一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针和试剂盒的制作方法

本发明属于药物检测技术领域，尤其涉及一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针和试剂盒。

背景技术：

柔红霉素(daunorubicin)是一类比较典型的蒽环类抗癌药物，主要用于对常用抗肿瘤药耐药的急性淋巴细胞或粒细胞白血病，已被应用于多种癌症的临床治疗。柔红霉素的抗肿瘤活性可归因于其具有良好的dna序列选择性，结构中的蒽环能够嵌入细胞中的dna链中，使得dna的构象发生变化。然而，柔红霉素的临床应用也显示出严重的剂量限制性副作用，过量使用可引起心肌损害、心律失常心电图异常等不良反应。因此，发展医学临床柔红霉素检测方法具有实际价值。

荧光检测具有实现简单、快速、实时性强、操作简单、重现性好等优点，是一种有效的检测工具。但是，大多数荧光分析都会遇到荧光背景信号难以消除的问题，对检测灵敏度的提升是不利的。为了有效克服这个缺点，时间分辨发光(trl)检测技术可以利用时间域来区分长寿命发光和短寿命背景荧光，这是完全消除背景发光的理想工具。进一步，基于dna敏化稀土离子的发光探针由于其独特的光谱特性，如发光寿命长、窄的发射带等优点，这类dna敏化稀土离子的发光探针非常适合用于时间分辨荧光(trl)检测，可以实现最大限度的低背景荧光干扰的传感应用。目前，设计的核酸敏化稀土离子的荧光探针，或多或少存在探针设计复杂、敏化效果不佳等不足。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针和试剂盒，采用本发明提供的荧光探针能够消除缓冲溶液和血清中的背景荧光干扰，从而实现了柔红霉素的快速、灵敏、无标记和廉价荧光检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针，将22ag序列与tb³⁺离子在20～30℃下孵育8～12min，得到荧光探针；

所述22ag序列具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述孵育在tris-hac缓冲液中进行。

优选的，所述tris-hac缓冲液的ph值为7.9，所述tris-hac缓冲液的浓度为10mm。

优选的，所述孵育时，所述tris-hac缓冲液中22ag序列的浓度为1～5μm。

优选的，所述孵育时，所述tris-hac缓冲液中tb³⁺离子的浓度为1～10μm。

优选的，所述孵育的时间为10min。

本发明还提供了一种检测柔红霉素的试剂盒，包括上述技术方案所述的荧光探针。

本发明提供了一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针，将22ag序列与tb³⁺离子在20～30℃下孵育8～12min，得到荧光探针；所述22ag序列具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

tb³⁺离子在水溶液中能够被富含g碱基的22ag敏化发光，当在溶液体系中加入柔红霉素后，由于22ag含有多个ag碱基，因此柔红霉素可能插入检测体系中的22ag，引起dna构象的变化，当22ag构象发生变化后，它对tb³⁺离子敏化作用将迅速减小导致荧光的减弱。所以，通过反应前后检测体系的荧光的“开-关”的模式，可以快速检测溶液中的柔红霉素。采用本发明提供的荧光探针具有低背景、操作简单、响应时间短、无标记和廉价等优点。

采用本发明提供的荧光探针对柔红霉素的检测浓度范围为0～1μm，检测限为42nm。

附图说明

图1为加入0～10μm柔红霉素的荧光探针的时间分辨荧光光谱；

图2为荧光探针对柔红霉素检测的线性拟合图，其中a荧光探针547nm处对应加入不同浓度柔红霉素的溶液荧光强度变化；b柔红霉素浓度对荧光探针的荧光强度线性拟合，柔红霉素浓度线性为0～1μm。

具体实施方式

本发明提供了一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针，将22ag序列与tb³⁺离子在20～30℃下孵育8～12min，得到荧光探针；所述22ag序列具有seqidno.1所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述22ag序列具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体如下：

5’-agggttagggttagggttaggg-3’。

在本发明中，所述孵育优选在tris-hac缓冲液中进行，所述tris-hac缓冲液的ph值优选为7.9，所述tris-hac缓冲液的浓度优选为10mm。在本发明中，所述孵育的时间优选为10min，所述孵育的温度优选为23～27℃。在本发明中，所述孵育时，所述tris-hac缓冲液中22ag序列的浓度优选为1～5μm，所述tris-hac缓冲液中tb³⁺离子的浓度优选为1～10μm。

在本发明中，所述荧光探针的使用方法优选包括：将待测溶液与荧光探针混合后在37℃下孵育10min，然后用多功能能酶标仪检测时间分辨荧光光谱，得出结果。在本发明中，所述多功能酶标仪测试探针的时间分辨发光光谱(trl)，测试条件：激发波长290nm，延迟时间为50μs，收集时间为2ms，收集光谱范围450nm～725nm。在本发明中，所述荧光探针优选以荧光探针溶液形式进行孵育，所述荧光探针溶液的制备包括：在ph7.910mmtris-hac缓冲液中添加22ag序列和tb³⁺离子，混合物在室温下孵育10min，得到荧光探针溶液。在本发明中，所述混合物中22ag序列的浓度优选为1～5μm，所述混合物中tb³⁺离子的浓度优选为1～10μm。在本发明中，所述待测溶液与含荧光探针的溶液额体积比优选为1:7.5。

本发明还提供了一种检测柔红霉素的试剂盒，包括上述技术方案所述的荧光探针。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

荧光探针溶液的制备：在ph7.910mmtris-hac缓冲液中添加22ag序列和tb³⁺离子，混合物在室温下孵育10min，得到含荧光探针的溶液，混合物中22ag序列的浓度为1μm，混合物中tb³⁺离子的浓度为1μm。

实施例2

荧光探针溶液的制备：在ph7.910mmtris-hac缓冲液中添加22ag序列和tb³⁺离子，混合物在室温下孵育10min，得到含荧光探针的溶液，混合物中22ag序列的浓度为5μm，混合物中tb³⁺离子的浓度为10μm。

实施例3

荧光探针溶液的制备：在ph7.910mmtris-hac缓冲液中添加22ag序列和tb³⁺离子，混合物在室温下孵育10min，得到含荧光探针的溶液，混合物中22ag序列的浓度为3μm，混合物中tb³⁺离子的浓度为2μm。

实施例4

用超纯水配制不同浓度的柔红霉素水溶液(浓度为0-10μm)，然后分别加入到实施例1制备的含荧光探针的溶液中(红霉素溶液和含荧光探针的溶液的体积比为1:7.5)，在37℃环境中孵育10min，用多功能酶标仪测得不同条件下的荧光探针的荧光光谱。采用多功能酶标仪测试探针的时间分辨发光光谱(trl)，测试条件：激发波长290nm，延迟时间为50μs，收集时间为2ms，收集光谱范围547nm。结果见图1和2。

从图1中可以得出荧光探针的发光强度随着柔红霉素的加入而降低；从图2中可以得出，柔红霉素的检测浓度范围为0～1μm，根据公式3σ/k，得到检测限为42nm。

实施例5

血清中的柔红霉素的检测：

将tb³⁺/22ag(分别为2μm和3μm)与4倍反应缓冲液(100mmtris，ph7.9)混合，再将不同浓度的柔红霉素0～300nm加标到含有2.5％血清的tb³⁺/22ag探针溶液中，反应体系为150μl。随后立即对其荧光强度进行测定，设置激发波长为290nm，延迟时间为50μs，收集时间为2ms，记录547nm处的发射强度值。获得的值均为三次重复测定的平均值加上标准偏差。结果见表1。

探针构建：dna22ag(3μm)和tb³⁺(2μm)溶液。

表1实际血清样本中柔红霉素的加标回收

从表1可以得到，柔红霉素的血清加标实验的回收率在93％～103％，说明荧光探针在实际生物样品(血清)中柔红霉素的检测方法可行，且具有良好的抗荧光背景干扰能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>赣南师范大学

<120>一种检测柔红霉素的稀土时间分辨荧光探针和试剂盒

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agggttagggttagggttaggg22