成像质量分析装置的制作方法

1.本发明涉及对试样上的二维区域内或者试样中的三维区域内的多个测量点(微小区域)的每一个执行质量分析的成像质量分析装置。


背景技术：

2.在成像质量分析装置中，能够通过光学显微镜观察生物组织切片等试样的表面的形态，同时测量该试样的表面中具有特定的质荷比m/z的离子的二维强度分布(参照专利文献1等)。在成像质量分析装置中，能够对一个试样创建各种质荷比中的离子的二维强度分布即质量分析成像图像(以下，有时称为ms成像图像)。
3.在一般的成像质量分析装置中，使用基质辅助激光解吸电离(maldi)法作为离子化法，并通过激光的照射直接将试样中的成分离子化。因此，不仅是用户关注的目标成分，试样上与该目标成分相同或者存在于其附近的其他的大量成分也同时被离子化并用于质量分析。虽然在质量分析中会将质荷比存在充分的差异的成分彼此分离，但特别是在源自生物体的试样的情况下，虽然是不同的成分但质量相同或者相近的情况较多，经常存在着在质量分析中无法充分分离的情况。因此，即使使用某1种质荷比(m/z)值中的信号强度来创建ms成像图像，也具有存在于该质荷比值的容许范围内的、或者具有相同的质荷比的其他的成分的分布重叠的情况，因而存在难以正确地掌握目标成分的二维分布的问题。
4.作为用于解决该问题的一个方法，已知有执行将目标成分设为靶的ms/ms分析(或者n为3以上的ms
n
分析)，使用被推测为由目标成分生成的产物离子的信号强度来创建ms成像图像的方法。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：国际公开第2018/037491号册子
8.非专利文献
9.非专利文献1：“图像的分割”，[在线]，mathworks公司，[2019年4月9日检索]，网络<url:https://jp.mathworks.com/help/images/image
‑
segmentation.html>
[0010]
非专利文献2：“使用k
‑
means聚类的基于颜色的分割”，[在线]，mathworks公司、[2019年4月9日检索]，网络<url:https://jp.mathworks.com/help/images/color
‑
based
‑
segmentation
‑
using
‑
k
‑
means
‑
clustering.html>


技术实现要素：

[0011]
发明要解决的技术问题
[0012]
在ms/ms分析(或者ms
n
分析)中的离子解离操作中，通常，从源自一个成分的1种前体离子会生成质荷比彼此不同的多种产物离子，因此在产物离子光谱中会观测到源自一个目标成分的多个产物离子的峰。此外，也存在源自不同成分的前体离子具有相同的质荷比的情况，因此在产物离子光谱中也会观测到源自不同于目标成分的其他成分的产物离子的
峰。进而，在离子阱等中选择前体离子时，选择质荷比落入某种程度的质荷比范围的离子，因此若目标成分中存在质荷比相近的其他成分，则也会在产物离子光谱中观测到源自这样的其他成分的产物离子的峰。
[0013]
如此，在产物离子光谱中，观测到由源自目标成分的多个产物离子、源自目标成分以外的成分的多个产物离子所产生的峰，但以往只选择其中被推测为源自目标成分的特定的产物离子来创建示出其分布的ms成像图像。此时被选择的特定的产物离子未必一定是源自目标成分的离子，但在以往的装置中，无法提供使用户能够验证这种情况的信息。此外，在以往的装置中，也无法向用户提供在试样中是否存在具有与目标成分相同或者相近的质荷比的其他成分的信息。
[0014]
本发明是为了解决上述技术问题而完成的，其主要目的在于提供一种成像质量分析装置，能够有效地利用通过进行n为2以上的ms
n
分析而得到的信息，将与试样所包含的目标成分、目标成分以外的二维分布相关的有用信息提供给用户，由此得到例如遵循用户的意愿、目的的ms成像图像。
[0015]
用于解决上述技术问题的方案
[0016]
本发明的成像质量分析装置的第1方案具备：
[0017]
分析执行部，对于设定在试样上的二维的或者试样中的三维的测量区域内的多个微小区域分别执行针对目标成分的ms
n
分析(n为2以上的整数)来收集数据；
[0018]
产物离子提取部，基于由所述分析执行部得到的数据的至少一部分，提取在所述试样中观测到的多个产物离子；
[0019]
二维分布创建部，基于针对ms
n
分析时的前体离子以及所述多个产物离子各自的数据，求出二维分布；
[0020]
分布关系性可视化部，调查所述前体离子以及所述多个产物离子的二维分布的关系性，创建示出该二维分布的包含关系的图形或者图表并显示于显示部。
[0021]
另外，前体离子和产物离子的质荷比的差为中性丢失(neutral loss)，只要前体离子确定，则产物离子和中性丢失一一对应。由此，在本发明的成像质量分析装置中，将产物离子设为也包含中性丢失。
[0022]
发明效果
[0023]
根据本发明的成像质量分析装置的第1方案，用户观察利用分布关系性可视化部显示于显示部的图形或者图表，能够在视觉上容易地掌握通过针对目标成分的ms
n
分析而得到的产物离子光谱上观测到的多个产物离子的关系，例如是否为源自相同的成分的产物离子、或者是否为源自其他成分的产物离子等。由此，例如用户能够从源自目标成分的多个产物离子中选择恰当的产物离子来创建ms成像图像并确认其分布，或者选择目标成分以外的成分的产物离子来创建ms成像图像并确认其分布。其结果为，用户能够得到以往的装置所得不到的、与试样所包含的目标成分或者目标成分以外的二维分布相关的有用信息，即能够得到新的发现。
附图说明
[0024]
图1是作为本发明的一实施方式的成像质量分析装置的主要部分的构成图。
[0025]
图2是本实施方式的成像质量分析装置中的特征性解析处理的说明图。
[0026]
图3是示出本实施方式的成像质量分析装置中的解析处理结果的另一个输出例的图。
具体实施方式
[0027]
以下，参照附图对本发明的成像质量分析装置的一实施方式进行说明。
[0028]
[本实施方式的装置的构成]
[0029]
图1是本实施方式的成像质量分析装置的概略构成框图。
[0030]
本实施方式的成像质量分析装置具备成像质量分析部1、数据解析部2、输入部3和显示部4。
[0031]
成像质量分析部1对试样执行成像质量分析，且可以进行n为2以上的ms
n
分析。即，成像质量分析部1包含离子化部10、离子阱11、质量分析部12以及检测器13。
[0032]
离子化部10例如是利用了在大气压气氛下对试样照射激光，将该试样中的物质离子化的大气压基质辅助解吸电离(ap
‑
maldi)法的离子源。
[0033]
离子阱11例如是三维四极型或者线型的离子阱，其暂时捕获源自试样成分的离子，并对具有特定的质荷比的离子进行选择操作、以及对选择的离子(前体离子)进行解离操作。离子的解离操作例如能够通过利用碰撞诱导解离(cid：collision
‑
induced dissociation)来进行。
[0034]
质量分析部12以较高的质量精度以及质量分辨率将从离子阱11放出的离子分离，例如能够使用飞行时间型质量分析装置、或者ft
‑
icr(傅里叶变换离子回旋共振)型等傅里叶变换型质量分析装置。
[0035]
在成像质量分析部1中，通过在生物体组织切片等试样5上的二维的测量区域50内，对照射由离子化部10产生的离子化用的激光的位置进行扫描，并分别实施针对该测量区域50内的多个测量点(实际上是微小区域)的质量分析，能够获取整个规定的质荷比范围中的质谱数据。此外，通过在试样5上的测量区域50内的多个测量点中，实施将预先指定的质荷比设为靶的ms2分析，能够获取整个规定的质荷比范围中的产物离子光谱数据。
[0036]
数据解析部2接收在成像质量分析部1中得到的、对于各个多个测量点(微小区域)的质谱数据或者产物离子光谱数据(以下，有时简称为光谱数据)，实施基于该数据的解析处理。数据解析部2为了进行后述的特征性解析处理，具备光谱数据存储部20、产物离子提取部21、成像图像创建部22、区域包含关系判定部23、组成式推算部24以及显示处理部25作为功能模块。
[0037]
该数据解析部2可以由硬件电路构成，一般来说，其实体为个人计算机或者更高性能的工作站等计算机。通过在该计算机上执行安装在该计算机上的专用的数据解析软件，能够具体实现上述各功能模块。在该情况下，输入部3是附设于计算机的键盘、定点设备(鼠标等)，显示部4是显示器。
[0038]
[本实施方式的装置中的分析动作]
[0039]
在本实施方式的成像质量分析装置中，按照以下的方式收集质量分析成像数据。
[0040]
用户设定目标成分的分子量或者源自该目标成分的前体离子的质荷比作为ms
n
分析条件之一。当然，也可以在ms
n
分析之前先执行通常(即，不使离子解离)的成像质量分析，再利用该结果确定作为ms
n
分析对象的前体离子。若如上所述地设定目标成分的分子量或
者源自该成分的前体离子的质荷比，则决定了具有预先确定的质量容许宽度的前体离子的质荷比范围。
[0041]
成像质量分析部1对于设定在试样5上的测量区域50内的多个测量点，分别执行针对上述决定的前体离子的质荷比范围的通常的质量分析，获取信号强度数据。在此，也可以执行整个规定的质荷比范围中的扫描测量，从该结果中仅提取针对前体离子的质荷比范围的信号强度。接下来，对于设定在试样5上的测量区域50内的多个测量点，分别执行针对上述决定的前体离子的质荷比范围的通过产物离子扫描测量进行的ms/ms分析，获取产物离子光谱数据。得到的数据均从成像质量分析部1传送至数据解析部2，并保存至光谱数据存储部20。
[0042]
[本实施方式的装置中的解析处理]
[0043]
在如上述那样的针对一个试样5的光谱数据被储存至光谱数据存储部20的状态下，若用户通过输入部3进行规定的操作，则数据解析部2使用保存至光谱数据存储部20的数据执行以下的解析处理。图2是该解析处理的说明图。
[0044]
产物离子提取部21根据针对一个试样5得到的多个测量点中的光谱数据，例如创建对每个质荷比值计算了所有测量点中强度信号的平均的平均产物离子光谱。也可以是例如对每个质荷比选择了所有测量点中信号强度最大的产物离子光谱等来代替平均产物离子光谱。然后，在创建的产物离子光谱中进行峰检测，选择多个显著性峰，由此提取产物离子。
[0045]
具体而言，只要在从产物离子光谱检测的峰中，按照信号强度由高至低的顺序选择规定个数的峰，并提取与该峰对应的产物离子即可。当然，也可以不对选择的峰的个数设置限制。此外，在作为事前信息获知为不需要的产物离子的情况下可以将其排除，反之，在获知存在信号强度较低但很重要的产物离子的情况下，可以将其加入到选项中。
[0046]
产物离子提取部21可以进行使用了从试样5上的测量区域50内的多个测量点分别得到的光谱数据的已知的各种统计解析处理，基于该结果提取有效产物离子。
[0047]
例如，非专利文献1中公开了通过检测图像内的像素值的不连续性，将该图像分割成多个区域的分割(segmentation)技术。此外，非专利文献2中公开了利用k
‑
means聚类根据颜色将图像分类的技术。通过将这样的技术应用至从各测量点得到的光谱数据中，从而若将测量区域50分割成多个小区域，则各小区域与例如一个生物体组织中的分别具有不同特征的部位对应的可能性较高。因此，只要对每个小区域计算平均产物离子光谱，在该平均产物离子光谱中观测到的峰中按照信号强度由高至低的顺序选择规定个数的峰，提取与该峰对应的产物离子即可。由此，能够在被预想为是测量区域50中存在的特征性部位的每个小区域提取一个或者多个产物离子。
[0048]
此外，通过将层序聚类分析(hca：hierarchical cluster analysis)应用于从测量区域50内的各测量点得到的光谱数据，能够将多个质荷比m/z分类为空间分布类似的多个集群(组)。被分类成相同集群的不同的质荷比与源自相同成分的离子对应的可能性较高、或者与成分彼此不同但例如与源自在生物体内示出相似的行为的离子对应的可能性较高。因此，只要从被分类成各集群的多个质荷比中，按照信号强度由高至低的顺序选择规定个数，将其作为产物离子提取即可。由此，能够对测量区域50中存在的每个成分、或者行为相似的每个成分组，提取一个或者多个产物离子。
[0049]
成像图像创建部22从光谱数据存储部20读取针对前体离子以及如上述那样提取的多个产物离子而得到的数据，并分别创建ms成像图像。一般来说，在创建ms成像图像时，将信号强度与彩色标度(或者灰色标度)进行关联，创建根据颜色的不同能够视觉确认信号强度的大小的分布图像。在此，可以创建这样的分布图像，也可以创建例如将信号强度为规定阈值以上(或者，也可以设为“信号强度为0以外”)的测量点和其以外的测量点进行区别的二值图像(例如黑白图像)。
[0050]
区域包含关系判定部23在由成像图像创建部22创建的多个ms成像图像中，调查各个离子存在的区域的空间性包含关系。在此，通过在多个ms成像图像之间比较存在前体离子或者产物离子的区域，例如如上述那样，在通过彩色标度、灰色标度表达ms成像图像的情况下，需要将信号强度的范围转换至被视作离子存在的范围从而进行比较。在上述那样ms成像图像是二值图像的情况下，不需要这样的转换就能够直接地比较图像。在该点上，作为二值图像获取ms成像图像是有用的。
[0051]
作为一例，如图2的(a)～(d)所示，得到前体离子的ms成像图像以及产物离子a、b、c的ms成像图像(但在实际中并未显示图2的(b)～(d)中示出的虚线)。区域包含关系判定部23通过比较这4张ms成像图像，调查各个图像中离子的存在区域的包含关系。其结果为，判定为产物离子b的存在区域包含于产物离子a的存在区域中，产物离子a的存在区域包含于前体离子的存在区域中。另一方面，判定为产物离子c的存在区域包含于前体离子的存在区域，但未包含于产物离子a、b的存在区域。
[0052]
显示处理部25收取区域包含关系判定部23得到的判定结果，创建表示该判定结果的维恩(venn)图，并将其显示于显示部4的画面上。在图2的(a)～(d)示出的例子的情况下，根据该包含关系创建如图2的(e)所示那样的维恩图。即使显示如图2的(a)～(d)所示那样的ms成像图像，用户也不容易理解多个产物离子分别存在的区域的空间性关系。对此，通过如图2的(e)所示那样的维恩图，用户能够一目了然地掌握多个产物离子分别存在的区域的空间性关系。
[0053]
在该例子中，由于产物离子a和产物离子b的存在区域重叠，因此能够判断为它们是源自相同成分的产物离子的可能性较高。另一方面，由于产物离子c和产物离子a、b的存在区域不重叠，因此能够判断它们是源自彼此不同的成分的产物离子的可能性较高。如此，能够识别前体离子的质荷比相同或者相近的、来自彼此不同的成分的产物离子。通过掌握这样的离子存在的区域的空间性包含关系，能够容易选择更恰当的产物离子来了解目标成分的二维分布，得到遵循目的的、正确性较高的ms成像图像。
[0054]
此外，显示处理部25也可以创建如图3所示那样的树状图代替图2的(e)示出的维恩图显示于显示部4。根据树状图也可以一目了然地掌握前体离子和多个产物离子的包含关系。
[0055]
此外，在本实施方式的成像质量分析装置中，为了附加以下的功能而设置有组成式推算部24。
[0056]
在成像质量分析部1的质量分析部12的质量精度较高的情况下，具体而言，在使用傅里叶变换型质量分析装置或多循环飞行时间型质量分析装置等的情况下，能够根据通过质量分析(ms
n
分析)求出的质荷比值，以较高的准确度推定该离子的组成式。于是，组成式推算部24对于由产物离子提取部21提取的多个产物离子和前体离子，分别根据质荷比推定
组成式。然后，判定具有各个组成式的离子是否能够由预先指定的目标成分的分子式来生成。
[0057]
例如，在某个组成式中的某个元素的数量超过目标成分的分子式中的相同的元素的数量这样的情况下，能够判断为具有该组成式的离子并非源自目标成分。可以像这样利用组成式来推定各产物离子是否源自目标成分，使其结果以文字信息的形式显示于维恩图、树状图等图形或者图表中。例如可以设为，若用户通过进行输入部3的操作，将鼠标指针移动至维恩图、树状图中的产物离子的标记处，则在该产物离子并非源自目标成分的情况下，显示对其含义进行说明的提示工具(tool tip)。
[0058]
此外，也可以不将利用了组成式的判定结果用于显示，而是设为在通过区域包含关系判定部23调查离子存在的区域的包含关系时，排除被推定为并非源自目标成分的产物离子。由此，能够显示只示出源自目标成分的前体离子和被推定为源自目标成分的多个产物离子的维恩图、树状图。
[0059]
[变形例]
[0060]
在上述实施方式的装置中，求出了示出前体离子和多个产物离子的空间性包含关系的维恩图、树状图，而在前体离子发生解离而生成产物离子时产生的中性粒子即中性丢失与产物离子一一对应。由此，不言自明地，可以使用具有相当于前体离子和产物离子的质荷比差的质量的中性丢失创建ms成像图像或调查区域的包含关系，来代替产物离子。
[0061]
此外，在上述实施方式的装置中，试样上的测量区域是二维的，当然也能够将本发明利用在测量区域为三维的情况下。
[0062]
此外，在上述实施方式的装置中，利用作为ms2分析的结果的产物离子，但也可以利用作为ms3分析、ms4分析等n为3以上的ms
n
分析的结果的产物离子。
[0063]
此外，上述实施方式、变形例仅是本发明的一例，在本发明的主旨的范围内进行适当变形、修正、追加等当然也包含在本技术权利要求的范围中。
[0064]
[各种方案]
[0065]
以上，参照附图对本发明的实施方式进行了说明，最后对本发明的各种方案进行说明。
[0066]
本发明的第1方案的成像质量分析装置具备：
[0067]
分析执行部，对于设定在试样上的二维的或者试样中的三维的测量区域内的多个微小区域分别执行针对目标成分的ms
n
分析(n为2以上的整数)并收集数据；
[0068]
产物离子提取部，基于通过所述分析执行部得到的数据的至少一部分，提取在所述试样中观测到的多个产物离子；
[0069]
二维分布创建部，基于针对ms
n
分析时的前体离子以及所述多个产物离子各自的数据，求出二维分布；
[0070]
分布关系性可视化部，调查所述前体离子以及所述多个产物离子的二维分布的关系性，创建示出该二维分布的包含关系的图形或者图表，显示于显示部。
[0071]
根据第1方案的成像质量分析装置，用户能够观察显示于显示部的图形或者图表，从而一目了然地掌握在通过针对目标成分的ms
n
分析而得到的产物离子质谱上观测到的多个产物离子的关系，例如是否为源自相同成分的产物离子、或者是否为源自其他成分的产物离子等。由此，例如用户能够从源自目标成分的多个产物离子中选择恰当的产物离子来
创建ms成像图像并确认其分布，或者选择目标成分以外的成分的产物离子来创建ms成像图像并确认其分布。其结果为，用户能够得到以往的装置所得不到的、与试样所包含的目标成分或者目标成分以外的二维分布相关的有用的信息，即能够得到新的发现。
[0072]
本发明的第2方案的成像质量分析装置是在第1方案中，所述分布关系性可视化部能够创建维恩图或者树状图作为示出所述前体离子以及所述多个产物离子的二维分布的包含关系的图形或者图表。
[0073]
根据第2方案的成像质量分析装置，用户能够一目了然地理解前体离子以及多个产物离子的二维分布的包含关系。
[0074]
本发明的第3方案的成像质量分析装置是在第1方案中能够进一步具备：
[0075]
组成式推定部，对于提取的所述多个产物离子，根据质荷比推定组成式；
[0076]
离子判定部，基于推定的组成式，判定是否是源自所述目标成分的产物离子。
[0077]
本发明的第4方案的成像质量分析装置是在第3方案中，所述分布关系性可视化部在所述图形或者图表中追加基于由所述离子判定部产生的判定结果的显示。
[0078]
本发明的第5方案的成像质量分析装置是在第3方案中，所述分布关系性可视化部能够基于所述离子判定部得到的判定结果，将一部分产物离子排除，调查所述前体离子以及所述多个产物离子的二维分布的关系性。
[0079]
根据第4方案的成像质量分析装置，能够在显示的图像或者图表上简便地确认其示出的产物离子是否源自目标成分。由此，例如提高选择恰当的产物离子时的作业效率。
[0080]
另一方面，根据第5方案的成像质量分析装置，由于绘制出只显示源自目标成分的前体离子以及产物离子的图像、图表，因此在不关注目标成分以外的成分的情况下，能够省去确认不需要的信息这样的无用的作业。
[0081]
本发明的第6方案的成像质量分析装置是在第1～第5方案的任一方案中，所述产物离子提取部利用由所述分析执行部得到的数据，能够将所述测量区域分割成多个小区域或者将质荷比值分类成多个组，在每个该小区域或者每个该质荷比值的组提取多个产物离子。
[0082]
在第6方案的成像质量分析装置中，只要产物离子提取部利用由分析执行部得到的数据，将测量区域分割成具有相同的或者类似的特征的多个小区域即可。由此，能够在每个具有相同的或者类似的特征的部位提取产物离子。此外，在第6方案的成像质量分析装置中，只要产物离子提取部利用由分析执行部得到的数据，将质荷比值分类成空间分布类似的多个组即可。空间分布类似的不同的质荷比是源自相同成分的离子、或者是源自行为、动态类似的成分的离子的可能性较高。因此，能够在每个相同的成分或者每个行为、动态相似的成分组提取产物离子。
[0083]
本发明的第7方案的成像质量分析装置是在第6方案中，在将测量区域分割成多个小区域或者将质荷比值分类成多个组时能够使用多变量解析。
[0084]
在此所说的多变量解析能够设为包含k
‑
means等的非层序聚类分析的方法或hca等各种统计解析的方法。此外，可以使用边缘检测、纹理解析等图像解析的方法。进一步，也可以使用深度学习等机器学习的方法。根据第7方案的成像质量分析装置，能够将测量区域准确地分割成多个小区域，或者将多个质荷比值准确地分类成多个组，并在这些每个小区域或组提取显著性产物离子。
[0085]
附图标记说明
[0086]
1 成像质量分析部
[0087]
10 离子化部
[0088]
11 离子阱
[0089]
12 质量分析部
[0090]
13 检测器
[0091]
2 数据解析部
[0092]
20 光谱数据存储部
[0093]
21 产物离子提取部
[0094]
22 成像图像创建部
[0095]
23 区域包含关系判定部
[0096]
24 组成式推算部
[0097]
25 显示处理部
[0098]
3 输入部
[0099]
4 显示部
[0100]
5 试样
[0101]
50 测量区域。