一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液及其制备方法与流程

本发明涉及医学化验技术领域，具体涉及一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液及其制备方法。

背景技术：

真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量x线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。

真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌:主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有:体癣、股癣、手癣和足癣。女性阴道也是真菌感染的常见部位，临床上真菌性阴道炎占女性阴道炎症的20-25％，真菌性阴道炎是影响女性身心健康的高发疾病，真菌性阴道炎会大大影响孕期女性的怀孕率。临床上常用的白带常规检测方法漏检率较高，本发明结合本公司的荧光真菌染色液能大大提高检测的准确性，降低漏检率为女性的健康服务。

达托霉素是一种脂肽类抗生素，同时是一种生物表面活性剂。生物表面活性剂具有增溶的作用，达托霉素可增强胰蛋白酶的比活性。因此，达托霉素具有增溶和提高胰蛋白酶比活性的双重功能。

技术实现要素：

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液及其制备方法，其目的在于，提供一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液，制得的前处理液具有较好的抗菌抑菌性能，同时对粘液中的粘蛋白、糖蛋白有很好的酶解作用，对真菌的形态维持具有良好的稳定性，前处理液处理的白带样本在荧光显微镜下背景干净、干扰物少、真菌孢子和假菌丝清晰可见。从而极大提高临床样本真菌检测的准确率、敏感性、特异性，为妇科真菌性阴道炎的防治提供更好更优的诊断依据。

本发明提供一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液，包括ph为碱性的缓冲液、固定剂、稳定剂、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛和二硫苏糖醇。

作为本发明进一步的改进，由以下原料按重量份制备而成：ph为碱性缓冲液80-90份、固定剂0.01-0.5份、稳定剂0.02-1份、中药抗菌水提物0.5-5份、胰蛋白酶0.05-1份、糜蛋白酶0.05-1份、达托霉素0.1-0.5份、氯化钙0.05-0.5份、氯化镁0.05-0.5份、氯化锰0.05-0.5份、二甲基亚砜1-10份、多聚甲醛0.01-0.05份和二硫苏糖醇0.01-0.05份。

作为本发明进一步的改进，由以下原料按重量份制备而成：ph为碱性缓冲液82-88份、固定剂0.05-0.3份、稳定剂0.2-0.7份、中药抗菌水提物1-4份、胰蛋白酶0.2-0.7份、糜蛋白酶0.2-0.6份、达托霉素0.2-0.4份、氯化钙0.2-0.4份、氯化镁0.1-0.4份、氯化锰0.1-0.4份、二甲基亚砜2-8份、多聚甲醛0.02-0.04份和二硫苏糖醇0.03-0.05份。

作为本发明进一步的改进，由以下原料按重量份制备而成：ph为碱性缓冲液85份、固定剂0.2份、稳定剂0.5份、中药抗菌水提物3份、胰蛋白酶0.5份、糜蛋白酶0.4份、达托霉素0.35份、氯化钙0.32份、氯化镁0.24份、氯化锰0.32份、二甲基亚砜6份、多聚甲醛0.03份和二硫苏糖醇0.04份。

作为本发明进一步的改进，所述中药抗菌水提物由以下原料制备而成：五倍子、板蓝根、蒲公英、柴胡、五指毛桃、连翘、贝母、苍术、兔耳草和甘青乌头。

作为本发明进一步的改进，所述中药抗菌水提物由以下原料按质量份制备而成：五倍子5-10份、板蓝根10-15份、蒲公英5-15份、柴胡5-10份、五指毛桃10-15份、连翘10-15份、贝母5-10份、苍术10-15份、兔耳草5-10份和甘青乌头5-15份。

作为本发明进一步的改进，所述中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，500-700w微波加热提取1-2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm3，得到中药抗菌水提物。

作为本发明进一步的改进，所述固定剂选自戊二醛、丙烯醛、丹宁酸或高锰酸钾中的一种或几种。

作为本发明进一步的改进，所述稳定剂选自mgso4、nacl、mgcl2、甘露醇、山梨醇或蔗糖中的一种或几种。

本发明进一步保护一种制备真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的方法，包括以下步骤：将固定剂、稳定剂、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛、二硫苏糖醇溶于ph为碱性的缓冲液中，制得前处理液。

本发明具有如下有益效果：

白带是由阴道黏膜渗出物、宫颈腺体分泌物及子宫内膜腺体分泌物混合而成，内含阴道上皮脱落细胞、白细胞、乳酸杆菌，含有大量的粘蛋白、糖蛋白。本发明采用前处理液对妇科真菌标本进行消化酶解，其中胰蛋白酶和糜蛋白酶对粘液中的粘蛋白、糖蛋白具有极好的分解作用。达托霉素作为一种新的胰蛋白酶激活剂，其激活机制可能是通过达托霉素的链状天冬氨酸的r基与酶活性中心组氨酸-57发生了氢键相互作用，从而促进酶与底物的结合，提高酶的催化活性。适宜浓度的ca2+、mg2+、mn2+对胰蛋白酶均表现为显著性激活作用。向前处理液中加入二硫苏糖醇可以降低蛋白质酶解后二硫键的作用，提高蛋白酶解后的溶解性；

本发明通过添加中药抗菌水提物，该组合抗菌中药材得到的水提物具有较好的杀死细菌的效果，具有广谱高效的效果，但对真菌的威力不大，适宜作为真菌的保存液添加物；

本发明通过添加稳定剂和固定剂，有效保持真菌的形态不被改变，有助于后期研究工作，同时保存液不添加任何有毒的挥发性物质，以环保的水为溶剂，使用安全无毒副作用，且便于保存和贮藏，具有广阔的应用前景；

本发明制备方法简单、原料来源广、制得的前处理液具有较好的抗菌抑菌性能，同时对粘液中的粘蛋白、糖蛋白有很好的酶解作用，对真菌的形态维持具有良好的稳定性。

附图说明

图1为本发明一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的制备工艺图；

图2为本发明测试例中在目镜10倍，物镜40倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的念珠菌和孢子的成像示意图；

图3为本发明测试例阴道分泌物在目镜10倍，物镜10倍的情况下，通过荧光显微镜所观察到的阴道分泌物的成像示意图；

图4为本发明测试例阴道分泌物将相机于目镜10倍上的拍摄图；

图5为本发明对比例1制得的前处理液处理后的拍摄图；

图6为本发明实施例1制得的前处理液处理后的拍摄图；

图7为本发明对比例2制得的前处理液处理后的拍摄图；

图8为本发明实施例2制得的前处理液处理后的拍摄图

图9为本发明对比例3制得的前处理液处理后的拍摄图；

图10为本发明实施例3制得的前处理液处理后的拍摄图；

图11为本发明对比例4制得的前处理液处理后的拍摄图；

图12为本发明实施例4制得的前处理液处理后的拍摄图；

图13为本发明对比例5制得的前处理液处理后的拍摄图；

图14为本发明实施例5制得的前处理液处理后的拍摄图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

实施例1

原料组成(质量份)：ph为碱性缓冲液80份、戊二醛0.01份、mgso40.02份、中药抗菌水提物0.5份、胰蛋白酶0.05份、糜蛋白酶0.05份、达托霉素0.1份、氯化钙0.05份、氯化镁0.05份、氯化锰0.05份、二甲基亚砜1份、多聚甲醛0.01份和二硫苏糖醇0.01份。

中药抗菌水提物由以下原料按质量份制备而成：五倍子5份、板蓝根10份、蒲公英5份、柴胡5份、五指毛桃10份、连翘10份、贝母5份、苍术10份、兔耳草5份和甘青乌头5份。

中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，500w微波加热提取1h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm³，得到中药抗菌水提物。

一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的制备方法，包括以下步骤：将戊二醛、mgso4、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛、二硫苏糖醇溶于ph为碱性的缓冲液中，制得前处理液。

实施例2

原料组成(质量份)：ph为碱性的pbs缓冲液90份、高锰酸钾0.5份、nacl1份、中药抗菌水提物5份、胰蛋白酶1份、糜蛋白酶1份、达托霉素0.5份、氯化钙0.5份、氯化镁0.5份、氯化锰0.5份、二甲基亚砜10份、多聚甲醛0.05份和二硫苏糖醇0.05份。

中药抗菌水提物由以下原料按质量份制备而成：五倍子10份、板蓝根15份、蒲公英15份、柴胡10份、五指毛桃15份、连翘15份、贝母10份、苍术15份、兔耳草10份和甘青乌头15份。

中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，700w微波加热提取2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm³，得到中药抗菌水提物。

一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的制备方法，包括以下步骤：将高锰酸钾、nacl、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛、二硫苏糖醇溶于ph为碱性的pbs缓冲液中，制得前处理液。

实施例3

原料组成(质量份)：ph为碱性的pbs缓冲液82份、丹宁酸0.05份、山梨醇0.2份、中药抗菌水提物1份、胰蛋白酶0.2份、糜蛋白酶0.2份、达托霉素0.2份、氯化钙0.2份、氯化镁0.1份、氯化锰0.1份、二甲基亚砜2份、多聚甲醛0.02份和二硫苏糖醇0.03份。

中药抗菌水提物由以下原料按质量份制备而成：五倍子6份、板蓝根11份、蒲公英6份、柴胡6份、五指毛桃11份、连翘11份、贝母6份、苍术11份、兔耳草6份和甘青乌头6份。

中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，550w微波加热提取1h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm³，得到中药抗菌水提物。

一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的制备方法，包括以下步骤：将丹宁酸、山梨醇、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛、二硫苏糖醇溶于ph为碱性的pbs缓冲液中，制得前处理液。

实施例4

原料组成(质量份)：ph为碱性缓冲液88份、丙烯醛0.3份、蔗糖0.7份、中药抗菌水提物4份、胰蛋白酶0.7份、糜蛋白酶0.6份、达托霉素0.4份、氯化钙0.4份、氯化镁0.4份、氯化锰0.4份、二甲基亚砜8份、多聚甲醛0.04份和二硫苏糖醇0.05份。

中药抗菌水提物由以下原料按质量份制备而成：五倍子9份、板蓝根14份、蒲公英14份、柴胡9份、五指毛桃14份、连翘14份、贝母9份、苍术14份、兔耳草9份和甘青乌头14份。

中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，650w微波加热提取2h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm³，得到中药抗菌水提物。

一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的制备方法，包括以下步骤：将丙烯醛、蔗糖、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛、二硫苏糖醇溶于ph为碱性的缓冲液中，制得前处理液。

实施例5

原料组成(质量份)：ph为碱性缓冲液85份、丹宁酸0.2份、甘露醇0.5份、中药抗菌水提物3份、胰蛋白酶0.5份、糜蛋白酶0.4份、达托霉素0.35份、氯化钙0.32份、氯化镁0.24份、氯化锰0.32份、二甲基亚砜6份、多聚甲醛0.03份和二硫苏糖醇0.04份。

中药抗菌水提物由以下原料按质量份制备而成：五倍子7份、板蓝根13份、蒲公英12份、柴胡7份、五指毛桃12份、连翘12份、贝母7份、苍术12份、兔耳草8份和甘青乌头10份。

中药抗菌水提物由以下方法制备：按比例称取各原料中药材，洗净，干燥，粉碎，混合均匀后，按固液比1:10浸泡到去离子水中，600w微波加热提取1.5h，过滤，液体减压蒸馏浓缩至密度为1.2-1.5g/cm³，得到中药抗菌水提物。

一种真菌性阴道炎荧光检测的白带样本前处理液的制备方法，包括以下步骤：将丹宁酸、甘露醇、中药抗菌水提物、胰蛋白酶、糜蛋白酶、达托霉素、氯化钙、氯化镁、氯化锰、二甲基亚砜、多聚甲醛、二硫苏糖醇溶于ph为碱性的缓冲液中，制得前处理液。

对比例1

与实施例5相比，未添加达托霉素。

对比例2

与实施例5相比，未添加氯化钙、氯化镁、氯化锰。

对比例3

与实施例5相比，未添加中药抗菌水提物。

对比例4

与实施例5相比，未添加二硫苏糖醇。

对比例4

与实施例5相比，未添加稳定剂和固定剂。

测试例1

将本发明实施例1-5和对比例1-4制备的前处理液以及市售同类产品进行性能测试。

结果见表1。

表1

由上表可知，采用本发明方法进行制片，质量评估结果明显优于对比例1-5前处理液以及市售同类产品的质量。对比例1未添加达托霉素，对胰蛋白酶的激活性较差，其背景杂乱，可观察性差，细胞形态不完整。对比例2中未添加氯化钙、氯化镁、氯化锰，胰蛋白酶的活性较差，其背景较乱，可观察性较差，细胞形态不完整。对比例3中未添加中药抗菌水提物，滋生大量微生物，导致保留细胞不多，种类部分少，细胞部分完整。对比例4未添加二硫苏糖醇，导致蛋白质酶解后溶解不完全，背景较乱。对比例5中未添加稳定剂和固定剂，有少量微生物，但由于未添加稳定剂和固定剂的，导致细胞形态不完整。

参见附图5-9，采用本发明实施例制备的前处理液处理后的样品，后续制片显色后观察清晰可见，细胞形态完整，可视范围内没有其他杂物，可见本发明前处理液对真菌的形态维持具有良好的稳定性。

与现有技术相比，白带是由阴道黏膜渗出物、宫颈腺体分泌物及子宫内膜腺体分泌物混合而成，内含阴道上皮脱落细胞、白细胞、乳酸杆菌，含有大量的粘蛋白、糖蛋白。本发明采用前处理液对妇科真菌标本进行消化酶解，其中胰蛋白酶和糜蛋白酶对粘液中的粘蛋白、糖蛋白具有极好的分解作用。达托霉素作为一种新的胰蛋白酶激活剂，其激活机制可能是通过达托霉素的链状天冬氨酸的r基与酶活性中心组氨酸-57发生了氢键相互作用，从而促进酶与底物的结合，提高酶的催化活性。适宜浓度的ca²⁺、mg²⁺、mn²⁺对胰蛋白酶均表现为显著性激活作用。向前处理液中加入二硫苏糖醇可以降低蛋白质酶解后二硫键的作用，提高蛋白酶解后的溶解性；

本发明通过添加中药抗菌水提物，该组合抗菌中药材得到的水提物具有较好的杀死细菌的效果，具有广谱高效的效果，但对真菌的威力不大，适宜作为真菌的保存液添加物；

本发明通过添加稳定剂和固定剂，有效保持真菌的形态不被改变，有助于后期研究工作，同时保存液不添加任何有毒的挥发性物质，以环保的水为溶剂，使用安全无毒副作用，且便于保存和贮藏，具有广阔的应用前景；

本发明制备方法简单、原料来源广、制得的前处理液具有较好的抗菌抑菌性能，同时对粘液中的粘蛋白、糖蛋白有很好的酶解作用，对真菌的形态维持具有良好的稳定性。

本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。