胺嗅觉受体也可以形成单层型的受体层。
[0093]
如果将接头层形成为单层，可以得到石墨烯所固有的优异的电荷迁移率、透明性和/或柔软性，并可实现阻断来自外部的非特异电荷的接近的噪声信号的效果。
[0094]
另外，所述连接层的厚度可以为0.1至2nm。如果接头层的厚度小于0.1nm，则存在电阻增加的问题，而如果厚度大于2nm，则存在透明度降低的问题。
[0095]
3.生物传感器
[0096]
本发明的另一方面提供了一种包括上述石墨烯晶体管的生物传感器。
[0097]
根据本发明的生物传感器利用了半导体特性，通过该半导体特性，流经源极和漏极之间的石墨烯膜的电流通过电场效应而改变。
[0098]
特别地，如果在石墨烯膜的表面上形成的尸胺嗅觉受体与尸胺反应，则周围的电场发生变化，由此，在源电极和漏电极之间的石墨烯膜中流动的电流值同时变化，通过测定该电流变化的方法，可以检测目标物质。
[0099]
通过使用这样的石墨烯晶体管，这样的生物传感器具有优异的灵敏度、特异性、及时性和/或便携性，并且特别地，由于使用石墨烯膜作为通道层的石墨烯的高电荷载流子迁移率和导电性，表现出优异的灵敏度和实时传感性能。因此，可以提高肉类腐败期间产生的尸胺的检测限，并可实现高灵敏度和再现性的效果。
[0100]
另外，在石墨烯晶体管中的石墨烯膜上形成上述接头层、并在石墨烯晶体管的通道区中存在与其键合的尸胺嗅觉受体层的情况下，可以进一步提高传感器的灵敏度，并可同时进行尸胺嗅觉受体的掺杂处理和附着，从而简化工艺。
[0101]
此外，上述石墨烯晶体管可以形成为usim片型，并可应用于小型化生物传感器(便携式电子气体传感器等)，并可简单且准确地实时辨别肉类新鲜度，并且该生物传感器可以用于各种食品工业和环境评估工业。
[0102]
以下，将参照优选实施例更详细地解释本发明。
[0103]
然而，这些实施例仅用于更具体地解释本发明，并且本发明的范围不限于此。
[0104]
〈制造实例1〉
[0105]
1.apoa
‑
i和taar13c的基因克隆
[0106]
为了从大肠杆菌(e.coli)表达apoa
‑
i和taar13c蛋白，首先克隆apoa
‑
i和taar13c基因。
[0107]
特别地，apoa
‑
i基因被设计为包括6xhis和终止密码子基因，并使用人基因组dna通过pcr(引物序列：5
′‑
cac cag gag ata tac ata tga aag ctg cgg tgc tga cc
‑3′
、5
′‑
cta gtg gtg gtg gtg gtg gtg ctg ggt gtt gag ctt ctt agt gta
‑3′
)扩增。
[0108]
使用斑马鱼cdna通过pcr扩增taar13c基因(引物序列：5
′‑
cac cag gag ata tac ata tga tgc cct ttt gcc aca at
‑3′
，5
′‑
tga act caa ttc caa aaa taa ttt aca c
‑3′
)。使用gateway克隆系统(美国invitrogen)将扩增的pcr产物插入pet
‑
dest42载体(美国invitrogen)中。
[0109]
使用扩增的pcr产物(引物；5
′‑
atg aat tca tgg att tat cat cac aag aat
‑3′
，5
′‑
atc tcg agt caa acc gta aat aaa ttg ata
‑3′
)将taar13c基因克隆到pcdna3哺乳动物表达载体中。
[0110]
2.apoa
‑
i在大肠杆菌中的表达和纯化
[0111]
将携带pet
‑
dest42/apoa
‑
i构建体的bl21(de3)大肠杆菌细胞在1l luria
‑
bertani(lb)培养基(+50μg/ml氨苄青霉素)中于37℃培养，然后生长直至细胞的od600值达到0.5。另外，加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1nm以诱导apoa
‑
i的过表达。
[0112]
3小时后，细胞离心(7000g，20分钟，4℃)，重悬于裂解缓冲液(20mm tris
‑
hcl、0.5m nacl、20mm咪唑，ph 8.0)中，然后通过超声破碎(5秒开/关，5分钟)。
[0113]
破碎的细胞裂解液在4℃以12,000g离心30分钟，收集上清液中的apoa
‑
i并通过fplc(瑞典ge healthcare)加载到histrap hp柱(瑞典ge healthcare)上。
[0114]
然后，用洗涤缓冲液(20mm tris
‑
hcl、50mm咪唑、0.5m nacl，ph 8.0)洗涤柱，用分离缓冲液(20mm tris
‑
hcl、400mm咪唑、0.5m nacl，ph 8.0)分离apoa
‑
i，并用hitrap hp脱
盐柱(瑞典ge healthcare)对hepes缓冲液i(20mm hepes
‑
naoh、100mm nacl，20mm胆酸盐，1mm edta，ph 8.0)透析。将如此透析的蛋白质在4℃下保存直到使用。
[0115]
3.taar13c的表达和纯化
[0116]
将用pet
‑
dest42/taar13c载体转化的bl21(de3)细胞在lb培养基(+50μg/ml氨苄青霉素)中于37℃培养，直至细胞的od
600
值达到0.5。通过加入1mm iptg诱导taar13c的表达，并将细胞培养4小时。
[0117]
培养后，细胞离心(7000g，20分钟，4℃)，将通过离心获得的沉淀重悬于包括2mm edta的pbs中。然后，通过超声处理(5秒开/关，5分钟)破坏细胞以使细胞裂解，并再次离心(12000g，4℃，20分钟)。
[0118]
重复超声和离心后，将样品沉淀溶解在溶解缓冲液(0.1m tris
‑
hcl，20mm十二烷基硫酸钠(sds)，100mm二硫苏糖醇(dtt)，1mm edta，ph 8.0)中。使用10k mwco透析盒(美国thermo scientific)将溶解的蛋白质对包括10mm sds的0.1m磷酸钠缓冲液透析。
[0119]
然后，使用0.2μm瓶顶过滤器(bottle top filter)(美国thermo scientific)进行过滤，并上样到用包括10mm sds的0.1m磷酸钠(ph 8.0)平衡的histrap hp柱上。用洗涤缓冲液(0.1m磷酸钠、10mm sds)连续洗涤柱，直至ph达到8.0至7.0。之后，将taar13c溶解在ph 6.0的相同缓冲液中并分离。
[0120]
用hepes缓冲液ii(20mm hepes
‑
naoh、100mm nacl、25mm胆酸盐、1mm edta，ph 8.0)透析如此溶解并分离的蛋白质。用sds
‑
page和western印迹分析来分析透析和纯化的taar13c。
[0121]
〈制造实例2〉
[0122][0123]
根据上述反应，制备卡宾化合物1。
[0124]
图10中示出卡宾化合物1的1h
‑
nmr谱。
[0125]
〈制造实例3〉
[0126][0127]
根据上述反应，制备卡宾化合物2。
[0128]
图11中示出卡宾化合物2的1h
‑
nmr谱。
[0129]
〈制造实例4〉
[0130][0131]
根据上述反应，制备卡宾化合物3。
[0132]
图12中示出卡宾化合物3的1h
‑
nmr谱。
[0133]
〈制造实例5〉
[0134][0135]
根据上述反应，制备卡宾化合物4。
[0136]
图13中示出卡宾化合物4的1h
‑
nmr谱。
[0137]
〈制造实例6〉
[0138][0139]
根据上述反应，制备卡宾化合物5。
[0140]
图14中示出卡宾化合物5的1h
‑
nmr谱。
[0141]
〈实施例1〉石墨烯晶体管的制造
[0142]1‑
1.在基板上形成石墨烯膜
[0143]
将铜箔置于腔室中，加热至1,000℃，并在90mtorr和8sccm的h2中保持30分钟(预退火20分钟和稳定10分钟)。然后，在总压力560mtorr的状态下，施加20sccm的ch440分钟，以35℃/min的速率将温度冷却到200℃，并将炉冷却到室温，以在铜箔上形成单层石墨烯膜
(石墨烯层)。
[0144]
然后，在铜箔上形成的石墨烯膜上，以每分钟6,000rpm的速率旋涂聚甲基丙烯酸甲酯(pmma，microchem corp，950pmma a4，4％于苯甲醚中)，并使用蚀刻剂将涂覆有pmma的石墨烯膜与铜箔分离。将从铜箔上分离的石墨烯膜浸入去离子蒸馏水中10分钟以除去残留在石墨烯膜上的蚀刻剂离子。
[0145]
将如此洗涤的石墨烯膜转移到作为基板的硅晶片上，并将pmma溶液滴在石墨烯膜上以除去涂覆在石墨烯膜上的pmma，以在基板上形成石墨烯膜。在这种情况下，透明度保持在97.8％。
[0146]
在形成于基板上的石墨烯膜上，旋涂正性光刻胶(az5214，clariant公司)，并通过uv曝光、烘焙和显影工艺对石墨烯膜进行图案化。
[0147]1‑
2.电极的形成
[0148]
在如上图案化和排列的石墨烯膜的两端，通过rie(氧等离子体处理)方法形成图案电极(宽度/长度＝w/l＝1，l＝100μm通道长度)，然后，通过图像反转、热沉积和剥离工艺，形成其中在石墨烯膜的一部分上形成电极(w/l＝5，l＝100μm通道长度)的石墨烯晶体管。
[0149]1‑
3.尸胺嗅觉受体(taar13c)的固定化
[0150]
在石墨烯膜上，添加制造实例1的taar13c，并在4℃反应12小时或更长，以将taar13c固定到石墨烯膜上，来制造石墨烯晶体管。
[0151]
〈实施例2〉石墨烯晶体管的制造
[0152]1‑
1.在基板上形成石墨烯膜
[0153]
将铜箔置于腔室中，加热至1,000℃，并在90mtorr和8sccm的h2中保持30分钟(预退火20分钟和稳定10分钟)。然后，在总压力560mtorr的状态下，施加20sccm的ch440分钟，以35℃/min的速率将温度冷却到200℃，并将炉冷却到室温，以在铜箔上形成单层石墨烯膜(石墨烯层)。
[0154]
然后，在铜箔上形成的石墨烯膜上，以每分钟6,000rpm的速率旋涂聚甲基丙烯酸甲酯(pmma，microchem corp，950pmma a4，4％于苯甲醚中)，并使用蚀刻剂将涂覆有pmma的石墨烯膜与铜箔分离。将从铜箔上分离的石墨烯膜浸入去离子蒸馏水中10分钟以除去残留在石墨烯膜上的蚀刻剂离子。
[0155]
将如此洗涤的石墨烯膜转移到作为基板的硅晶片上，并将pmma溶液滴在石墨烯膜上以除去涂覆在石墨烯膜上的pmma，以在基板上形成石墨烯膜。在这种情况下，透明度保持在97.8％。
[0156]
在形成于基板上的石墨烯膜上，旋涂正性光刻胶(az5214，clariant公司)，并通过uv曝光、烘焙和显影工艺对石墨烯膜进行图案化。
[0157]1‑
2.电极的形成
[0158]
在如上图案化和排列的石墨烯膜的两端，通过rie(氧等离子体处理)方法形成图案电极(宽度/长度＝w/l＝1，l＝100μm通道长度)，然后，通过图像反转、热沉积和剥离工艺，形成其中在石墨烯膜的一部分上形成电极(w/l＝5，l＝100μm通道长度)的石墨烯晶体管。
[0159]1‑
3.接头层的形成
[0160]
将制造实例1的卡宾化合物1(50mg)溶解于thf溶剂(10ml)中并加入到石墨烯膜中，与2mm氟化四丁基铵混合，并在室温下反应30分钟。然后，用thf洗涤石墨烯膜以形成连接层。
[0161]1‑
4.尸胺嗅觉受体(taar13c)的固定化
[0162]
用10μl体积比为1:1的制造实例1的taar13c和3wt％dmtmm的混合物溶液处理所述接头层，在4℃反应5小时或更长，并用缓冲溶液洗涤以将taar13c固定到所述连接层上，来制造石墨烯晶体管。
[0163]
〈比较例1〉
[0164]
除了使用碳纳米管代替实施例2中的石墨烯膜之外，通过与实施例2中相同的方法制造石墨烯晶体管。
[0165]
〈实验例1〉尸胺浓度的测定结果
[0166]
制备实施例2的石墨烯晶体管，并注入浓度为0.1fm、1fm、10fm、100fm、1pm、10pm或100pm的尸胺进行检测实验。结果示于图4。
[0167]
根据实验例1和图4，可以确认，通过本发明的石墨烯晶体管，在尸胺浓度为0.1fm的情况下，可以检测到电信号，可以确认有非常高的灵敏度。
[0168]
〈实验例2〉根据牛肉随时间的腐败对尸胺的实时检测结果
[0169]
将1.8l的牛肉在21℃的温度、30％的湿度下放置，0小时至60小时的观察结果示于图5，使用实施例2的石墨烯晶体管的检测结果示于图6。
[0170]
根据实验例2和图6，可以确认从牛肉中产生的尸胺在约15小时(900分钟)后，电阻迅速变化。
[0171]
〈实验例3〉不同材料的石墨烯晶体管的检测结果
[0172]
制备实施例2的石墨烯晶体管，而当石墨烯晶体管依次接触氨、谷氨酰胺、腐胺和尸胺时的检测结果，依序示于图7中。
[0173]
根据实验例3和图7，可以确认本发明的石墨烯晶体管具有尸胺选择性。
[0174]
〈实验例4〉使用石墨烯晶体管的生物传感器的检测结果
[0175]
通过使用如图9中制造的实施例2的石墨烯晶体管和包括常用的no2、vbn和voc检测器的生物传感器，图8中示出了实验例2的牛肉腐败过程中产生的no2、vbn和voc的实时检测结果。
[0176]
〈比较实验例1〉
[0177]
使用比较例1的石墨烯晶体管的尸胺检测限的评价结果如图15所示。
[0178]
根据比较实验例1和图15，可以确认，与使用比较例1的石墨烯晶体管的情况相比，使用本发明的石墨烯晶体管的情况的检测限提高了约100,000倍或更高。