一种用于测定秸秆产甲烷潜力体系的构建方法与流程

本发明属于环境工程中农业废弃物厌氧消化领域，涉及一种用于测定秸秆产甲烷潜力体系的构建，具体涉及到一种用于分析不同秸秆产甲烷潜力高效体系构建方法。
背景技术：
：我国每年农作物秸秆(稻秸、苜蓿、玉米秸、羊草等)产量巨大。但现阶段资源化利用水平较低，焚烧成为其主要去路。而秸秆的厌氧发酵技术是其资源化的重要途径，产生生物能源气体——甲烷是其主要目标，同时产生的沼渣沼液可以用于有机肥料还田，因此，厌氧发酵产甲烷是秸秆资源化的重要途径。甲烷的产生主要来自于秸秆的降解。秸秆类型众多，但主要成分包括了纤维素、半纤维素和木质素等组分，常见的农作物秸秆纤维素、半纤维素及木质素含量分别在25-44.3％、30-50％、10-21％之间变动。秸秆产甲烷潜力受到各组分比例的影响。而理论产甲烷值(tmp)是指在标准状态下秸秆完全降解产生的最大产甲烷值。一般认为，厌氧菌需要消耗5-15％的能量用于维持新陈代谢，而且木质素成分不能被厌氧菌所降解。因此实际的产甲烷量远低于理论值。秸秆产甲烷潜力除了受到成分的影响外，还与体系中微生物活性密切相关。如秸秆结构复杂，木质素与半纤维素基质包裹在结构外侧，阻止了纤维素被微生物吸附和降解，使得水解过程称为厌氧消化的限速步骤。因此，接种物中高效的水解菌有利于提高秸秆的水解效率。实际进行秸秆产甲烷潜力的常见接种物包括沼液、厌氧装置中的污泥、畜禽粪便等，所含水解微生物不多，不能真实反映秸秆的产甲烷潜力，测试往往需要很长的时间。一些研究表明，反刍动物的瘤胃中含有一些高效的水解菌群，如产琥珀酸丝状杆菌(fibrobactersuccinogenes)，瘤胃球菌属(ruminococcusflavefaciens和ruminococcusalbus)等，利用秸秆中的纤维素和半纤维素成分，产生乙酸等产物，被瘤胃壁吸收利用。但瘤胃中仅含有少量的嗜氢型产甲烷菌，接种瘤胃菌的秸秆厌氧发酵易导致体系中挥发性脂肪酸(vfas)积累，抑制产甲烷过程。秸秆产甲烷潜力还与接种物的量和微生物活性有关，常用物种比(feedstocktoinoculum，f/i)，来反映接种物对秸秆降解产甲烷的影响。过高的f/i易造成体系中vfas积累和ph值的降低，从而抑制产甲烷量；过低的f/i有利于缩短启动时间，但会降低秸秆的用量并提高体系的含固率，反而降低了产甲烷效率。铁(fe)、镍(ni)、钴(co)等金属是产甲烷过程重要辅因子，影响了甲烷菌的类型和活性。如ni/fe是co脱氢酶(codh)、辅酶f420的酶体系组分；而ni还是甲基辅酶m还原酶(mcra)中辅酶f430的辅基因子；co是嗜氢型产甲烷中甲酰甲烷呋喃脱氢酶(fmda)、甲基辅酶m转移酶(mtra)的辅基，上述金属元素对秸秆产甲烷潜力有重要影响。秸秆的产甲烷潜力分析是其资源化利用的重要前提，接种物的制备及发酵环境的控制等直接决定了产甲烷实验的成败。技术实现要素：针对目前秸秆产甲烷测定中的问题，本发明的目的在于构建高效发酵体系，即公开一种用于测定秸秆产甲烷潜力体系的构建方法。一种用于测定秸秆产甲烷潜力体系的构建方法，所述方法包括：分别取瘤胃接种物和活性污泥，并按照各自挥发性固体含量的1:2～1:6的比例混合并驯化；添加nahco3缓冲液，使体系初始ph值维持在6.8-7.1之间；添加产甲烷金属辅因子，包括feso4·7h2o，cocl2·6h2o，niso4·6h2o；添加秸秆，使得秸秆的挥发性固体与所述瘤胃接种物和活性污泥整体的挥发性固体之间的含量比f/i在1-5，含固率为6.0～10％；中温发酵，秸秆在所述体系产生甲烷并测定。进一步的，所述活性污泥从处理餐厨垃圾、生活垃圾的厌氧反应器中取出，定时投加葡萄糖活化污泥，提高产甲烷活性；所述瘤胃接种物：取自屠宰场的奶牛瘤胃，将新鲜瘤胃内含物放入保温带盖容器内，1h内迅速通过纱布过滤掉草料获得瘤胃液，再经12000rpm离心10min后获得瘤胃接种物，保存在4℃环境中；并在3h内和所述活性污泥混合，待无气体产生为止完成驯化。进一步的，所述nahco3、feso4·7h2o、cocl2·6h2o和niso4·6h2o终浓度分别为2.00～5.00g·l-1、1.00～2.00mg·l-1、0.20～1.00mg·l-1、0.20～0.30mg·l-1。更进一步的，所述nahco3、feso4·7h2o、cocl2·6h2o和niso4·6h2o终浓度分别为5.00g·l-1、1.00mg·l-1、1.00mg·l-1、0.30mg·l-1。进一步的，所述中温发酵的温度为38～39℃，通过添加尿素使c/n不高于25:1。本发明可解决以下问题：(1)瘤胃接种物和产甲烷活性污泥通过不同比例制备接种物，维持秸秆水解和产甲烷之间的平衡，有利于反映秸秆真实的产甲烷潜力。(2)接种物经过驯化，获得高效稳定的接种物，解决秸秆产甲烷测定无高效接种物的问题。(3)选择合适的发酵条件，维持体系适宜的水解和产甲烷环境，解决秸秆厌氧发酵易受到中间产物vfas抑制的问题。(4)分析不同来源秸秆(包括草秸、苜蓿、玉米秸、稻秸)分别在不同f/i比下产甲烷及水解特性，构建高效发酵体系。附图说明图1为实施例1中产甲烷量的变化示意图：(a)每四天产甲烷量；(b)累积产甲烷量；图2为实施例1中通过扫描电镜观察到秸秆与接种物的示意图：(a)视角1；(b)视角2；图3为实施例2中产甲烷量的变化示意图：(a)每四天产甲烷量；(b)累积产甲烷量；图4为实施例2中通过扫描电镜观察到秸秆与接种物的示意图：(a)视角1；(b)视角2；图5为实施例3中产甲烷量的变化示意图：(a)每四天产甲烷量；(b)累积产甲烷量；图6为实施例3中通过扫描电镜观察到秸秆与接种物的示意图：(a)视角1；(b)视角2；图7为实施例4中产甲烷量的变化示意图：(a)每四天产甲烷量；(b)累积产甲烷量；图8为实施例4中通过扫描电镜观察到秸秆与接种物的示意图：(a)视角1；(b)视角2；具体实施方式下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。1、瘤胃接种物取自屠宰场奶牛瘤胃，将新鲜瘤胃内含物放入保温带盖厚塑料桶中，1h内迅速赶往实验室，通过两层纱布过滤掉草料获得瘤胃液，再经12000rpm离心10min后获得瘤胃接种物。保存在4℃冰箱中，并在3h内和活性污泥混合。2、活性污泥从处理餐厨垃圾、生活垃圾等厌氧反应器中取出，分别在1d、2d和3d定时投加1g葡萄糖活化污泥，提高产甲烷活性。3、瘤胃接种物与活性污泥按照挥发性固体含量1:2～1:6的比例范围混合(优选的是1:3)，为了减少接种物自身产气的影响，待无气体产生为止，作为驯化后接种物。4、添加nahco3终浓度2.00～5.00g·l-1作为缓冲液，使体系初始ph值维持在在6.8～7.1之间。添加产甲烷金属辅因子，nahco3、feso4·7h2o、cocl2·6h2o和niso4·6h2o终浓度分别为5.00g·l-1、1.00mg·l-1、1.00mg·l-1、0.30mg·l-1。5、中温发酵，温度设定为38～39℃，通过添加尿素使c/n不高于25:1。体系中秸秆的挥发性固体和瘤胃接种物与活性污泥整体的的挥发性固体之间的含量比(f/i)维持在1～5范围内变动，体系含固率不超过6.0％。6、体系产生的沼气主要包括甲烷和二氧化碳，体系利用4mol·l-1naoh溶液100ml吸收，酚酞作为指示剂。直接测量甲烷含量。下述四个实施例中的若干参数按照如下方式知晓：1、理论产甲烷量(tmp)可通过buswell方程来计算：cahbocndse+(a-b/4-c/2+3d/4+e/2)h2o→(a/2+b/8-c/4-3d/8-e/4)ch4+(a/2-b/8+c/4+3d/8+e/4)co2+dnh3+eh2sc、n、h及s含量采用variomicro元素分析仪(elementar，德国)测定，o元素含量通过总值减去其它元素比例得到。获得秸秆分子式cahbocndse，然后通过公式计算理论tmp值。2、产甲烷动力学分析利用修正的gompertz模型，累积产甲烷拟合曲线如下式所示：y代表t时刻累积的甲烷产量(ml)，m为产甲烷潜力(ml)，rm为最大产甲烷速率(ml/d)，e等于2.71。λ为延滞期(天)，可作为评价启动快慢的重要指标。3、发酵前后秸秆中纤维素、半纤维素及木质素含量用纤维分析仪(a2000i,ankom,美国)测定，中性洗涤纤维(ndf)、酸性洗涤纤维(adf)及酸不溶性木质素残渣都在65℃烘箱中烘干至恒重。残渣通过电子扫描显微镜(sem)观察形态特征；每4d沼液取样后测定ph值和挥发性脂肪酸(vfas)：ph值使用delta320ph计测定(梅特勒-托利多仪器，美国)，vfas使用gc-2010plus气相色谱(岛津，日本)测定。实施例1：稻秸原料，总固体含量95.46％，驯化后接种物，100ml体系，体系总固体含量ts为6％。1.1甲烷产生动力学分析每天产甲烷量和累积甲烷产量如图1所示，物种比f/i＝1、3和5的产甲烷峰值分别出现在发酵开始的4天、8天和8天，到24天明显降低，表明秸秆厌氧发酵产甲烷基本结束。修正的gompertz模型拟合如表1所示，其中r2值在0.95-0.99，表明模型拟合结果良好。产甲烷迟滞期λ为-8.10-2.43d，表明产甲烷没有受到抑制。稻秸的分子式为c54.88h97.62o54.43ns0.04，计算其理论tmp值为349.86ml·g-1vs，甲烷产率最高达到了理论值的67.04％。表1gompertz模型中甲烷潜力(m)，每天最大甲烷产量(rm)及迟滞期(λ)拟合数据1.2沼渣各成分变化和形态特征所用稻秸的挥发性固体含量为84.58％，在稻秸成分中，半纤维素为17.24％，纤维素为25.57％，木质素为16.91％。发酵结束后，三个不同f/i比的各组分变化如表2所示。半纤维素降解率在66.35～74.14％之间变动，纤维素为62.23-84.81％之间变动，木质素含量升高，未被降解。表2发酵结束后秸秆成分变化情况如图2所示，通过扫描电镜的观察可以发现，驯化接种物能够分布在稻秸表面和内部，微生物之间同样形成紧密结构，协同降解底物。实施例2：草秸原料，总固体含量98.93％，驯化后接种物，100ml体系，体系总固体含量ts为6％。2.1甲烷产生动力学分析每天产甲烷量和累积甲烷产量如图3所示，f/i＝1、3和5的产甲烷峰值分别出现在发酵开始的8天、12天和16天，到24天明显降低，表明秸秆厌氧发酵产甲烷基本结束。修正的gompertz模型拟合如表3所示，其中r2值在0.96-0.99，表明模型拟合结果良好。产甲烷迟滞期λ为-1.37-5.31d，表明产甲烷没有受到抑制。草秸的分子式为c63.66h112.61o35.09ns0.04，计算其理论tmp值为566.44ml·g-1vs，甲烷产率最高达到了理论值的43.06％。表3gompertz模型中甲烷潜力(m)，每天最大甲烷产量(rm)及迟滞期(λ)拟合数据2.2沼渣各成分变化和形态特征所用草秸的挥发性固体含量为94.53％，在草秸成分中，半纤维素为31.66％，纤维素为33.61％，木质素为10.60％。发酵结束后，三个不同f/i比的各组分变化如表4所示。半纤维素降解率在36.28-77.69％之间变动，纤维素为54.27-77.40％之间变动，木质素含量升高，未被降解。表4发酵结束后秸秆成分变化情况半纤维素降解率纤维素降解率木质素升高率f/i＝177.69±3.8854.27±2.7178.37±3.92f/i＝336.28±1.8177.40±3.87105.32±5.27f/i＝575.81±3.7960.20±3.01134.43±6.72如图4所示，通过扫描电镜的观察可以发现，驯化接种物能够分布在草秸表面和内部，微生物之间同样形成紧密结构，协同降解底物。实施例3：苜蓿原料，总固体含量99.36％，驯化后接种物，100ml体系，体系总固体含量ts为6％。3.1甲烷产生动力学分析每天产甲烷量和累积甲烷产量如图5所示，f/i＝1、3和5的产甲烷峰值分别出现在发酵开始的8天、8天和16天，到24天三个处理都明显降低，表明秸秆厌氧发酵产甲烷基本结束。修正的gompertz模型拟合如表5所示，其中r2值在0.89-0.99，表明模型拟合结果良好。产甲烷迟滞期λ为-1.12-5.58d，表明产甲烷没有受到抑制。苜蓿的分子式为c24.04h43.61o13.52ns0.04，计算其理论tmp值为544.46ml·g-1vs，甲烷产率最高达到了理论值的44.29％。表5gompertz模型中甲烷潜力(m)，每天最大甲烷产量(rm)及迟滞期(λ)拟合数据3.2沼渣各成分变化和形态特征所用苜宿的挥发性固体含量为92.02％，在苜宿成分中，半纤维素为10.53％，纤维素为29.44％，木质素为20.21％。发酵结束后，三个不同f/i比的各组分变化如表6所示。半纤维素降解率在66.23-98.39％之间变动，纤维素为42.71-55.58％之间变动，木质素含量升高，未被降解。表6发酵结束后秸秆成分变化情况如图6所示，通过扫描电镜的观察可以发现，驯化接种物能够分布在苜蓿表面和内部，微生物之间同样形成紧密结构，协同降解底物。实施例4：玉米秸原料，总固体含量96.53％，6％，驯化后接种物，100ml体系，体系总固体含量ts为6％。4.1甲烷产生动力学分析每天产甲烷量和累积甲烷产量如图7所示，f/i＝1、3和5的产甲烷峰值分别出现在发酵开始的8天、8天和16天，到24天三个处理都明显降低，表明秸秆厌氧发酵产甲烷基本结束。修正的gompertz模型拟合如表7所示，其中r2值在0.89-0.99，表明模型拟合结果良好。产甲烷迟滞期λ为-8.37-4.69d，表明产甲烷没有受到抑制。玉米秸的分子式为c68.42h117.64o40.82ns0.11，计算其理论tmp值为533.28ml·g-1vs，甲烷产率最高达到了理论值的44.87％。表7gompertz模型中甲烷潜力(m)，每天最大甲烷产量(rm)及迟滞期(λ)拟合数据4.2沼渣各成分变化和形态特征所用玉米秸的挥发性固体含量为92.87％，在玉米秸成分中，半纤维素为34.98％，纤维素为49.39％，木质素为6.84％。发酵结束后，三个不同f/i比的各组分变化如表8所示。半纤维素降解率在74.90-84.05％之间变动，纤维素为80.05-88.45％之间变动，木质素含量升高，未被降解。表8发酵结束后秸秆成分变化情况如图8所示，通过扫描电镜的观察可以发现，驯化接种物能够分布在玉米秸固渣表面和内部，微生物之间同样形成紧密结构，协同降解底物。综上，秸秆发酵体系产甲烷峰值最早为4天，最晚为16天，24天产气结束。产甲烷迟滞期λ小于5.58天，半纤维素降解率在36.28-98.39％之间变动，纤维素降解率在42.71-88.45％之间变动，木质素未被降解。不同秸秆甲烷产率达到了理论产甲烷量(tmp)的值不同，最低的草秸达到了理论tmp的43.06％，最高的稻秸达到了理论tmp的67.04％，明显高于现有产甲烷潜力测定所得产率，因此本发明方法能够用于秸秆产甲烷潜力测试实验。当前第1页12