测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置的制作方法

本发明涉及医疗器械技术和细胞冷冻保存技术领域，尤其涉及一种基于单细胞捕获和细胞阻抗谱的测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置。

背景技术：

低温保存是用于生殖医学、组织再生和细胞治疗等领域珍贵细胞保存的重要技术。对于一些比较稀有、价格昂贵和增殖能力有限的细胞，通过冷冻保存可显着增强其临床应用的组织可用性。但是，目前的冷冻保存技术存在复苏效率低的问题,相关的冷冻保存技术并不是十分有效。为了提高冷冻保存的成功率，冷冻保存过程的优化是首要考虑因素，其中细胞膜水利渗透性系数(lp)的准确测定对于冷冻保存的优化极其重要，且对于珍贵稀少的细胞，单细胞水平的lp测定方法有利于减少测定过程中细胞损耗。因此，开发快速、高效、精确的单细胞水平lp的测定方法具有重要意义。

在过去几十年中，研究者采用了多种方法来测定lp。一般而言，已知的方法主要包括：微观停流法、微灌注室法、灌注显微镜法、微扩散室法以及微量移液器灌注法。微观停流法是通过两种流体的混合来控制细胞外溶液的浓度变化，从而能够使用显微镜拍照记录细胞的瞬时体积变化，但是两相流也造成了无法观察细胞反向恢复的过程。微灌注室法是测量细胞lp的常规方法；在这种方法中，一组细胞可以沿着障碍物边沿被捕获，该装置不能保持被捕获的细胞分开，细胞间可能相互作用，导致测定过程中的误差。灌注显微镜法是将细胞捕获在微小结构内，改进了微灌注室法不能保持被捕获细胞分开的不足，但是用显微镜拍照计算细胞体积需假设细胞为球型，引入了结果误差。微扩散室法中细胞外液渗透压的改变是通过扩散的方法，然而该方法存在两个潜在的问题(a)透析膜容易被破坏，(b)由于透析膜的存在而引入额外的数学复杂性。微量移液器灌注法是使用微量移液器向固定的卵母细胞中灌注各向异性溶液，然而该方法只适用于具有壳的细胞类型。并且，上述方法都是采用光学显微镜拍照的方法记录细胞体积的变化过程，由于存在光学分辨率不足和人为调焦的差异，会使测量结果产生误差。总之，现有方法通常存在测量不够准确、操作复杂、适用范围小等不足；因此，在细胞lp测量应用中受到限制。

因此，迫切需要一种测量精确、适用范围广以及操作简单的单细胞lp的测定方法。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种测量精确、适用范围广的单细胞lp的测定方法。

有鉴于此，本申请提供了一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置，包括依次叠加设置的上层芯片、薄膜和下层芯片；

所述上层芯片上设置有贯通的储液槽和废液出口；

自上层芯片端，所述上层芯片的下表面设置有微通道，且所述微通道设置于所述储液槽和所述废液出口之间；

所述微通道包括主通道、前端判断通道和单细胞捕获通道，所述主通道用以连接所述储液槽、前端判断通道、单细胞捕获通道和废液出口；所述单细胞捕获通道包括对称设置的两个单细胞捕获微结构；

自上层芯片端，所述下层芯片的上表面设置有凸起结构的检测电极；

所述检测电极包括前端判断电极对和差分电极对，所述差分电极对包括测量电极对和参考电极对；

所述前端判断通道与所述前端判断电极对相对设置，所述单细胞捕获通道与所述差分电极对相对设置；

所述前端判断通道、前端判断电极和薄膜构成前端判断区；所述单细胞捕获通道、差分电极对、薄膜构成细胞膜水利渗透性系数测量区；

所述薄膜用以实现上层芯片和下层芯片的键合。

优选的，所述测量电极对和所述参考电极对关于公共输入电极对称分布。

优选的，所述测量电极对与所述单细胞捕获通道的一个单细胞捕获微结构相对设置，所述参考电极对与所述单细胞捕获通道的另一个单细胞捕获微结构相对设置。

优选的，所述单细胞捕获微结构为双路微捕获结构，所述双路微捕获结构由短而直的路径和长而环状的旁路通道组成。

优选的，所述上层芯片和下层芯片的材质独立地选自聚二甲基硅氧烷或有机玻璃，所述薄膜为聚二甲基硅氧烷薄膜。

优选的，所述上层芯片的面积独立地为5cm²～10cm²，厚度独立地为0.5cm～3cm；所述下层芯片的面积独立地为10cm²～40cm²，厚度独立地为0.1cm～0.4cm。

优选的，所述微通道的横截面的形状为矩形凹槽。

本申请还提供了所述的测量细胞水利渗透性系数的微装置在单细胞药物筛选中的应用。

本申请提供了一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置，其包括带有微通道的上层芯片、薄膜和带有检测电极的下层芯片；上层芯片的前端判断通道、下层芯片的前端判断电极和薄膜构成前端判断区，上层芯片的单细胞捕获通道、下层芯片的差分电极对和薄膜构成了细胞膜水利渗透性系数测量区；本发明所述微装置运行时，细胞悬浮液注入所述芯片中，细胞先经过前端判断区，判断区会根据阻抗输出值判断是否有细胞通过；接着，细胞在所述测量区被捕获，使用高渗溶液快速替换等渗细胞外液，细胞失水皱缩，由所述差分电极输出与细胞体积相关的阻抗变化信息，进而求得细胞膜水利渗透性系数。这种基于单细胞捕获和细胞阻抗谱的微装置能够更精确、快速、高效地测量单细胞细胞膜水利渗透性系数，有利于减少稀有细胞在测量中的损耗。

附图说明

图1为本发明实施例中提供的一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置的单个单元结构示意图与整体结构示意图；

图2为本发明实施例中提供的一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置中判断通道结构和单细胞捕获结构的放大示意图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

细胞的介电特性的阻抗法是评估细胞状态的有效方法，各种频率的细胞阻抗信号可以提供与单细胞生理状况直接相关的参数信息，例如细胞体积(<1mhz)，膜电容(1～4mhz)和细胞质电导率(4～10mhz)。单细胞阻抗流式细胞术的微流控平台已经有报道，其中细胞以连续流动的方式被驱动到微通道的感应区域，其阻抗由嵌入通道中的微电极测量。但是这样的系统通常在连续流动模式下运行，在流动系统中很难测量单个细胞的时间依赖性响应。单细胞lp的测定中通常需要在一个重要的时间过程中监测单个细胞，以便研究其动态响应特性。因此，将无标签阻抗谱技术与长期单细胞捕获方案相结合可以满足这一要求。

单细胞捕获/阻抗谱技术的主要优点分为以下几点：(a)由于采用的单细胞捕获技术，保持了细胞间相互的分离，解决了细胞间相互作用对测量结果的影响；(b)它允许随着时间观察阻抗的变化，这可以更容易的获得与细胞形态变化有关的信息；(c)适用范围广，只需修改捕获结构的尺寸即可适用于不同大小和种类的细胞；(d)它可以测量非常详细的阻抗谱，这使得提取细胞形态的过程更加可靠，lp测量更加精确，可以很好的解决显微镜拍照记录细胞体积的过程中所存在的光学分辨率不足和人工调焦误差的问题。总之，当前采用单细胞捕获/阻抗谱技术的快速，高效，精确测量细胞lp的方案还未曾报道过。

因此，本申请提出了一种基于微流控单细胞捕获和阻抗谱方案的细胞lp测定装置；如图1所示，图1为本发明实施例中提供的一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置的单个单元结构示意图与整体结构示意图，其中(a)单个单元结构示意图，1为带有微通道的上层芯片，2为中间聚二甲基硅氧烷薄膜，3为带有检测电极的下层芯片；(b)装置整体结构示意图；(c)是为带有微通道的上层芯片1正视图，其中，4为储液槽，5为废液出口，6为前端判断通道，7、8为两个单细胞捕获微结构，7、8组成单细胞捕获通道；(d)是聚二甲基硅氧烷薄膜正视图；(e)是带有检测电极的下层芯片3正视图，其中，包含判断电极对(电极9和10组成)和差分电极对，差分电极对包含测量电极对(电极11和12组成)、参考电极对(电极12和13组成)。

具体的，本发明所述测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置，包括依次叠加设置的上层芯片、薄膜和下层芯片；

所述上层芯片上设置有贯通的储液槽和废液出口；

自上层芯片端，所述上层芯片的下表面设置有微通道，且所述微通道设置于所述储液槽和所述废液出口之间；

所述微通道包括主通道、前端判断通道和单细胞捕获通道，所述主通道用以连接所述储液槽、前端判断通道、单细胞捕获通道和废液出口；所述单细胞捕获通道包括对称设置的两个单细胞捕获微结构；

自上层芯片端，所述下层芯片的上表面设置有凸起结构的检测电极；

所述检测电极包括前端判断电极对和差分电极对，所述差分电极对包括测量电极对和参考电极对；

所述前端判断通道与所述前端判断电极对相对设置，所述单细胞捕获通道与所述差分电极对相对设置；

所述单细胞捕获通道、差分电极对、薄膜构成细胞膜水利渗透性系数测量区；所述前端判断通道、前端判断电极和薄膜构成前端判断区；

所述薄膜用以实现上层芯片和下层芯片的键合。

本发明提供的一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置，其包括带有微通道的上层芯片和带来检测电极的下层芯片，所述通道的深度小于芯片的厚度，所述微通道位于上层芯片的下表面，所述检测电极位于下层芯片的上表面。如图1c、e所示，为本发明实施例提供测量单细胞细胞膜水利渗透性系数工作平台的上下层芯片概念图。本发明对所述上、下层芯片的形状、材料没有特殊的限制，满足实际操作条件即可。

在本发明的实施例中，所述上、下层芯片的形状为长方形，上层芯片材料为聚二甲基硅氧烷(pdms)，长宽高为3.5cm×2cm×1cm。下层芯片材料为具有氧化铟锡(ito)层的有机玻璃，长宽高为6cm×3.4cm×0.1cm；在其他的实施例中，上层芯片和下层芯片的形状可为圆形或正方形，上层芯片材料可为有机玻璃(pmma)，下层芯片材料可为印刷电路板(pcb)。在具体实施例中，可通过改变通道深度和宽度调节上层芯片的尺寸大小，所述上层芯片的面积独立地为5cm²～10cm²，厚度独立地为0.5cm～3cm；可通过改变电极长度和宽度调节下层芯片的尺寸大小，所述下层芯片的面积独立地为10cm²～40cm²，厚度独立地为0.1cm～0.4cm。

图2(a)为本发明实施例提供的测量单细胞细胞膜水利渗透性系数工作平台中微通道结构的示意图，所述微通道包括储液槽4，废液出口5，前端判断通道6，两个单细胞捕获微结构7、8，两个单细胞捕获微结构组成单细胞捕获通道。在本发明的实施例中，主通道宽300μm，高20μm；前端判断通道中微通道的长宽高均为20μm，如图2(a)所示。

单细胞捕获通道包含两个相同的单细胞捕获微结构，单细胞捕获微结构如图2(b)所示，图2(b)为本发明实施例提供的测量单细胞细胞膜水利渗透性系数工作平台中单细胞捕获微结构的示意图。在本发明的实施例中，所述单细胞捕获微结构的设计方式为一条短而直的路径，其中包含一个小的捕获间隙，小于一个细胞的大小，以便机械地固定细胞；还有一个长而环状的旁路通道。由于两条路径之间的长度和几何的差异，沿短通道的流动阻力可以设计成小于沿旁路通道的流动阻力，这导致短通道中更大的流速，这可以有效的将细胞捕获在短通道的陷阱位置。当设计有环形通道时，当细胞被捕获后，短直通道流阻会增大，流体会更多的流向环形通道，减轻了当只有短直通道时流体对细胞的挤压，降低了结果误差；当细胞被捕获后，其他细胞或细胞碎片如果移向了捕获结构，那么就会从环路通道流过，防止出现多个细胞同时被捕获。

在本实施例中，细胞经过储液槽驱动进微通道，先经过前端判断通道，再在第一个单细胞捕获通道被捕获，不含细胞的溶液由废液出口流出。

在具体实施例中，所述下层芯片是由有机玻璃制成，检测电极由氧化铟锡材料制成，如图2(b)所示；每两个电极构成一组电极对，电极9和电极10为前端判断电极对，电极11和电极12为测量电极对，电极12和电极13为参考电极对，测量电极对和参考电极对又构成差分电极对。判断电极对在前端判断通道下方，差分电极对在捕获通道下方，其中，测量电极对在第一个单细胞捕获微结构7下方，参考电极对在第二个单细胞捕获微结构8下方。差分电极对关于公共输入电极12对称分布。在本发明实施例中，电极尺寸如：l1、l2、l3。本发明实施例中氧化铟锡电极尺寸都是毫米级别，采用毫米尺寸的电极更有利于加工制作，降低制作成本，且在与上层芯片的利用氧等离子体技术键合过程中更加容易对准。

捕获结构7是用来捕获细胞的，且每次只捕获一个，捕获结构8不用来捕获细胞。测量电极对和参考电极对构成差分电极结构，测量电极位于7位置的下方，参考电极对位于8位置的下方，两部分是成对称分布。上述对称设置方式是为了消除在实验过程中，溶液电解反应和外界干扰带来的基线电流电压漂移对试验结果的影响。当未捕获细胞之前，虽然发生电解反应或外界干扰，因为两个结构完全对称的，这种电解反应或外界干扰对两对电极输出电压的影响的是相同的，所以两对电极输出电压始终是相同的(制作工艺很高，两结构完全相同)或两输出电压之比为始终是常数(制作工艺不完美，两结构存在差异)。当7结构捕获细胞后，测量电极对输出电压会因捕获了细胞而变化，但是因为8结构没有捕获细胞，参考电极的输出电压就不会发生变化。以参考电极输出电压为参考就可以计算出此时测量电极输出电压的基线(电压的基线是指在没有捕获细胞的情况下输出的电压值，因为在它们在没有捕获细胞前输出电压是相同的或者比值是一个常数，所以可以根据其中一个输出电压计算出另一个输出电压值)，测量电极对输出电压值减去测量电极对基线电压值所得结果就是细胞引起的电压变化。

本发明中在差分电极前设置判断电极对，判断电极对的引入有利于提高单细胞捕获效率，当判断电极对检测到有细胞通过时就会反馈控制降低流体速度，使细胞速度降低，增大在捕获通道内被捕获的成功率。每一对电极都包括一个输入电极和一个输出电极，输入电极输入固定频率的激励信号，输出电极输出两电极间阻抗信息。细胞进入电极对间的所述的微通道会引起电极间阻抗变化，从采集到的阻抗值中可提取与细胞体积有关的信息。

在本发明中，采用这种前端判断电极对和差分电极对的相互组合的方法能够更精确地测量单细胞细胞膜水利渗透性系数，减少光学测量方法中引入的误差，减少稀有细胞在测量中的损耗。在其他实施例中，可采用导电率更加高的金电极来提高输出信号信噪比，提高单细胞细胞膜水利渗透性系数测量精确度。

在本发明的实施例中，所述微通道横截面的形状为矩形凹槽，所述凹槽的深度固定，宽度可变。在本发明的实施例中，所述矩形凹槽通道的宽度可以为0.1mm～0.4mm，深度可以为0.02mm；在其他的实施例中，所述通道的宽度可以为0.1mm～2mm，深度可以为0.02mm～0.06mm。本发明中，采用尺寸较小通道能够有利于驱动细胞，能够更加有效的捕获单个细胞，提高检测灵敏度，提高信噪比。

本发明提供的一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置包括设置在所述上层芯片和下层芯片之间的聚二甲基硅氧烷(pdms)薄膜，如图1a(2)所示。在本发明中，所述聚二甲基硅氧烷薄膜的形状没有特殊的限制，采用尺寸能完全覆盖所述检测电极即可，采用pdms薄膜的目的是促进上层芯片和下层芯片利用等离子体技术键合，使芯片键合更加牢固，提高下层芯片的重复利用率。所述薄膜为将聚二甲基硅氧烷和甲苯混合旋涂在所述下层芯片上，然后固化所得。其中膜的厚度不固定，本实施例中膜的厚度可以为5μm～10μm，其中膜越薄细胞阻抗检测灵敏度越高。

在本发明的实施例中，微装置的制备方法如下：所述带有微通道的上层芯片制作过程可以描述为：光刻胶su-82050涂覆在3英寸硅片上，厚度为20μm，暴露于直接激光刻蚀机进行刻蚀，接下来，图形硅片是用su-8显影剂和去离子水冲洗并进行硬烘烤；最后，将聚二甲基硅氧烷预混料倒在盘中的su-8模具顶部，并在80℃烤箱中固化1小时，以形成上层芯片；本发明的实施例中，所述的带有检测电极的下层芯片制作过程可以描述为：电极图案是使用autocad2013设计的；采用激光刻蚀技术0.1cm厚的玻璃面上制备氧化铟锡电极。所述的聚二甲基硅氧烷薄膜制作过程可以描述为：将聚二甲基硅氧烷和甲苯混合溶液在所述下层芯片上通过旋涂方式铺平，然后固化形成薄膜。本发明的实施例中，带有微通道的上层芯片和带有所述薄膜的下层芯片用氧等离子体处理40s，并结合在一起形成微装置。然后，将芯片放置在80℃下至少30分钟。

在本发明的另一方面，所述微装置还可以拓展用于单细胞的药物筛选。

本发明上述微装置运行时，细胞悬浮液注入所述微流体芯片中，细胞先经过前端判断区，判断区会根据阻抗输出值判断是否有细胞通过；接着，细胞在所述测量区被捕获，使用高渗溶液快速替换等渗细胞外液，细胞失水皱缩，由所述差分电极输出与细胞体积相关的阻抗变化信息，进而求得细胞膜水利渗透性系数。这种基于单细胞捕获和细胞阻抗谱的微装置能够更精确、快速、高效地测量单细胞细胞膜水利渗透性系数，有利于减少稀有细胞在测量中的损耗。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

具有图1所示的一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数装置结构示意图和微装置上、中、下层芯片概念图，包括：

测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置的上、中、下层芯片的形状为长方形，上层芯片材料为聚二甲基硅氧烷(pdms)，长宽高为3.5cm×2cm×1cm；下层芯片材料为具有氧化铟锡(ito)层的有机玻璃，长宽高为6cm×3.4cm×0.1cm；所述上层芯片下表面的微通道包括圆柱形储液槽(半径为0.25cm，深度为1cm)、主通道、前端判断通道、单细胞捕获通道和圆柱形废液出口(半径为0.1cm、深度1cm)；其中主通道宽300μm，高20μm；前端判断通道的微通道长宽高均为20μm；单细胞捕获通道包含两个相同单细胞捕获微结构，每个单细胞捕获微结构的设计方式为一条短而直的路径和一条长而环状的旁路通道；一条短而直的路径其中包含一个小的捕获间隙，长宽高为4μm×4μm×20μm；一条长而环状的旁路通道，总长200μm，宽10μm，高20μm。在本实施例中；图1中4是储液槽，是细胞悬浮液和高渗溶液入口，5是废液出口；

所述下层芯片上表面的检测电极包括前端判断电极对和差分电极对，其中差分电极对由测量电极对和参考电极对组成，测量电极对和参考电极对有一个公共输入电极，两对电极关于公共输入电极对称；电极9、11、13尺寸相同，长宽分别为3.8mm和1.5mm；电极10长宽为2mm×1.5mm；电极12长宽为1.5mm×1mm；

所述设置在上下层芯片间的聚二甲基硅氧烷薄膜，薄膜厚度为5μm，且其尺寸要完全覆盖检测电极；

所述上层芯片和下层芯片通过氧等离子体处理的方式键合固定。

实施例2

采用实施例1提供的测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置进行诱导性多能干细胞的水利渗透性系数的测量，具体过程为：

向30mlpbs中加入6.4g甘露醇配置高渗溶液，使用电导率仪测量溶液电导率，用nacl溶液滴定的方法使高渗溶液的电导率和原pbs溶液电导率保持相同；

将固定频率500khz的正弦信号输入到所述判断电极对、差分电极对输入电极端，使用注射泵向储液槽中注入密度为1000cell/ml的诱导性多功能干细胞的细胞悬浮液，使用与出口相连接的注射泵以10μl/min的流速抽取细胞悬浮液，驱动细胞从储液槽进入芯片；当检测到第一个细胞经过判断电极时，降低出口泵的抽取速度到0μl/min，直到细胞在单细胞捕获通道中的捕获微结构内被捕获，停止出口泵的抽取；接下来，使用注射器抽空储液槽中剩余的细胞悬液，向其中注入所述的高渗溶液，使用出口处注射泵以10μl/min的流速驱动高渗溶液快速替换细胞外液，细胞失水皱缩，差分电极输出和细胞体积相关的阻抗变化信息，最终，求得细胞膜水利渗透性系数。

测试结果为：采用本发明实施例1提供的基于单细胞捕获和细胞阻抗谱原理的细胞膜水利渗透性测量微装置进行诱导多能性干细胞的细胞膜水利渗透性系数测量，在短时间内高效的完成了测量，测量结果为0.48±0.05μm/atm/min。这个结果表明，所述单细胞细胞膜水利渗透性系数测量微装置能够精确、快速、高效的用于单细胞细胞膜水利渗透性系数的测量。

本发明提供了一种测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的工作平台，包括：带有微通道的上层芯片，所述上层芯片包括储液槽、主通道、判断通道、单细胞捕获通道和废液出口；带有检测电极的下层芯片，所述下层芯片包括判断电极对和差分电极对，其中差分电极对由测量电极对和参考电极对组成；设置在所述上层芯片和下层芯片之间的聚二甲基硅氧烷薄膜；所述上层芯片的单细胞捕获通道、下层芯片的差分电极对和设置在上层芯片、下层芯片之间的聚二甲基硅氧烷薄膜组成细胞膜水利渗透性系数测量区；所述上层芯片的前端判断通道、前端判断电极和聚二甲基硅氧烷薄膜构成前端判断区。

所述上层芯片用于细胞悬液通过和细胞捕获；所述下层芯片用于细胞经过电极对间通道时的阻抗信息测量；所述前端判断区完成是否有细胞通过的检测；所述细胞膜水利渗透性系数测量区完成单细胞的捕获和与细胞形态变化相关的阻抗信息测量。

本发明提供的测量单细胞细胞膜水利渗透性系数的微装置，将细胞悬浮液从储液槽驱动到芯片中，先经过所述前端判断区，检测到有细胞通过，进而控制驱动速度，让细胞在单细胞捕获通道内被捕获；将高渗溶液从储液槽驱动到芯片中，细胞外液渗透压快速上升，被捕获的细胞失水皱缩，差分电极输出与细胞体积相关的阻抗变化信息，进而求出细胞膜水利渗透性系数。采用单细胞捕获和细胞阻抗谱相结合的技术，可以精确的测量细胞膜水利渗透性系数，有助于减少珍贵细胞在测量中的损耗。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。