一种银生长增强超灵敏检测轮状病毒的方法与流程

本发明涉及免疫层析分析技术领域，具体涉及一种银生长增强超灵敏检测轮状病毒的方法。

背景技术：

胶体金免疫层析试纸条因其简单、快速、方便以及裸眼检测已被广泛应用于临床诊断、食品安全检测以及环境监控等领域。传统胶体金免疫层析试纸条主要采用粒径为20～40nm胶体金作为信号探针，然而由于其较小的粒径导致其比色信号强度相对偏弱，进而导致其检测灵敏度偏低。相对较低的检测灵敏度在一定程度上局限了其在超灵敏检测中的应用。近些年，随着纳米科学和技术的快速发展，各种各样的新型纳米材料如荧光微球、量子点、量子点微球、上转换荧光纳米粒子、碳纳米材料以及磁性材料已经被报道可用于替代胶体金作为检测探针提高传统免疫层析试纸条的检测灵敏度，但这些纳米探针的合成相对复杂，价格昂贵很难被市场推广使用。相对于这些新型纳米材料，胶体金因其合成简单、易修饰、生物相容性好、光学性质稳定以及易读取等优势一直以来在免疫层析试纸条占据主要的位置，特别是在商业化生产中，其市场占有率达90％以上。因此，如何提高传统胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度对于进一步拓展其在超灵敏检测中的应用具有重要意义。

基于试纸条检测线信号放大策略因无需合成额外的辅助信号放大材料，因而得到了科研工作者的广泛关注。该类策略主要包括以下几类：1)双金信号放大技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过引入信号扩增金标垫，其可以借助抗原抗体反应和生物素-链霉亲和素系统等特异性地在检测线结合金标抗体偶联物，导致胶体金纳米粒子的进一步聚集，从而放大胶体金的比色信号，如专利cn102507929a；2)酶增强技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过引入辣根过氧化物酶或具有过氧化物酶活性的纳米酶催化氧化相应的底物如四甲基联苯胺(tmb)等生成有色的沉淀物沉积于检测线，从而使胶体金的比色信号得到放大；3)金或银染增强技术：在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，当还原剂存在的情况下，金或银离子容易以胶体金为核心，聚集在胶体金表面还原成金或银原子，使纳米级大小的胶体金通过金或银离子的聚集和还原生长为更大的颗粒，从而使胶体金的比色信号得到放大，如专利cn102135536a。前两种方法由于需要对胶体金探针进行双标记，往往容易影响胶体金探针的免疫性能，导致方法学稳定性差。金或银染增强技术中金属纳米壳层的生长属于层层生长模式，其生长速率不仅与试纸条t、c线上金纳米粒子数量有关，而且与生长液的浓度以及生长时间密切相关，导致生长过程不可控，检测结果的稳定性和重现性差，大大限制了该方法在实践中的推广应用。此外这些方法提高检测灵敏度的能力是有限的，仅为1～2个数量级。因此增敏后的胶体金免疫层析试纸条依然无法实现低浓度待检物的超灵敏检测。本发明提出使用聚合物介导可控银生长技术显著增强试纸条检测线上胶体金探针的光学信号强度，条带颜色呈现从无到有、从弱到强的变化，可实现超低目标物浓度下的裸眼定性检测。经检索未见有采用可控银生长技术增敏传统胶体金免疫层析试纸条检测灵敏度的公开文献报道。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有胶体金免疫层析试纸条因其20～40nm胶体金探针信号强度偏弱导致检测灵敏度偏低的现状缺陷，使用聚合物介导胶体金探针表面可控银生长沉积显著放大试纸条检测线上胶体金探针的光学信号强度，提供了一种提高传统胶体金免疫层析方法检测灵敏度的新技术，实现对超低浓度目标检测物进行现场快速检测。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种银生长增强超灵敏检测轮状病毒的方法，包括以下步骤：

(1)制备胶体金免疫层析试纸条，采用双抗体夹心法检测轮状病毒的试纸条；

(2)银生长液的配置：a)银生长a液：准确称取200～400mg硝酸银和100～200mg聚合物分别溶解于10ml超纯水中，然后将二者混均制备银生长a液；b)银生长b液：准确称取1～2g维生素c钠溶液和1mg柠檬酸三钠分别溶解于10ml和1ml超纯水中，然后将二者混均制备银生长b液；

(3)可控银生长比色信号放大处理：a)用移液器准确取100～120μl待测样品溶液加入到检测卡加样孔中，于室温反应5～10min；b)将上述反应后的试纸条依次使用磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤后，浸泡于银生长a液中室温反应5min；c)接着将试纸条转移至银生长b液中继续反应2min，肉眼观察实验结果，进行快速定性分析。

进一步地，上述步骤(1)中胶体金免疫层析试纸条的制备包括以下步骤：

1)胶体金标记的轮状病毒检测抗体的制备：取1ml粒径为30～40nm柠檬酸包被胶体金溶液，用浓度0.2m的碳酸钾溶液调节该溶液的ph值至7.0～8.0；向溶液加入5μl浓度为1～2mg/ml轮状病毒检测抗体溶液，室温下振荡反应30min；然后再将100μl1～2mg/ml牛血清白蛋白溶液加至上述混合溶液中继续于室温下振荡反应30min；在4℃条件下，于10000rpm离心20min，弃上清，沉淀物复溶于0.01mph7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)，得终产物胶体金标记的轮状病毒检测抗体；

2)胶体金免疫层析试纸条的制备：a)结合垫的制备是将胶体金标记的轮状病毒检测抗体喷涂于玻璃纤维膜上；b)具有检测线和质控线的硝酸纤维膜的制备是将浓度为1～2mg/ml轮状病毒捕获抗体和浓度为1～2mg/ml驴抗鼠二抗溶液分别喷涂硝酸纤维膜上绘制两条线平行线，轮状病毒捕获抗体溶液划线作为检测线(t线)，驴抗鼠二抗溶液划线为质控线(c线)；c)胶体金免疫层析试纸条组装：将样品垫、具有金标检测抗体的结合垫、具有t和c线的硝酸纤维膜和吸水纸分别依次粘贴到塑料衬板上，相邻重叠部分的长度为2mm，切割成4mm宽的试纸条，密封干燥，于温度保存。

进一步地，步骤(2)中所述聚合物为聚乙烯亚胺pei、聚丙烯酸paa、聚乙烯吡咯烷酮pvp或聚赖氨酸pl。

本发明还提供了一种利用银生长增强超灵敏检测轮状病毒的方法的试剂盒，所述试剂盒包括胶体金免疫层析试纸条和银生长液。

本发明所采用的聚合物介导可控银生长信号放大技术涉及胶体金探针表面聚合物介导下维生素c钠诱导二价银离子的可控还原沉积。其原理为将完成常规检测后的胶体金试纸条依次浸泡于银生长a液和b液，此时预吸附的银离子被还原成银单质沉积在胶体金探针表面并实现信号增强。该方案中被还原沉积在检测区域的银纳米粒子数量与预吸附的银离子数量有关，而预吸附的银离子数量只与试纸条检测区域的胶体金探针数目有关，因而可实现银纳米粒子可控生长。相较于传统的金银生长增敏型试纸条，该方法灵敏度更高、检测结果的准确性和可靠性更好。此外信号放大体系中所涉及的硝酸银、聚合物、维生素c钠溶液及柠檬酸三钠均已实现商业化大规模生产，因此本方法试剂成本低、稳定性高以及重现性好，具有较好的商业化前景。

本发明适用于疾病相关抗原及抗体标志物的超灵敏检测，所述的疾病相关标志物包括：肿瘤标志物如癌胚抗原、前列腺特异性抗原、甲胎蛋白；炎症标志物如c反应蛋白、降钙素原、白介素6；心肌标志物如肌钙蛋白、肌红蛋白、n末端心房利钠肽及n末端脑利钠肽；传染病标志物如新型冠状病毒抗原及抗体、艾滋病病毒抗原及抗体、埃博拉病毒抗原及抗体、中东呼吸综合征冠状病毒抗原及抗体、乙肝病毒相关抗原及抗体；病原体如病毒、致病菌等，特别是适合于待检物的现场快速超灵敏检测。样品处理按照常规处理方法即可。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明是在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，采用聚合物介导可控银生长信号放大技术，放大检测线上结合的胶体金探针的比色信号强度，既提高了胶体金免疫层析试纸条的检测轮状病毒灵敏度，也保留了其特异性强的特点。

2、本发明所构建的增敏型免疫层析试纸条特别适用于痕量目标分析物的超灵敏检测，在临床和突发事件的现场检测中具有广泛的应用前景，如传染病的早期筛查等。

附图说明

图1(a)是传统胶体金免疫层析试纸条结构图，(b)是本发明方法的原理示意图；

图2是本发明实施例1中增敏前后对加标样本中轮状病毒定量检测的标准曲线。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

在以下试验中，磷酸盐缓冲液(pbs，0.05m，ph7.4)的配置方法如下：nacl40g，na2hpo413.5g，kh2po41.0g，kcl1.0g溶于1l超纯水中。用0.1mnaoh调ph值。

试验中所涉及的轮状病毒检测抗体和捕获抗体以及驴抗鼠二抗均由abcam公司提供。所述硝酸银、聚乙烯亚胺pei、维生素c钠溶液及柠檬酸三钠均可自市面购得。

实施例1

一种用于增敏型胶体金免疫层析试纸条的检测试剂盒，它包括胶体金免疫层析试纸条和比色信号放大试剂；如图1中a所示，所述的胶体金免疫层析试纸条包括样本垫、结合垫、nc膜和吸水纸，所述的结合垫上设有用胶体金标记的轮状病毒检测抗体，所述的硝酸纤维素膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)；所述的比色信号放大试剂包括银生长a液和b液。

所述的试剂盒按以下方法制备得到：

一、胶体金免疫层析试纸条的制备

1、胶体金标记的轮状病毒检测抗体的制备：

取1ml粒径为35nm柠檬酸包被胶体金溶液，用浓度0.2m的碳酸钾溶液调节该溶液的ph值至7.4；向溶液加入5μl浓度为1mg/ml轮状病毒检测抗体溶液，室温下振荡反应30min；然后再将100μl1mg/ml牛血清白蛋白溶液加至上述混合溶液中继续于室温下振荡反应30min；在4℃条件下，于10000rpm离心20min，弃上清，沉淀物复溶于0.01mph7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)，得终产物胶体金标记的轮状病毒检测抗体。

2、胶体金免疫层析试纸条的制备：

a)结合垫的制备是将胶体金标记的轮状病毒检测抗体喷涂于玻璃纤维膜上；

b)具有检测线和质控线的硝酸纤维膜的制备是将浓度为1mg/ml轮状病毒捕获抗体和浓度为1mg/ml驴抗鼠二抗溶液分别喷涂硝酸纤维膜上绘制两条线平行线，轮状病毒捕获抗体溶液划线作为检测线(t线)，驴抗鼠二抗溶液划线为质控线(c线)；

c)胶体金免疫层析试纸条组装：将样品垫、具有金标检测抗体的结合垫、具有t和c线的硝酸纤维膜和吸水纸分别依次粘贴到塑料衬板上，相邻重叠部分的长度为2mm，切割成4mm宽的试纸条，密封干燥，于温度保存。

二、银生长液的配置

a)银生长a液：准确称取300mg硝酸银和150mg聚乙烯亚胺pei分别溶解于10ml超纯水中，然后将二者混均制备银生长a液；

b)银生长b液：准确称取1.5g维生素c钠溶液和1mg柠檬酸三钠分别溶解于10和1ml超纯水中，然后将二者混均制备银生长b液。

三、可控银生长比色信号放大处理

a)用移液器准确取100μl含不同浓度(1152000、576000、288000、57600、11520、2304、460、92、18pfu/ml)轮状病毒的加标样品溶液加入到试纸条检测卡加样孔中，于室温反应5min；

b)将上述反应后的试纸条依次使用磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤后，浸泡于银生长a液中室温反应3min；

c)接着将试纸条转移至银生长b液中继续反应2min，肉眼判读实验结果，并于胶体金读取仪读取t和c线的光密度值。

对比例1

使用传统试纸条，用移液器准确取100μl含不同浓度(1152000、576000、288000、57600、11520、2304、460、92、18pfu/ml)轮状病毒的加标样品溶液加入到试纸条检测卡加样孔中反应，不经过银生长液处理，肉眼判读实验结果，并于胶体金读取仪读取t和c线的光密度值。

实验结果如图2所示，传统试纸条检测灵敏度为11520pfu/ml，其回归方程为y＝55.893ln(x)-412.7(r²＝0.990)，y代表t线光密度值，x代表病毒浓度；其线性检测范围为11520-1152000pfu/ml；增敏后的胶体金试纸条检测灵敏度达18pfu/ml，其回归方程为y＝61.802ln(x)-52.102(r²＝0.9930)，y代表t线光密度值，x代表病毒浓度；其线性检测范围为18-288000pfu/ml。以上结果表明本发明所提供的增敏型试纸条具有更高的检测灵敏度和更快宽的线性检测范围，适用于极低浓度轮状病毒的超灵敏检测。

结论：经实施例2所述的检测试验发现，本发明中所提到的新方法更适合于样本中痕量轮状病毒的超灵敏检测，进一步证明本发明所提供的基于聚合物介导可控银生长技术增敏传统胶体金免疫层析试纸条的新方法是可行的。

尽管本发明以轮状病毒作为模式分析物在双抗原夹心免疫层析平台上探讨聚合物介导可控银生长技术增强免疫层析试纸条检测灵敏度的可行性，但是本发明所限定的内容并不局限于轮状病毒，其他所有使用本发明方法检测其他的目标分析物如生物大分子、核酸以及病原体等均在本专利的保护范围之内。此外，除了使用传统抗原抗体反应，本发明还可以采用近些年出现的新型生物识别反应如核酸杂交、核酸适配体、配受体等构建相应超灵敏的分析方法用于目标分析物的检测。因此，基于这些识别分子对本发明的拓展和延伸也在本发明所保护的范围之内。