一种基于频分复用的超分辨光学显微成像系统的制作方法

本发明属于超分辨光学显微成像领域，具体涉及一种基于频分复用的超分辨光学显微成像系统。

背景技术：

光学显微镜凭借其非接触、无损伤等优点，长期以来是生物医学研究的重要工具。1873年，ernstabbe提出，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，存在分辨率极限，其数值约为λ/2na，其中λ是光波波长，na是光学系统的数值孔径。成像时若使用波长为400nm的光，并采用空气作为物镜和样本之间的介质，可计算得到分辨率极限为200nm。因此，人们一直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200nm，无法用于清晰观察尺寸在200nm以内的生物结构。超分辨光学成像（super-resolutionopticalmicroscopy）打破了光学显微镜的分辨率极限，为生命科学研究提供了前所未有的工具。

超分辨光学成像技术通常指的是基于远场光学显微镜的超分辨成像技术，主要包括两种实现途径：一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法（如受激发射损耗显微镜（sted））。另一种是基于单分子成像和定位的方法（如光激活定位显微镜技术（palm））。

1994年，stefanw.hell等人提出了sted显微镜的理论，并在2000年通过生物实验证实了sted显微镜的超额分辨成像能力。一个典型的sted显微镜需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光（也称sted光）。利用激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，其电子从基态跃迁到激发态。随后，使用甜甜圈型（doughnut，与救生圈形状类似）的损耗光照射样品，使得处于激发光斑外围的激发态分子以受激辐射的方式释放能量回到基态，而位于激发光斑内部区域的激发态分子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。这种照明方式的组合，将荧光发射区域限制在小于艾里斑的区域内，获得了一个小于衍射极限的荧光发光点。最后，通过在二维（或三维）空间内扫描共轴的激发光和损耗光，获得一幅二维（或三维）超分辨图像。该技术横向分辨率为:

理论上如果排除光漂白的影响，其分辨率能无限小。但由于这里激发光与损耗光的波长不相同，因此在光学器件中传播引入的色散问题会使得系统分辨率降低。

时间相关单光子计数技术首先由bollinger、bennett、koechlin三人在六十年代提出，后来被应用到荧光寿命的测量以及单光子源的二阶自相关系数测量，它的优点如下：时间分辨率高，灵敏度高，测量精度高，输出数据数字化，便于计算机存储和处理。在近代物理、化学、生物等领域中获得了广泛的应用。

在时间相关单光子计数技术中，脉冲激光的同步信号连接到“start”通道，单光子探测器的输出信号连接到“stop”通道，因此这两个信号之间的时间间隔能够被记录下来。随着时间的累计，多个周期内的时间间隔信息以直方图的形式输出。同步信号与被探测到的荧光光子之间的时间互相关系数可描述为：

这里n是测量周期总数，fi是重复频率为i的同步信号，i是被探测到的光子信号,τ是时间延迟。通过上式可知，只有当被探测到的光子重复频率与同步信号的重复频率一致时，测量中才会出现强相关的峰值。如果被探测到的光子重复频率与同步信号不一致，将不会出现强相关的峰值，这些光子将被当成背底噪声。因此可以通过时间相关单光子计数技术来提取特定重复频率的光子信号。

综上所述，虽然传统的受激发射损耗显微镜技术实现了超分辨的光学显微成像，但是仍然存在不足与改进的空间。同时时间相关单光子计数技术可以应用到共聚焦显微技术中，实现相同波长不同重复频率激发光所激发出的荧光光子的区分，从而以类似受激发射损耗显微的方法实现超分辨光学显微成像。

技术实现要素：

本发明的目的是根据上述现有技术的不足之处，提供一种基于频分复用的超分辨光学显微成像系统，该光学显微成像系统使用两束波长相同但重复频率不相同的共轴激发光来照射样品，其中一束激发光为环形空心光束，另一束激发光为高斯光束。利用时间相关单光子计数技术，将高斯脉冲信号的重复频率设置为同步频率，就能够只提取与同步频率一致的荧光光子，从而对样品进行扫描成像。在环形空心光束的照射下，环形区域的荧光点达到荧光发射饱和，当共轴的高斯光束照射时，只有环形空心光束的中心空心部分的荧光分子能够被激发，并发射出重复频率与高斯光束重复频率一致的荧光光子，进而被系统提取出来，从而实现对样品的超分辨光学显微成像。

本发明目的实现由以下技术方案完成：

一种基于频分复用的超分辨光学显微成像系统，所述光学显微成像系统包括脉冲激光发射装置、共聚焦显微镜模块和信号处理模块，所述脉冲激光发射装置包括高斯脉冲激光器和空心脉冲激光器，所述高斯脉冲激光器发出的高斯光束与所述空心脉冲激光器发出的环形空心光束波长相同，所述高斯光束与所述环形空心光束的重复频率不同，将共轴的所述高斯光束和所述环形空心光束通过所述共聚焦显微镜模块照射样品，所述信号处理模块中的时间相关单光子计数器在所述高斯脉冲激光器发出所述高斯光束的同时触发同步信号，所述信号处理模块提取频率与所述同步信号频率相同的荧光光子以对所述样品进行超分辨光学显微成像。

所述脉冲激光发射装置还包括反射镜和分束镜，从所述高斯脉冲激光器发射的所述高斯光束依次经所述反射镜和所述分束镜反射与透过所述分束镜的所述环形空心光束共轴后进入所述共聚焦显微镜模块；所述共聚焦显微镜模块包括依次设置的样品台、样品、显微物镜、二相色镜、第一透镜、小孔、第二透镜、滤波装置、第三透镜和单光子探测器，共轴的所述高斯光束和所述环形空心光束经过所述二相色镜反射后垂直入射至所述显微物镜，经过所述显微物镜聚焦的所述高斯光束和所述环形空心光束照射到所述样品台上的所述样品上，激发荧光点并发射出所述荧光光子，所述荧光光子经所述显微物镜收集后依次通过所述二相色镜、所述第一透镜、所述小孔、所述第二透镜、所述滤波装置和所述第三透镜到达所述单光子探测器，所述单光子探测器探测到一个所述荧光光子后输出电压信号完成一次探测循环，所述同步信号再次触发后进入下一个探测循环。

所述信号处理模块包括时间相关单光子计数器和计算机，所述时间相关单光子计数器统计与所述同步信号强相关的所述荧光光子信息输送至计算机。

所述高斯光束和所述环形空心光束的脉冲间隔大于所述荧光点的荧光寿命。

所述高斯光束和所述环形空心光束的脉冲宽度均小于所述荧光点的荧光寿命。

所述环形空心光束的功率低于所述样品的损伤和所述荧光点的漂白阈值，所述环形空心光束的功率高于所述荧光点的荧光发射饱和阈值,所述高斯光束的功率低于所述环形空心光束的功率。

本发明的优点是：该光学显微成像系统结构简单，不需要精密的同步反馈系统，易于操作，通过采用时间相关单光子计数技术，系统中的两束激发光的波长一致但重复频率不同，能够有效避免光学系统中色散引起的色差效应，从而获得更高分辨率的显微成像。

附图说明

图1为本发明中基于频分复用的超分辨光学显微成像系统的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图通过实施例对本发明的特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：

如图1所示，图中各标记分别为：高斯脉冲激光器1、空心脉冲激光器2、反射镜3、分束镜4、二相色镜5、显微物镜6、样品7、样品台8、第一透镜9、小孔10、第二透镜11、滤波装置12、第三透镜13、单光子探测器14、时间相关单光子计数器15、计算机16、共聚焦显微镜模块17、脉冲激光发射装置18、信号处理模块19。

实施例：如图1所示，本实施例具体涉及一种基于频分复用的超分辨光学显微成像系统，该系统包括脉冲激光发射装置18、共聚焦显微镜模块17和信号处理模块19，脉冲激光发射装置18发射两束波长相同但重复频率不同的共轴激发光穿过共聚焦显微镜模块17照射样品7，其中一束激发光为环形空心光束，另一束激发光为高斯光束，信号处理模块19利用时间相关单光子计数技术提取与同步信号频率相同的荧光光子并对样品7进行超分辨光学显微成像。

如图1所示，脉冲激光发射装置18包括高斯脉冲激光器1、空心脉冲激光器2、反射镜3和分束镜4。

如图1所示，共聚焦显微镜模块17包括依次设置的样品台8、样品7、显微物镜6、二相色镜5、第一透镜9、小孔10、第二透镜11、滤波装置12、第三透镜13和单光子探测器14。

如图1所示，信号处理模块19包括时间相关单光子计数器15和计算机16。

如图1所示，本实施例中的基于频分复用的超分辨光学显微成像系统的工作方法具体包括以下步骤：

高斯脉冲激光器1输出高斯光束，同时作为时间相关单光子计数器15的同步信号源，空心脉冲激光器2输出环形空心光束，环形空心光束的获得可通过涡旋相位板、中空光纤、横模选择/变换法、几何光学法、光学/计算全息法等方法来实现；时间相关单光子计数器15在高斯脉冲激光器1发出信号的同时触发同步信号。高斯脉冲激光器1发出的高斯光束经过反射镜3和分束镜4的反射后与透过分束镜4的空心光束共轴，共轴的高斯光束和环形空心光束进入共聚焦显微镜模块17，即经过二相色镜5反射后垂直入射显微物镜6，且光轴与显微物镜6的中心轴重合，高斯光束和环形空心光束经过显微物镜6后聚焦在样品7上，激发荧光点并发射出荧光光子。高斯光束和环形空心光束的脉冲间隔应略大于所观测的样品7上荧光点的荧光寿命，并且高斯光束和环形空心光束的重复频率不能锁定，否则会形成干涉。高斯脉冲激光器1和空心脉冲激光器2的脉冲宽度应小于荧光点的荧光寿命，使每个脉冲作用于荧光点时仅引起一次激发过程。高斯光束的功率低于环形空心光束的功率。荧光光子再经过显微物镜6被收集后透过二相色镜5，然后通过第一透镜9聚焦于微米级的小孔10，小孔10对荧光光子进行空间滤波，透过小孔10的荧光光子再通过第二透镜12恢复成平行光，平行光再依次通过滤波装置12过滤和第三透镜13聚焦后被单光子探测器14接收，当单光子探测器14探测到一个荧光光子后，单光子探测器14输出电压信号完成一次探测循环，时间相关单光子计数器15就记录一次时间间隔，通过时间的累计，时间相关单光子计数器15能够统计大量的时间间隔数据，并提取出与同步信号强相关的荧光光子信息，并输出给计算机16。

只要在样品7能够承受的阈值下增加环形空心光束的功率，使环形区域内的荧光点达到荧光发射饱和，共轴的高斯光束就只能激发处于环形空心光束中心暗点未饱到达荧光发射饱和的荧光点，从而使这部分荧光点发射出的荧光光子与高斯脉冲光束的重复频率一致。通过时间相关单光子计数器15的处理每次都能只收集处于环形空心光束中心部分的荧光光子。通过调节环形空心光束的功率和光束质量，使环形空心光束中心部分的尺寸小于衍射极限下的聚焦光斑，从而实现超分辨光学扫描成像。计算机16控制样品台8的三维移动，能够实现样品7在三维空间中快速精准的定位和移动，便于扫描样品7得到荧光超分辨光学显微成像。