游离D型氨基酸的富集检测方法与流程

本发明涉及一种利用离子交换固相萃取富集，高效液相手性色谱分离，质谱检测食品，饮料，动植物，及其它含有氨基酸试样中20种游离d型氨基酸的富集检测方法。

背景技术：

氨基酸是一类在食品及饮料中常见的物质，是重要的感官品质和营养成分，其含量、种类及比例是评价食品营养价值优劣的主要指标之一。氨基酸本身具有鲜味，同时在食品中还可以补充和增强原有的风味。在一些果汁饮料中，氨基酸参与果实其他品质特征成分和风味物质的合成。并且在酿造过程中，氨基酸的含量水平不仅体现在发酵的工艺特征上，而且与食物的品种，产地密切相关。同时含有氨基酸的运动饮料被人体饮用后，氨基酸会直接被血液输送到身体的各个器官，供给肌肉的需要。因此食品及饮料中氨基酸的组分和准确定性定量分析可以为人们合理膳食，营养搭配提供指导，具有重要意义。

氨基酸是生物体内最重要的活性分子，除甘氨酸外，所有的α氨基酸分子中的α碳原子都为不对称原子，均有对映异构体。长期以来，l-氨基酸被认为是生物体内唯一的氨基酸形式。近年来，d-氨基酸已被发现存在于人和动物体内，并已证明具有一些重要的生理功能，人们也渐渐认识到d型氨基酸在生物体中也起着很重要的作用。在医学制药上，如果将d-氨基酸加入氨基酸类抗生素中，则会大大降低药物被细菌降解的几率，服用后难以产生抗药性。此外，l型氨基酸少数几种具有鲜味，而d型氨基酸普遍具有甜味，其中d-色氨酸的甜度约为蔗糖的35倍。因此单独研究单一氨基酸构型在很多领域具有重大意义。这样开发一种快速，简单的分离检测d型氨基酸的方法就显得尤为重要。

由于在分析手段上的限制，食品及饮料中氨基酸对映异构体的存在鲜有报道。目前氨基酸的分析方法多为衍生法，柱前衍生步骤较繁琐，衍生副产物产生分析干扰，而柱后衍生所需附加装置加工昂贵，分析时间长。氨基酸多数没有显色基团，用紫外检测灵敏度低。d-氨基酸在试样中通常是痕量成分，难以用常规方法检测。此外，非衍生法同时拆分多种氨基酸对映异构体具有较大挑战性。因此本发明提供一种离子交换固相萃取富集，高效液相手性色谱分离，质谱检测的方法，可达到对试样中d-氨基酸定性和定量分析，样品无需进行衍生化。本方法可被应用于食品、饮料、动植物、以及其它需要分析d型氨基酸的试样中。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种食品、饮料、配料及动植物中d型氨基酸的检测方法，前处理简单，检测方法简单，易于操作，定性准确，定量精确，且重复性好，能够实现20种d型氨基酸的同时检测。

本发明采用的技术方案如下：

一种游离d型氨基酸的富集检测方法，其特点在于包括以下步骤：

s1、待测样品制备；

s2、待测样品中氨基酸的富集；

s3、待测样品中氨基酸对映异构体的拆分；

s4、待测样品中氨基酸的鉴定与定量；

进一步，所述步骤s3、s4中d-氨基酸和l-氨基酸的拆分与检测采用手性液相-质谱分析方法，分析条件如下：

液相条件：

手性色谱柱：astecchirobiotict(4.6mmi.d.,250mm5μm)；

流动相：a：水(0.02％甲酸)b：甲醇(0.02％甲酸)；

流速0.8-1.2ml/min；进样量20μl；柱温：30℃；梯度洗脱；

本发明检测方法适用于不同的液质联用仪器；各种高效液相色谱可用于连接手性柱，分离氨基酸对映异构体，各种与高效液相色谱联用的质谱仪器均适用于氨基酸的直接检测而无须衍生；现以四级杆-飞行时间质谱和三重四级杆质谱为例，分析条件如下：

a、四级杆-飞行时间质谱分析条件：电喷雾正离子扫描模式(esi+)，氮气用作干燥气，毛细管电流5.324μa，腔电流7.37μa，离子传输毛细管温度200℃，流速设置为8l/min，脱溶剂温度200℃，雾化气压设置为35psig，碰撞电压175v，锥孔电压65v，鞘气温度200℃，扫描速率2spectra/s；一级ms质量范围设定为m/z50-300，通过上述优化质谱参数得到响应最大的分子离子峰作为母离子，接着在msms模式下，通过优化碰撞能量使其子离子的响应最大化；二级msms质量范围设定为m/z42-240；

b、三重四级杆质谱分析条件：电喷雾正离子离子源(esi+)，氮气用作干燥气，毛细管电流5.324μa，腔电流7.37μa，离子传输毛细管温度200℃，流速设置为8l/min，脱溶剂温度200℃，雾化气压设置为35psig，碰撞电压135v，锥孔电压65v，鞘气温度200℃，扫描速率2spectra/s；一级fullscan质量范围设定为m/z50-300，随后进行production模式对母离子进行子离子扫描，通过上述优化碰撞能量使其子离子的响应最大化，采用mrm多反应监测模式，对dl-氨基酸进行定量分析。

进一步，所述流动相的洗脱条件如下：

进一步，所述步骤s1中的待测样品包括食品、饮料、配料、动植物、及其它需要检测d-氨基酸的试样。

进一步，所述植物包括茶叶，当待测样品为茶叶时待测样品制备步骤如下：

(1)茶样制备：将茶叶用研磨机磨粉得干茶粉；

(2)茶汤的冲泡：取干茶粉1.5g，加入30ml沸水，在90℃水浴中保温10分钟后，过滤，冷却至室温，茶汤用6m甲酸调至ph2.8；

(3)固相萃取步骤：采用强阳离子固相萃取柱，用10ml甲醇(含0.1％甲酸)洗柱。加入茶汤30ml过柱。分别用5ml0.1％的甲酸水溶液和5ml甲醇淋洗，最后用3ml5％氨水进行洗脱.洗脱液在40℃下氮气吹干后用1ml水溶解残留物作为分析样品。

进一步，所述20种dl型氨基酸包含dl-异亮氨酸、dl-亮氨酸、dl-缬氨酸、dl-酪氨酸、dl-谷氨酸、dl-色氨酸、dl-苏氨酸、dl-苯丙氨酸、dl-甲硫氨酸、dl-丙氨酸、dl-丝氨酸、dl-天冬氨酸、dl-半胱氨酸、dl-谷氨酰胺、dl-天冬酰胺、dl-脯氨酸、dl-赖氨酸、dl-精氨酸、dl-组氨酸及dl-茶氨酸。

与已有技术相比，本发明方法，可以成功用固相萃取柱富集，在手性柱上分离并在质谱仪上同时检测20对dl-氨基酸，在实例中也成功用于茶叶中d-氨基酸的定性定量分析。检测方法只使用了简单流动相，可对较宽浓度范围的d型氨基酸进行检测，结果精确定性定量分析，具有分离速度快，无需衍生化的优点，提高了检测的效率降低了成本。若需测定试样中d型氨基酸，可以依照本发明的指导进行检测或在此基础上进行相应的优化后进行检测。

附图说明

附图1中b是在茶汤中检测到的d-茶氨酸的色谱图；

附图1中d是茶样中d-茶氨酸的二级质谱图

附图1中a是茶汤中加入d-茶氨酸标准品后的色谱图

附图1中c是d-茶氨酸标准品的二级质谱图

具体实施方式

以下结合实例来对本发明做进一步的解释说明。本实例仅用于具体说明该方法，并非对本发明的适用范围进行限制。

采用的仪器：hplc-q-tof-ms/ms12906545(美国，安捷伦公司)

实施例120种氨基酸的手性分离

1)氨基酸标准储备液配制20种d型氨基酸标准品溶于0.1m盐酸水溶液中，每种氨基酸浓度为1mm。。实验中所需的浓度用水稀释配制；

2)dl氨基酸定性定量参数的确定

高效液相手性色谱-质谱联用分析，以dl-氨基酸的保留时间，质谱特征峰离子作为定性参数，msms的子离子峰面积作为定量参数。

3)检测的氨基酸标准品包含dl-异亮氨酸、dl-亮氨酸、dl-缬氨酸、dl-酪氨酸、dl-谷氨酸、dl-色氨酸、dl-苏氨酸、dl-苯丙氨酸、dl-甲硫氨酸、dl-丙氨酸、dl-丝氨酸、dl-天冬氨酸、dl-半胱氨酸、dl-谷氨酰胺、dl-天冬酰胺、dl-脯氨酸、dl-赖氨酸、dl-精氨酸、dl-组氨酸及dl-茶氨酸。

4)液相色谱-质谱联用分析条件：

液相条件：

手性色谱柱：astecchirobiotict(4.6mmi.d.,250mm5μm)；

流动相：a：水(含0.02％甲酸)b：甲醇(含0.02％甲酸)进样量：20μl柱温：30℃

流动相的洗脱条件如下：

各种高效液相色谱可用于连接手性柱分离氨基酸对映异构体，各种鱼高效液相色谱联用的质谱仪器均适用于氨基酸的直接检测而无须衍生。现以四级杆-飞行时间质谱和三重四级杆质谱为例分离说明。

四级杆-飞行时间质谱分析条件：电喷雾正离子扫描模式(esi+)，氮气用作干燥气，毛细管电流5.324μa，腔电流7.37μa，离子传输毛细管温度200℃，流速设置为8l/min，脱溶剂温度200℃，雾化气压设置为35psig，碰撞电压175v，锥孔电压65v，鞘气温度200℃，扫描速率2spectra/s。一级ms质量范围设定为m/z50-300，优化质谱参数得到响应最大的分子离子峰作为母离子，接着在msms模式下，通过优化碰撞能量使其子离子的响应最大化。二级msms质量范围设定为m/z42-240。质谱特征峰离子结合色谱保留时间作为d-氨基酸的定性依据，msms的子离子峰面积作为定量参数。

三重四级杆质谱分析条件：电喷雾正离子离子源(esi+)，氮气用作干燥气，毛细管电流5.324μa，腔电流7.37μa，离子传输毛细管温度200℃，流速设置为8l/min，脱溶剂温度200℃，雾化气压设置为35psig，碰撞电压135v，锥孔电压65v，鞘气温度200℃，扫描速率2spectra/s。一级fullscan质量范围设定为m/z50-300，随后进行production模式对母离子进行子离子扫描，通过优化碰撞能量使其子离子的响应最大化，采用mrm多反应监测模式，对dl-氨基酸进行定量分析。质谱特征峰离子结合色谱保留时间作为d-氨基酸的定性依据，msms的子离子峰面积作为定量参数。

表120种氨基酸的手性分离参数表

由表1结果可以看出，在上述液相色谱和质谱的方法下，除了异亮氨酸和亮氨酸由于具有相同的分子量，l型异亮氨酸和亮氨酸的色谱峰会重叠，d型异亮氨酸和亮氨酸色谱峰会部分重叠，其余氨基酸都实现了基线分离，并且每一对氨基酸的l型和d型也实现了很好的分离。

5)高效液相手性色谱串联质谱分离dl-氨基酸方法学验证

实验将混标溶液重复进样3次，以3倍信噪比计算每一对氨基酸的检测限，10倍信噪比计算定量限。

每一对dl-氨基酸的检测限、定量限以及回收率如表2所示。

表220种dl-氨基酸方法学考察结果

由表2结果可以看出，20种氨基酸的回收率为72.1％-98.8％，除谷氨酸回收率相对较低外，其余氨基酸都实现了很高的回收率，表明回收率达到定量要求，本发明所建立的方法具有可靠的准确性和精密度。

实施例2干茶中dl-氨基酸对映异构体的定性定量分析

实例中实验数据均为三次平行实验结果。

1.d-氨基酸的定性分析：

(1)茶样制备：大吉岭红茶(djl2018)，布隆迪(bld2018)，斯里兰卡(sllk2018)，阿萨姆(asm2018)，用研磨机磨粉；

(2)茶汤的冲泡：取干茶粉1.5g，加入30ml沸水，在90℃水浴中保温10分钟后，过滤，冷却至室温。茶汤用6m甲酸调至ph2.8；

离子交换固相萃取步骤：采用强阳离子固相萃取柱，用10ml甲醇(含0.1％甲酸)洗柱。加入茶汤30ml过柱。分别用5ml0.1％的甲酸水溶液和5ml甲醇淋洗，最后用3ml5％氨水进行洗脱.洗脱液在40℃下氮气吹干后用1ml水溶解残留物作为分析样品。

如图1所示，在茶汤的检测中发现d-茶氨酸的出峰时间和d-茶氨酸标准品出峰时间很接近，并且质谱中也找到特征离子碎片。为了使实验更加严谨，实验采用标准加入法，在茶汤样品中加入d-茶氨酸，发现在同一个位置，这个色谱峰明显变高，因为含量变高，且质谱的特征离子碎片更加明显，由此可以认为这个峰是d-茶氨酸的色谱峰，这个茶汤样品中存在d-茶氨酸。

2.d-氨基酸的定量分析：

(1)比例法定量：用实施例1中的手性液相-质谱分析条件分析经离子交换固相萃取所得的分析样品，可以获得d-氨基酸峰面积；为使l-氨基酸响应在仪器线性范围内，取原分析样品稀释100-200倍，用上述同样的方法可以分析获得l-氨基酸峰面积；每对dl-氨基酸的总量可以按常规分析法测定，比如：accq-tag柱前衍生法。然后通过以下公式计算得到d-氨基酸在样品中含量；公式如下：

式中，wd为d-氨基酸含量，ws为dl-氨基酸的总量；ad为d-氨基酸峰面积；al为l-氨基酸峰面积。

(2)外标法定量：将d型氨基酸标准品溶于0.1m盐酸水溶液中，每种氨基酸浓度为1mm。标准储备液梯度稀释后用lc-ms分析。以定量离子峰面积和氨基酸浓度作标准曲线。

以面积比例法为例，茶样中d型氨基酸含量如表3所示。实验结果表明，在不同类型的干茶中，检测到d-氨基酸，并进行了定性定量分析。

表3不同种类的干茶中d-氨基酸的含量表

theanine(thea)，threonine(thr)，isoleucine/leucine(ile/leu)，phenylalanine(phe)，tyrosine(tyr)，alanine(ala)，dl(mg/g)，d(μg/g)，d/l(％)空白处为未检测到。

综上所述，采用本发明所述方法，可以成功在手性柱上分离20对dl-氨基酸，在实例中也成功用于茶叶中d-氨基酸的定性定量分析。检测方法只使用了简单流动相，前处理简单，容易操作，可实现对茶叶中d-氨基酸精确定性定量分析，具有分离速度快，无需衍生化的优点，提高了检测的效率降低了成本。若需测定食品或药品中d型氨基酸，可以依照本发明的指导进行检测或在此基础上进行相应的优化后进行检测。