高效液相色谱法测定贝芪益肺片中贝母素甲、黄芪甲苷的含量方法与流程

本发明涉及药物分析
技术领域：
，尤其涉及一种高效液相色谱法测定贝芪益肺片中贝母素甲、黄芪甲苷的含量方法。
背景技术：
：贝芪益肺片来源于山东临沂陈秋龄先生经验方，该方在山东、东北一带用于治疗肺痨近百年，后传于长子陈作恩先生，陈作恩先生行医过程中结合中医治疗原则及当时肺结核的发病特点，将家传经验方散剂不断加以完善、改进，逐渐形成固定配方并制成中成药蜜丸应用于临床。2002年经通化市结核病医院引进，疗效确切。2003年获吉林省院内制剂文号(吉药制字z03a0004)，经不同类型的肺结核患者治疗观察，该品种单独用药可明显改善患者体质及临床症状，促进病灶吸收和空洞闭合；与化疗药联合应用可减轻其毒副作用，使患者顺利完成常规化疗，加快痰菌阴转及病灶吸收。方中黄芪大补脾肺之气，既通过滋养肺阴，补脾助肺，以助生化之源，又能固表止汗为君药，麦冬育阴养荣，填补精血，百合得土金之气润肺止咳，又能清肺中虚热，共为臣药，佐以贝母润肺止咳，百部、白及补肺杀虫，三七化瘀止血，桔梗开宣肺气，祛痰排脓；三七为止血要药，止血不留瘀血，与贝母、白及合用以坚敛肺脏、封填破损，死肌可去、瘀血可散，有托旧生新之妙用。使以鱼腥草、胡黄连、猫爪草清热散结、化痰止咳。上药合力共奏益气养阴、润肺止咳、生肌止血之功，攻补兼施，诸症自消。现代研究表明黄芪含有多种化学成分，如皂苷类，黄酮类，木脂素类，氨基酸类，多糖类及多种微量元素等。其所含的三萜皂苷类化合物-黄芪甲苷，是黄芪的主要的有效成分，也是贝芪益肺片的主要有效成分。因此，作为贝芪益肺片的质量标准评价手段，黄芪甲苷含量测定的准确与是保证产品疗效的技术关键。然而，目前贝芪益肺片的质量标准中黄芪甲苷含量测定采用的是薄层色谱扫描法。但薄层色谱扫描法操作较繁琐，且受影响因素较多，结果不够准缺。如薄层层析时，展开温度，展开系统的饱和性，所用硅胶板颗粒的大小，硅胶板的紧密性等都会影响黄芪甲苷的含量测定，虽然用了共薄层的方法消除了部分误差，但各次实验间的重现性较差。此外，为了排除其它成分的干扰和背景的干扰，须经过多步分离纯化，而且在纯化过程中黄芪甲苷的损失也较多。同时，现行质量标准中含量测定仅有黄芪甲苷一项，评价贝芪益肺片的方法不够全面，不足以保证产品质量和疗效。技术实现要素：本发明针对上述技术问题，提供一种高效液相色谱法测定贝芪益肺片中贝母素甲、黄芪甲苷的含量方法。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种高效液相色谱法测定贝芪益肺片中贝母素甲、黄芪甲苷的含量方法，包括以下步骤：s1、对照品溶液的制备：称取贝母素甲和黄芪甲苷对照品各10mg，置不同10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液i；量取上述中各对照品储备液i适量混匀，以甲醇稀释成含贝母素甲50μg/ml、黄芪甲苷100μg/ml的对照品储备液ii；s2、供试品溶液的制备：称取样品0.5000g，加入甲醇索氏提取4小时，减压浓缩至10ml，过滤即得；s3、依次量取对照品储备液i、对照品储备液ii和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪测定，以外标两点法对数方程计算，即得测定结果，本品每片含黄芪以黄芪甲苷c41h68o14计，不得少于0.04mg，本品每片含平贝母以贝母素甲c41h68o14计，不得少于0.05mg。其中，步骤s2中索氏提取温度为110℃。步骤s3中高效液相色谱仪的检测器采用蒸发光散射检测器。步骤s3中高效液相色谱条件为：色谱柱：c18；流动相a:0.1％甲酸+0.03％三乙胺水溶液；流动相b:乙腈；柱温：35℃；流速：0.8ml/min；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度：75℃；空气流速：2.5ml/min。与现有技术相比，本发明的技术效果：本发明提供的高效液相色谱法测定贝芪益肺片中贝母素甲、黄芪甲苷的含量方法，操作简单、快速，替代现有标准的薄层色谱法测定黄芪甲苷含量，并增加了醇提药味-贝母素甲的含量测定项，一次操作即可同时完成两项含量测定，方法简单，快速，测定出贝母素甲、黄芪甲苷的含量准确，灵敏度高，评价贝芪益肺片的方法更加全面，进一步保证了产品质量和疗效，符合药品质量控制的要求。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例提供的贝母素甲标准曲线；图2为本发明实施例提供的黄氏甲苷标准曲线。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。样品采用通化吉通药业有限公司(原通化永仓药业有限公司)生产的贝芪益肺片。【处方】黄芪200g百合100g麦冬100g平贝母80g百部150g桔梗100g胡黄连150g猫爪草120g鱼腥草150g白及100g三七50g【制法】以上十一味，三七、白及粉碎成细粉；平贝母、百部、鱼腥草加70﹪乙醇提取2次，第一次2小时，第二次1小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成清膏；药渣与其余黄芪等六味加水煎煮二次，每次1.0小时，合并煎液，滤过，滤液与上述清膏合并，浓缩至相对密度为1.30～1.32(50℃)的稠膏，加入三七、白及细粉，混匀，干燥，粉碎成细粉，加入适量淀粉，制成颗粒，干燥，压制成1000片，包薄膜衣，即得。【性状】本品为薄膜衣片，除去包衣后显棕黄色；味微苦。仪器采用华谱u6000高效液相色谱仪，通微5800型蒸发光检测器。色谱柱：welchultimatexb-c18(4.6mm×250mm，5μm)照高效液相色谱法《中国药典》(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸+0.03％三乙胺水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表规定进行梯度洗脱；蒸发光检测器检测；柱温为35℃；漂移管温度75℃，流速0.8ml·min-1，空气流速2.5ml·min-1。按下表进行梯度洗脱:时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0min90％10％5min90％10％15min60％40％20min50％50％25min30％70％30min30％70％35min90％10％45min90％10％对照品储备液的制备精密称定对贝母素甲、黄芪甲苷对照品各10mg，置不同10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液i。精密量取上述中各对照品储备液i适量混匀，以甲醇稀释成含对贝母素甲50μg·ml-1、黄芪甲苷100μg·ml-1的对照品储备液ii。供试品溶液的制备取样品15片，研细，精密称定，准确称取均匀样品0.5000g(精确至0.01mg)，装入滤纸筒内，将滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒重的脂肪烧瓶，由抽提器冷凝管上端加入甲醇至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，加热至110℃提取4小时，减压浓缩至10ml，过滤即得。测定法分别精密吸取对照品储备液i、对照品储备液ii、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每片含黄芪以黄芪甲苷(c41h68o14)计，不得少于0.04mg。本品每片含平贝母以贝母素甲(c41h68o14)计，不得少于0.05mg。实施例1专属性实验依次取对照品储备液i，对照品储备液ii，供试品溶液，按3.2色谱条件分别进样检测，记录色谱图。结果显示(表1)，对照品储备液i，对照品储备液ii，供试品溶液均不干扰测定。表1专属性试验结果实施例2样品处理方法确定实验称取0.5000g的供试品三份，加水定容至10ml，分别以超声4h，加热回流4h，索氏提取4h对供试品进行处理。取各处理条件下的续滤液，按上述色谱条件分别进样检测，记录色谱图。结果显示(表2)，索氏提取条件下对供试品中各成分的含量最高，提取效果最佳。表2样品处理方法确定实验结果实施例3线性关系实验取对照品储备溶液ii依次稀释至黄芪甲苷浓度为0，20，40，60，80，100μg·ml-1，贝母素甲浓度为0，10，20，30，40，50μg·ml-1的标准溶液，按上述色谱条件分别进样进行检测，记录色谱图，测定峰面积，以标准溶液浓度与进样体积乘积的常用对数为横坐标，峰面积的常用对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，在进样含量0～10μg范围内，黄芪甲苷的线性方程为y＝1.5211x+1.6968，相关系数r2为0.9997；在进样含量0～5μg范围内，贝母素甲的线性方程为y＝1.6377x+2.2522，相关系数r2为0.9994；各组分均有良好的线性关系，详见图1和图2。实施例4精密度实验取贝母素甲和黄芪甲苷的对照品储备液ii，按上述色谱条件连续进样6次进行检测，记录色谱图，测定峰面积，计算其对应浓度与相对标准偏差(rsd)，详见表3，结果表明本方法的精密度良好。表3精密度实验结果实施例5重现性实验取同一批样品6份，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，测定峰面积，计算其浓度与相对标准偏差(rsd)，详见表4。结果表明，本方法重现性良好。表4重现性实验结果实施例6检测限和定量限按制药行业的要求，取三倍标准偏差与灵敏度的比计算检测限，即dmin＝(3rn/s)。基线噪音在不进样品的情况下，与标准品和样品分析时完全相同的条件下测定。本实验中，以三倍基线噪音计，各组分的最低检测限为2μg·ml-1。以十倍基线噪音计，各组分的定量限为5μg·ml-1。结果见表5。表5检测限和定量限检测限定量限2μg·ml-15μg·ml-1实施例7回收率实验平行称取样品0.5000g三份，按照低、中、高浓度分别加入对照品溶液160μl、200μl、240μl，按照供试品溶液制备方法，制备回收率实验用供试品溶液，取样进行检测，记录色谱图。结果如表6所示，低、中、高浓度回收率高。表6回收实验结果实施例8样品检测平行称取样品三份，按照供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，取样进行检测，记录色谱图，按外标法根据峰面积计算样品中各组分含量，结果列于表7中，结果均符合要求。表7样品检测结果以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。当前第1页12