制备冻干血小板的方法及其应用与流程

本文涉及制备冻干血小板的方法，尤其是制备可用于血小板抗体筛查的冻干血小板的方法。

背景技术：

血小板抗体是机体对血小板表面或相关抗原免疫产生的抗体，刺激血小板抗体产生的抗原可以是自身的也可以是异体的。血小板抗体有两类，一类主要是针对人类组织相容性抗原(hla)i类抗原的抗体，即血小板表面相关抗体(paigg),一类是针对gp抗原的血小板特异性抗体(pbigg)。gp抗原和hla-i类抗原刺激机体产生同种免疫反应，导致的外源性血小板破坏使血小板寿命缩短和功能改变，是血小板输注无效的重要原因。随着输注次数及量的增加，检出血小板抗体的阳性率增高，发生输注无效及非溶血性输血反应率也增高。

准确、快速、简便地检测和鉴定出血小板抗体对血小板免疫性疾病的诊断、治疗等方面起着重要的作用。目前临床上血小板抗体检测的主要方法是以免疫学方法为主，但因为血小板表面抗原的复杂性和多样性，到目前为止没有商品化的纯抗原销售。在当前的检测中多使用血小板本身来提供抗原。目前血小板的保存存在以下问题：1、血小板在液态环境下极易发生聚集并丢失其抗原性，保存效期短；2，冻干血小板都以输注及治疗(伤口愈合)为目的的，缺乏对于血小板表面抗原的保护，在冻干过程中血小板表面抗原破坏较大，导致这类产品在血小板抗体筛查应用上存在众多问题，例如灵敏度低，阳性率低。

技术实现要素：

一方面，本文提供了制备冻干血小板的方法，该方法包括：

1)让血小板依次与预处理液和固定液接触；以及

2)让经步骤1)处理的血小板在冻干保存液存在下冻干，

其中所述预处理液包括赖氨酸和胶原；所述固定液包括戊二醛和乙醇；所述冻干保存液包括血清白蛋白、pvp和甘露醇。

在一些实施方案中，所述预处理液还包括海藻糖、山梨醇、吐温-20和edta。

在一些实施方案中，所述预处理液为包括如下成分的缓冲液：海藻糖0.2-5％；1-5％赖氨酸；0.2-4％胶原；0.1-2％山梨醇；0.01-0.5％(v/v)吐温-20；以及2-30mmedta。

在一些实施方案中，所述预处理液的配制方法为：向每升缓冲液中加入nacl8g、海藻糖20g、赖氨酸25g、胶原15g、山梨醇5g、吐温-202ml以及edta1.8g。

在一些实施方案中，所述固定液中戊二醛与乙醇的体积比为1：8。

在一些实施方案中，所述冻干保存液为包括如下成分的缓冲液：1-6％血清白蛋白、0.1-1.5％pvp、以及0.5-5％甘露醇。

在一些实施方案中，所述冻干保存液的配制方法为：向每升缓冲液中加入40g血清白蛋白、12gpvp、以及18g甘露醇。

在一些实施方案中，步骤1)包括：以所述预处理液将血小板配制为10⁸-10¹⁰个/ml的第一血小板悬液，并根据所述第一血小板悬液的体积加入1/10-1/4体积的所述固定液，在室温反应0.5-1小时。

在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤1)之前以含edta或柠檬酸的磷酸缓冲液对所述血小板进行清洗。

在一些实施方案中，在步骤1)和步骤2之间还包括以含edta或柠檬酸的磷酸缓冲液对经步骤1)处理的血小板进行清洗。

在一些实施方案中，步骤2)还包括在所述冻干前以所述冻干保存液将经步骤1)处理的血小板悬浮为10⁸-10¹⁰个/ml的第二血小板悬液。

在一些实施方案中，步骤2)中所述冻干在冻干机中抽真空进行，所述冻干机的冷阱温度设为-45±5℃，真空度设为<133mbar，真空冻干24h以上。

在一些实施方案中，步骤2)中所述冻干包括：将所述第二血小板悬液转移至冻干瓶中，于-80℃超低温预冻过夜，次日转入己预冷的冻干机进行真空干燥，冷阱温度设为-45±5℃，真空度设为<133mbar，真空干燥24h后取出。

另一方面，本文提供了上述方法制备的冻干血小板。

另一方面，本文提供了包括上述冻干血小板的检测试剂盒。

另一方面，本文提供了上述冻干血小板或上述检测试剂盒在血小板抗体筛查中的应用。

本文提供的冻干血小板可在长期保存时保持血小板抗原活性，为抗筛血小板的应用及血小板抗体检测试剂盒的标准化应用提供了解决方案。

附图说明

图1显示了使用实验组冻干血小板样品配合商品化试剂盒检测盒内阴性和阳性质控品的检测结果。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。除非另有说明，本文中所用的细胞生物学或免疫学操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供一些术语的定义和解释。

用语“包括”指可添加除具体提及的那些步骤或成分之外的其他步骤或成分，只要这些另外添加的步骤或成分不影响原方法或组合物本身的功能。

术语“血小板”具有领域通常理解的含义，指从巨核细胞脱落下来的小块，无细胞核，表面有完整的细胞膜。血小板大小差异比较大，大多在直径1-8微米。血小板因能运动和变形，故用一般方法观察时表现为多形态。血小板在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。本文所用的血小板可以来自各种哺乳动物，优选人血小板。可以采用各种途径获得的血小板，例如单采血小板(也称为机采血小板)或从全血分离的血小板。优选地，所用的血小板为新鲜血小板，例如在使用前保存不超过一周，或不超过3天，最优选不超过1天。

术语“冻干血小板”指经过冻干处理获得的血小板。其通常失去其生理状态下水分含量的90％，或甚至95％以上。冻干血小板在使用前可通过含水溶液再水化(或称为复水化)，以恢复其试验或临床上所需的功能。

术语“缓冲液”指能在一定程度上抵消、减轻外加酸或碱对溶液酸碱度的影响的液体，通常为弱酸及其盐或弱碱及其盐组成的混合溶液。常用的缓冲液例如有磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、巴比妥缓冲液、醋酸缓冲液等等。这些缓冲液的配制方法在本领域内是公知的。

术语“检测试剂盒”指包括用于特定检测目的的一种或多种试剂的包装盒或其他包装形式。其中的试剂可以存在于各个独立的容器中。除了用于检测目的的试剂之外，检测试剂盒还可以包括各种缓冲液、阴性或阳性对照试剂、标准品等。另外，在检测试剂盒中一般还包括用于阐述其中的试剂的使用方法的说明书。

在本文中，除非另有说明，以百分比表示的成分含量为重量百分比含量。

本文提供的制备冻干血小板的方法可包括以下步骤。

步骤一：

血小板预处理：将血小板使用基础缓冲液清洗3遍除去血浆等成分，使用预处理液重悬为细胞浓度为10⁸-10¹⁰个/ml的悬液，根据悬液体积加入1/10-1/4体积的固定液，室温反应0.5-1小时，对悬浮细胞进行固定。

基础缓冲液：磷酸缓冲液，含edta或柠檬酸等抗凝剂，ph6.5-7.5

预处理液：磷酸缓冲液(或hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液)，ph6.5-7.5，含海藻糖0.2-5％；1-5％赖氨酸；0.2-4％胶原；0.1-2％山梨醇；0.01-0.5％(v/v)吐温-20；2-30mmedta

固定液：含10％(v/v)戊二醛和80％乙醇(v/v)的溶液

步骤二：

固定完成后，使用基础缓冲液清洗血小板2-5遍，使用冻干保存液重悬细胞到10⁸-10¹⁰个/ml。

冻干保存液：磷酸缓冲液(或hepes缓冲液、柠檬酸缓冲液)，ph6.5-7.5，含1-6％人血清白蛋白；0.1-1.5％聚乙烯吡咯烷酮(pvp，k90)；0.5-5％甘露醇。

步骤三：

将步骤二获得的血小板悬液转移至冻干瓶中，于-80℃超低温预冻过夜，次日转入己预冷的冻干机进行真空干燥，冷阱温度设为-45±5℃，真空度为<133mbar，真空干燥24h后取出，将其密封后置于冷藏或室温下保存。

步骤一中使用蛋白抗原的保护剂对血小板膜上抗原进行保护性封闭，并在血小板冻干前使用复合固定剂对血小板抗原和细胞结构进行固定，以提高抗原和细胞的结构稳定性，达到减少冻干损耗的目的。冻干后的血小板在室温或冷藏条件下可以长期保存，进一步解决血小板抗体检测应用中抗筛细胞的应用和标准化问题。

以下通过具体实施例来进一步来说明本发明。

实施例1冻干血小板制备和复水化

1.1主要溶液的配制

基础缓冲液：分别用分析天平称取na2hpo4.12h2o，3.581g；kh2po4，0.2450g；nacl，8.0067g；kcl，0.2013g；edta，1.8g；以超纯水定容到ll；调节ph值到7.2。

预处理液：1l10mmhepes缓冲液，向其中加入nacl8g，海藻糖20g；赖氨酸25g；胶原15g(来源于鱼皮，北京索莱宝科技有限公司，货号c8090)；山梨醇5g；吐温-202ml，edta1.8g。调节ph值到7.2

固定液：取200ml50％戊二醛加入到800ml无水乙醇中。

冻干保存液：1l10mmhepes缓冲液，向其中加入40g人血清白蛋白；12gpvp；18g甘露醇。调节ph值到7.2。

1.2制备冻干血小板

1.2.1血小板的准备

1)以4000rpm离心10min，处理机采血小板；

2)弃上清，加入1/2血小板体积的基础缓冲液，重悬血小板；

3)重复步骤1)和2)两遍，完成血小板的清洗。

1.2.2血小板冻干前处理和试验分组

弃去血小板最后一次清洗离心结束后的上清，实验组使用预处理液重悬血小板细胞，并调节细胞浓度到10⁹个/ml；1号对照组不使用预处理液，直接使用基础缓冲液重悬并调节细胞浓度到10⁹个/ml；2号对照组使用不含赖氨酸和胶原的预处理液进行细胞重悬，并调节细胞浓度到10⁹个/ml。将各组血小板悬液于室温震荡30min。

接着，向各组血小板悬液中分别加入1/8体积的固定液，其中实验组和1号对照组各分出一部分悬液不进行固定液处理，分别标记为3号对照组和4号对照组。将各种血小板悬液分别混匀，置于室温反应30min。实验组和各对照组的区别综合于下表1。

表1试验分组说明

*指以基础缓冲液替代预处理液重悬血小板

**指不向血小板悬液中添加固定液

固定完成后，使用基础缓冲液清洗血小板2-5遍，使用冻干保存液重悬细胞到10⁹个/ml。

1.2.3血小板冻干处理

将血小板悬液转移至10ml西林冻干瓶中，每瓶分装1.5ml，于-80℃超低温预冻过夜，次日转入己预冷的冻干机进行真空干燥，冷阱温度设为-45±5℃，真空度为<133mbar，真空干燥24h后取出，将其密封后置于冷藏或室温下保存。

实施例2冻干血小板的回收率检测

将实施例1制备的各组冻干样品在室温下保存l天后再将其复水化。复水化液为生理盐水，每个样品加入1.5ml复水化液后轻轻振荡至完全溶解。

血小板回收率的计算：对冻干前和复水化后的血小板进行计数，计算血小板的回收率。回收率计算公式为：

每组随机取6个样品进行复水化，并进行血小板计数，计算结果如下表2所示。

表2各组冻干血小板复水化回收率

结果显示：对照组1、2、3与实验组没有显著差异，对照组4与实验组有显著差异。预处理和固定处理对冻干过程中的血小板的完整性具有一定的保护作用，能减少血小板在冻干过程中的破坏。

实施例3血小板表面抗原检测实验

利用不同的表面抗原对应的单克隆抗体(抗血小板糖蛋白iib/iiia、ia/iia、ib/ix、iv)，采用酶联免疫法(elisa)检测实验组与对照组血小板抗原的丢失(破坏)情况。结果显示处理组与对照组在冻干后血小板表面抗原存在显著差异，处理组与新鲜采集血小板相比无显著变化。

具体试验方法如下：

制备反应板：用pbs缓冲液(8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，用hcl调节溶液的ph值至7.4，加水定容至1l)稀释鼠抗人血小板抗体(genetex，货号gtx60763)到10μg/ml，按每孔50μl加入酶标板中，37℃包被2h。洗板2次，每孔加入200μl封闭液(含1％bsa的pbs溶液)，37℃孵育2h。然后使用洗液洗板3次，拍干。

血小板包被：使用生理盐水分别将实施例1制备的实验组、对照组冻干血小板复水化，室温静置待其充分溶解。按每孔50μl将各组血小板溶液加入反应板，60g离心5min，洗液洗涤3次。

elisa检测：向酶标板中分别加入抗血小板糖蛋白iib/iiia、ia/iia、ib/ix、iv的单克隆抗体(santacruz，货号分别为sc-7310；sc-53502；sc-166420；和sc-73643)(1μg/ml，100μl/孔)，同时用正常鼠血清作阴性对照，37℃孵育lh。用洗液洗涤5次，加入ap-抗鼠igg50μl/孔，37℃孵育lh。用洗液洗涤5次，加底物对硝基苯磷酸二钠(pnpp)(50μl/孔)显色30min左右，加入3mnaoh溶液(50μl/孔)终止显色，测量a405值。记录各组血小板对应的a405，将实验组和对照组的测量值分别与新鲜机采血小板的测定值进行比较。

4种抗体检测结果及比较结果见下表3。

表34种抗体检测结果(a405)

从结果可以看出，实验组与新鲜机采血小板的结果最为接近，两组实验结果没有显著差异，而对照组1-4与实验组具有显著差异。

实施例4血小板表面抗原检测实验

将实施例1制备的冻干后的实验组血小板细胞放置于室温和2～8℃条件下保存，每个月取样进行抗原稳定性研究，检测方法同实施例3。结果显示在下表4和5中。从结果可知，实验组的冻干血小板在室温保存6个月，或2～8℃条件下保存12个月，糖蛋白iib/iiia、ia/iia、ib/ix、iv均没有显著变化。

表4冻干后的实验组血小板室温保存后各表面抗原检测结果(a405)

表5冻干后的实验组血小板冷藏保存后各表面抗原检测结果(a405)

实施例5冻干血小板样品在血小板抗体检测(固相凝集法)中的应用

按照商品化的试剂盒如血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)(荷兰三昆试剂有限公司)的说明书准备好检测板。使用1.5ml生理盐水将实施例1制备的冻干血小板样品(经冷藏保存9个月)复水化，室温静置待其充分溶解。按照试剂盒说明书进行血小板包被并完成检测过程。阴阳性结果正常则说明本发明制备的冻干血小板可以用于商品化的抗体检测试剂盒配套和实验室或临床血小板抗体检测。以溶解的血小板样品对该试剂盒中阴性和阳性质控品的检测结果如图1所示。阳性结果：指示红细胞平铺在反应孔底部表面，阳性结果表明样本中含有血小板抗体。阴性结果：指示红细胞在反应孔底部中央形成红细胞聚集，阴性结果表明样本中不含血小板抗体。

本文提供的冻干血小板制备方法使用了赖氨酸、胶原、山梨醇和吐温-20对血小板的表面抗原进行了保护性处理，可有效降低保存过程中对抗原的破坏。本文提供的冻干血小板制备方法使用了戊二醛和乙醇的组合溶液对血小板进行固定，可以进一步保护抗原，同时对细胞内骨架的固定有利于细胞结构的维持，降低冻干过程中的损耗。

因此，本文提供的冻干血小板的制备方法，在血小板冻干前对血小板膜上抗原进行保护和固定，同时在冻干液中添加抗原保护剂，降低冻干过程对膜表面抗原的破坏，最大程度的保存抗原的完整性。采用该方法制备的冻干血小板可用于抗体筛查以及其他试验目的。同时，该冻干血小板可以提供更长的保存期限。例如，该冻干血小板可以在室温下稳定保存至少6个月(冷藏条件下保存12个月)，为抗筛血小板的应用及血小板抗体检测试剂盒的标准化应用提供解决方案。