一种双变量相关分析法筛选温郁金不同炮制品中活性成分群的方法与流程

本发明属于中药活性成分群筛选的技术领域，具体涉及一种双变量相关分析法筛选温郁金不同炮制品中活性成分群的方法。

背景技术：

中药具有成分多样、效应广泛，通过协同作用发挥药效的自身特色，同一药材不同炮制品种之间整体成分配比发生明显变化，有些品种除了量变以外，炮制前后还可产生新成分，物质基础的变化可能是其药效发生差异的重要原因。然而，从众多的化学成分间寻找与药效相关的活性成分并解释其与药效改善的作用关系就更为困难，成为制约中药饮片及大中药产品基础研究向前进展的瓶颈。随着近年来计算机统计分析技术的快速发展，中药谱效学日渐兴起，成为中药研究人员探寻中药化学成分与药效间作用关系的重要方法，经过十几年来的发展，谱效研究在单味药及其复方制剂的药效物质基础、工艺设计与优化、组分联合配伍、炮制机理以及药效预测与评价等方面研究中均已广泛应用并取得了显著成效，将中药化学指纹图谱与药效指标相关联，采用灰色关联度、双变量相关分析、人工神经网络等计算机数理统计方法进行数据处理，探索成分与药效之间的内在联系，建立“谱-效”关系模型，从而寻找出与药效作用密切相关的活性成分群，能够更为客观合理的阐明中药及其复方制剂的作用机制。

温郁金的不同炮制品在临床上均为常用的活血化瘀药，现代药理及临床研究表明，温郁金根茎主要成分为挥发油和姜黄素类成分，挥发油中所含β-榄香烯、吉马酮、莪术二酮、莪术醇等成分具有较强的生理活性，在抗肿瘤、抗菌、抗病毒等方面有较好作用^[11-13]。经炮制过后其化学成分发生显著变化，有文献表明，相对于片姜黄，经蒸制后得到的生莪术中(4s,5s)-germacrone-4,5-epoxide的含量显著增加了近13倍，curzerene增加了3倍，curcumenone增加了4倍，其原因可能是由于热敏性成分在加热条件下发生热重排反应所致；由于物质基础的显著变化致使三种饮片产生不同的功效作用，片姜黄长于破血行气，生莪术长于行气止痛，醋制后主入肝经血分，长于破血化瘀。但是，由于三种饮片均具有良好的活血化瘀功效，临床用药较为混乱，在一定程度上影响了三种饮片发挥最好的临床疗效。

本发明将温郁金不同炮制品主要入血成分随时间变化的动态变化过程与血液流变、凝血四项等药效指标随时间变化的动态过程采用灰色关联度等统计方法进行分析，寻找温郁金不同炮制品中发挥活血化瘀作用的主要活性成分，为三种炮制品活血化瘀作用机理的阐明提供研究依据，同时为中药炮制机理的阐释提供示范。

技术实现要素：

中药具成分多样、协同作用发挥药效的自身特色导致其活性成分发现为本领域公认的难点，本发明针对温郁金不同炮制品药效相关的活性成分不明的技术问题，提供一种双变量相关分析法筛选温郁金不同炮制品中活性成分群的方法，其特征为：测定温郁金不同炮制品的入血成分及药效指标随时间的变化规律，采用spss20.0统计软件对成分变化及药效指标变化进行双变量相关性分析，选择双尾检验，计算pearson系数，r绝对值大于0.5小于0.8时表明两变量中度相关，r绝对值大于0.8时认为两变量高度相关，双尾检验sig.＜0.05表明否定两变量不相关的假设；双尾检验sig.＜0.01表明两变量相关性显著；双变量相关系数计算公式如下：

其中x、y分别代表两个变量；分别代表两个变量的平均值。

作为进一步改进，所述药效指标为血液流变相关指标，包括全血黏度低切1s、中切5s、中切30s、高切200s，血浆粘度，pt，aptt，tt，fib，t-pa，tnf-α，pai-1，il-6。

作为更进一步改进，所述温郁金不同炮制品包括片姜黄、莪术、醋莪术，所述入血成分包括zedoalactoneb、aerugidiol、zedoarofuran、zederone、呋喃二烯、莪术烯醇、莪术呋喃烯酮、新莪术二酮、curcumenolactonesa、吉马酮。

有益效果

应用本发明提供的双变量相关分析法筛选温郁金不同炮制品中活性成分群，分别筛得片姜黄、莪术、醋莪术的活性成分群如下：

片姜黄10个入血成分中，zedoalactoneb、aerugidiol、zedoarofuran、zederone、呋喃二烯、新莪术二酮、curcumenolactonesa、吉马酮8个成分对不同药效指标显示具有相关性。其中，zedoalactoneb对全血粘度及血浆粘度呈显著相关(r＞0.5，p＜0.05)；zedoarofuran、吉马酮两个成分对il-6、tnf-α炎症因子及pai-1显著相关，吉马酮相关性更强(p＜0.01)；入血成分与低切变率下的全血粘度、aptt、fib相关的成分较多，而pt、tt、fib与入血成分之间无显著相关性。

莪术10个入血成分中，zedoalactoneb、aerugidiol、zedoarofuran、zederone、莪术烯醇、莪术双环烯酮、莪术呋喃烯酮、吉马酮8个成分对不同药效指标显示具有相关性(r＞0.5，p＜0.05)。其中，zedoarofuran、莪术呋喃烯酮两个成分对血液流变等多种药效指标呈显著相关(r＞0.5，p＜0.05)；与全血粘度、血浆粘度相关性高的成分较多，与fib、il-6、t-pa相关的活性成分较少。

醋莪术8个入血成分中，zedoalactoneb含量最高，但与各药效指标没有显著相关性；呋喃二烯、莪术双环烯酮及莪术二酮与药效指标间相关性最高；与aptt、pai-1相关的成分较少，均只有一个，其他药效指标均与多个成分的变化有相关性。

进一步统计分析三种饮片的活性成分群差异：三种饮片与活血化瘀药效相关的活性成分以及体内的药效变化过程均有较大差异。片姜黄组鉴定得到10个入血成分，其中curcumenolactonesa只在片姜黄饮片中检测到；莪术组鉴定得到10个入血成分，但种类有所不同，与片姜黄组相比，curdione、curcumenone为其特有成分；醋莪术组鉴定得到8个入血成分，虽然入血成分数量减少，但成分与药效双变量相关分析结果显示更高的相关性。从药动曲线的变化来看，片姜黄饮片中入血成分基本在4h达到血药浓度，莪术饮片在2h时达到浓度最高，而醋莪术饮片在0.5h即达到最高浓度，这可能与饮片水煎液整体对肠道内环境以及血液整体环境的改变，导致入血过程发生变化，从而产生不同的药效反应。从三种饮片入血成分与药效指标的双变量相关分析结果来看，虽然片姜黄入血成分较多，但其成分变化趋势与药效的相关性与生、醋莪术组比较差，醋莪术入血成分数量减少，但与更多药效指标显示出极显著相关性。综合以上分析，较为清楚的明确了三种饮片入血成分与活血化瘀药效之间的关联性以及异同点，为中药显效与炮制机制研究、临床实践指导、中药产品开发提供详实的物质基础。

附图说明

图1片姜黄组血浆样品在正离子模式下的uplc-q/tof-ms总离子流图

图2片姜黄入血成分离子强度在0-12h随时间变化的趋势(n＝6)

图3生莪术组血浆样品在正离子模式下的uplc-q/tof-ms总离子流图

图4生莪术入血成分离子强度在0-12h随时间变化的趋势(n＝6)

图5醋莪术组血浆样品在正离子模式下的uplc-q/tof-ms总离子流图

图6醋莪术入血成分离子强度在0-12h随时间变化的趋势(n＝6)

图7各组大鼠体重变化趋势

图8各组大鼠造模后耳缘变化(a：空白组；b：模型组；c：阳性组；d：片姜黄组；e：生莪术组；f：醋莪术组)

图9温郁金不同炮制品对气滞血瘀大鼠模型血液流变学的影响。###，##，#分别代表与空白组比p<0.001，p<0.01，p<0.05；***，**，*分别代表与模型组比p<0.001，p<0.01andp<0.05。

图10温郁金不同炮制品对气滞血瘀大鼠模型凝血四项的影响。###，##，#分别代表与空白组比p<0.001，p<0.01，p<0.05；***，**，*分别代表与模型组比p<0.001，p<0.01andp<0.05。

图11温郁金不同炮制品对气滞血瘀大鼠模型纤溶系统及炎症因子的影响。###，##，#分别代表与空白组比p<0.001，p<0.01，p<0.05；***，**，*分别代表与模型组比p<0.001，p<0.01andp<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。

实施例1双变量相关分析法筛选温郁金不同炮制品片姜黄、莪术、醋莪术的中药活性成分群

分析鉴定温郁金不同炮制品片姜黄、莪术、醋莪术的血浆样品入血成分的，测定活血化瘀相关药效指标，并用双变量相关分析的方法进行中药活性成分群的筛选。

1.实验方法

测定片姜黄、莪术、醋莪术三种饮片入血成分在0-12h的相对含量变化趋势(测定方法见实施例2)，以及血液流变等药效指标在相同时间内的变化过程(测定方法见实施例2和3)，采用spss20.0统计软件对成分变化及药效指标变化进行双变量相关性分析，选择双尾检验，计算pearson系数，r绝对值大于0.5小于0.8时表明两变量中度相关，r绝对值大于0.8时认为两变量高度相关，双尾检验sig.＜0.05表明否定两变量不相关的假设；双尾检验sig.＜0.01表明两变量相关性显著。双变量相关系数计算公式如下：

其中x、y分别代表两个变量；分别代表两个变量的平均值。

2.实验结果

2.1片姜黄活血化瘀谱效相关性分析

经uplc-q/tof-ms对片姜黄各组血浆样品入血成分的分析鉴定，得到片姜黄血浆样品入血成分在0-12h内的离子强度变化见表1，变化趋势见图2，共鉴定得到10个入血成分，其中zedoalactoneb、莪术烯醇、aerugidiol三个成分入血成分的离子强度较高，各成分在2-4h之间达到血药浓度最高。同时测定片姜黄末次给药后0-12h的血液流变学等药效指标，结果见表2。采用spss20.0统计软件对片姜黄入血成分与药效指标随时间变化的双曲线进行双变量相关性分析，pearson相关系数及双侧检验显著性结果见表3，统计结果表明，片姜黄10个入血成分中，zedoalactoneb、aerugidiol、zedoarofuran、zederone、呋喃二烯、新莪术二酮、curcumenolactonesa、吉马酮8个成分对不同药效指标显示具有相关性。其中，zedoalactoneb对全血粘度及血浆粘度呈显著相关(r＞0.5，p＜0.05)；zedoarofuran、吉马酮两个成分对il-6、tnf-α炎症因子及pai-1显著相关，吉马酮相关性更强(p＜0.01)；入血成分与低切变率下的全血粘度、aptt、fib相关的成分较多，而pt、tt、fib与入血成分之间无显著相关性。

表1片姜黄入血成分0-12h在血浆样品中的离子强度(n＝6)

表2片姜黄给药0-12h对活血化瘀药效指标的影响(n＝6)

表3片姜黄入血成分与药效指标双变量相关分析pearson相关系数结果

注：*代表双尾检验显著性＜0.05；**代表代表双尾检验显著性＜0.01。

2.2生莪术活血化瘀谱效相关性分析

经uplc-q/tof-ms对生莪术各组血浆样品入血成分的分析鉴定，得到生莪术血浆样品入血成分在0-12h内的离子强度变化见表4，变化趋势见图3，其中zedoalactoneb、aerugidiol、莪术烯醇、莪术双环烯酮、莪术二酮五个入血成分的相对含量较高，各成分在2h左右达到血药浓度最高。同时测定生莪术末次给药后0-12h的血液流变学等药效指标，结果见表5。采用spss20.0统计软件对生莪术入血成分与药效指标随时间变化的双曲线进行双变量相关性分析，pearson相关系数及双侧检验显著性结果见表6，统计结果表明，生莪术10个入血成分中，zedoalactoneb、aerugidiol、zedoarofuran、zederone、莪术烯醇、莪术双环烯酮、莪术呋喃烯酮、吉马酮8个成分对不同药效指标显示具有相关性(r＞0.5，p＜0.05)。其中，zedoarofuran、莪术呋喃烯酮两个成分对血液流变等多种药效指标呈显著相关(r＞0.5，p＜0.05)；与全血粘度、血浆粘度相关性高的成分较多，与fib、il-6、t-pa相关的活性成分较少。

表4生莪术入血成分0-12h在血浆样品中的离子强度(n＝6)

表5生莪术给药0-12h对活血化瘀药效指标的影响(n＝6)

表6生莪术入血成分与药效指标双变量相关分析pearson相关系数结果

注：*代表双尾检验显著性＜0.05；**代表代表双尾检验显著性＜0.01。

2.3醋莪术活血化瘀谱效相关性分析

经uplc-q/tof-ms对醋莪术各组血浆样品入血成分的分析鉴定，得到醋莪术血浆样品入血成分在0-12h内的离子强度变化见表7，变化趋势见图6，其中zedoalactoneb、aerugidiol、zederone、莪术烯醇四个入血成分的相对含量较高，各成分在0.5h左右达到血药浓度最高。同时测定醋莪术末次给药后0-12h的血液流变学等药效指标，结果见表8。采用spss20.0统计软件对醋莪术入血成分与药效指标随时间变化的双曲线进行双变量相关性分析，pearson相关系数及双侧检验显著性结果见表9，统计结果表明，醋莪术8个入血成分中，zedoalactoneb含量最高，但与各药效指标没有显著相关性；呋喃二烯、莪术双环烯酮及莪术二酮与药效指标间相关性最高；与aptt、pai-1相关的成分较少，均只有一个，其他药效指标均与多个成分的变化有相关性。

表7醋莪术入血成分0-12h在血浆样品中的离子强度(n＝6)

表8醋莪术给药0-12h对活血化瘀药效指标的影响(n＝6)

表9醋莪术入血成分与药效指标双变量相关分析pearson相关系数结果

注：*代表双尾检验显著性＜0.05；**代表代表双尾检验显著性＜0.01。

3.小结

本章研究内容采用“中药谱效学”研究思路，结合双变量相关分析统计方法，从三种饮片入血成分的种类，相对含量，在体内的代谢变化趋势，以及与活血化瘀药效指标的相关性，综合分析了三种饮片在发挥活血化瘀作用方面的异同点。结果表明，三种饮片与活血化瘀药效相关的活性成分以及体内的药效变化过程均有较大差异。片姜黄组鉴定得到10个入血成分，其中curcumenolactonesa只在片姜黄饮片中检测到；生莪术组鉴定得到10个入血成分，但种类有所不同，与片姜黄组相比，curdione、curcumenone为其特有成分；醋莪术组鉴定得到8个入血成分，虽然入血成分数量减少，但成分与药效双变量相关分析结果显示更高的相关性。从药动曲线的变化来看，片姜黄饮片中入血成分基本在4h达到血药浓度，生莪术饮片在2h时达到浓度最高，而醋莪术饮片在0.5h即达到最高浓度，这可能与饮片水煎液整体对肠道内环境以及血液整体环境的改变，导致入血过程发生变化，从而产生不同的药效反应。从三种饮片入血成分与药效指标的双变量相关分析结果来看，虽然片姜黄入血成分较多，但其成分变化趋势与药效的相关性与生、醋莪术组比较差，醋莪术入血成分数量减少，但与更多药效指标显示出极显著相关性。综合以上分析，较为清楚的明确了三种饮片入血成分与活血化瘀药效之间的关联性以及异同点，为后续炮制机制的研究提供了充分的物质基础研究依据。

4.讨论

根据温郁金不同炮制品入血成分与药效指标随时间的变化趋势以及二者的双变量分析结果显示，三种饮片与活血化瘀药效相关的活性成分以及体内的药效变化过程均有较大差异。

从入血成分来看，片姜黄给药血瘀模型大鼠血浆中共鉴定得到10个入血成分，其中curcumenolactonesa只在片姜黄饮片中检测到，双变量相关分析结果表明，该成分与aptt、fib呈显著相关。文献研究表明，curcumenolactonesa对原代培养的大鼠肝细胞中d-半乳糖胺诱导的细胞毒性显示出保护作用^[24]，推测该成分可能通过肝脏保护以及与其他入血成分联合发挥片姜黄饮片“破血行气”的作用；生莪术饮片给药血瘀模型大鼠血浆样品中同样鉴定得到10个入血成分，但种类有所不同，与片姜黄组相比，莪术二酮、莪术双环烯酮为其特有成分，其中，莪术二酮与药效指标无明显相关性，但莪术双环烯酮与血液粘度及aptt均显示显著相关，该成分被发现对d-半乳糖胺/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤显示出有效的保护作用^[25]。与醋莪术组比较，吉马酮、新莪术二酮、莪术呋喃烯酮为其特有入血成分，吉马酮、新莪术二酮同样对d-半乳糖胺/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤显示出保护作用^[25]，莪术呋喃烯酮可显著抑制人癌细胞系mcf-7，caski和hct-116中的细胞增殖，并通过激活caspase-3诱导细胞凋亡^[26]；醋莪术饮片给药血瘀模型大鼠血浆样品中鉴定得到8个入血成分，虽然入血成分数量减少，但成分与药效双变量相关分析结果显示更高的相关性，并且zedoalactoneb相对含量明显升高，但与药效没有体现直接的相关性，zederone相对含量也出现小幅度升高，并且与全血粘度、pt、fib具有明显相关性，该成分同样对人癌细胞系mcf-7，caski和hct-116中的细胞增殖具有抑制作用^[26]。

从入血成分随时间变化趋势来看，三种饮片的成分代谢变化过程也发生显著变化，片姜黄饮片中入血成分基本在4h达到血药浓度，生莪术饮片在2h时达到浓度最高，而醋莪术饮片在0.5h即达到最高浓度，这可能与饮片水煎液整体对肠道内环境以及血液整体环境的改变，导致入血过程发生变化，从而产生不同的药效反应。

从三种饮片入血成分与药效指标的双变量相关分析结果来看，虽然片姜黄入血成分较多，但其成分变化趋势与药效的相关性与生、醋莪术组比较差，醋莪术入血成分数量减少，但与更多药效指标显示出极显著相关性(p＜0.01)。

综合以上分析，较为清楚的明确了三种饮片入血成分与活血化瘀药效之间的关联性以及异同点，为后续炮制机制的研究提供了充分的物质基础研究依据。

实施例2姜黄、莪术、醋莪术三种饮片入血成分在0-12h的相对含量变化趋势，及三种饮片给药后血液流变等药效指标在0-12h内的变化过程

实施例1中姜黄、莪术、醋莪术三种饮片入血成分在0-12h相对含量变化趋势，及三种饮片给药后血液流变等药效指标在0-12h内的变化过程的测定方法如下：

1.样品制备

1.1试药

新鲜温郁金根茎采购自浙江省瑞安市通明温郁金专业合作社，经南京中医药大学陆兔林教授鉴定为姜科植物温郁金curcumawenyujiny.h.chenetc.ling的新鲜根茎。莪术二酮对照品(批号k19d5c1，纯度：hplc≥98％)，莪术醇对照品(批号：rm0331fb14，纯度：hplc≥98％)，吉马酮对照品(批号p10s6f3197，纯度：hplc≥98％)，呋喃二烯对照品(批号：11824-201001，纯度：hplc≥98％)，β-榄香烯对照品(批号：100268-201402，纯度：hplc≥99.4％)均购自上海源叶生物科技有限公司。milli-q超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯(德国merck公司)、乙醇(分析纯)。

表1010批温郁金根茎产地信息

温郁金不同炮制品制备方法如下：

1)片姜黄饮片的制备

取新鲜温郁金根茎，洗净，除去须根，趁鲜纵切厚片，60℃低温干燥，得片姜黄饮片；

2)生莪术饮片的制备

取新鲜温郁金根茎，洗净，除去须根和杂质，蒸至透心，60℃低温干燥，得莪术药材；将莪术蒸软，切厚片，60℃低温干燥得生莪术饮片；

3)醋莪术饮片的制备

取莪术加醋煮至透心，放凉，切厚片，60℃低温干燥得醋莪术饮片。(每100kg用米醋20kg)

以上饮片炮制方法参照2015年版《中国药典》一部片姜黄、莪术炮制项下要求。

1.2样品制备

取片姜黄、生莪术、醋莪术饮片各1kg，加10倍量蒸馏水，浸泡0.5h，煎煮0.5h，煎煮两次，用纱布趁热滤过，合并两次水煎液，旋转蒸发仪55℃浓缩至2g/ml，贮存于4℃备用。

2.分组与给药

动物房温度(25±1)℃，相对湿度55％。spf级sd雄性大鼠，适应性饲养1周后，按体重随机分为22组，每组6只，分别为空白组、片姜黄0.5、1、2、4、6、8、12h组，生莪术0.5、1、2、4、6、8、12h组，醋莪术0.5、1、2、4、6、8、12h组(给药剂量按临床等效给药剂量3倍折算，三种饮片给药剂量均为4.5g/kg)。各给药组分别灌胃给予相应药物，每天上午给药1次，连续给药7天。

3.复制大鼠气滞血瘀模型

第7天给药后禁食，除空白对照组，其它各组颈部皮下注射盐酸肾上腺素0.8ml/kg，共注射两次，中间间隔4h，并在第一次皮下注射2h后将大鼠放入0～4℃冰水浴中游泳5min，复制气滞血瘀大鼠模型。

1.血液流变学等药效指标的检测

每日称定大鼠体重，观察大鼠毛色、排便及活动情况。第8天上午，各组大鼠正常给药0.5h后，10％水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，分装至枸橼酸钠真空采血管抗凝，取1ml全血测定全血高、中、低切黏度；剩余全血以3000r/min离心10min，测定血浆粘度，内、外源性凝血功能指标(tt、pt、aptt、fib)，elisa法测定t-pa、pai、il-6、tnf-α水平。

5.温郁金不同炮制品入血成分的检测

5.1血浆样品供试液的制备

末次给药0.5h后，10％水合氯醛麻醉，颈总动脉取血至枸橼酸钠真空采血以3000r/min离心10min，取上清血浆200μl置于1.5ml离心管加1.2ml甲醇，混匀后采用涡旋振荡混合器充分振荡30s，充分沉淀蛋白，将混合物以12000r/min在4℃下离心10分钟，取上清液置于1.5ml离心管中，在冷冻离心干燥机干燥4h至溶剂挥干，最后，加200μl甲醇复溶，离心10min，取上清液100μl于内衬管，待测。同时，从每份样本吸取10μl混合，制备质量控制(qc)样本，沉淀蛋白及离心等步骤同前。

5.2色谱条件

色谱柱：agilentzorbaxsb-c18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相体系为乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)，梯度洗脱程序为：0～1min,5％～25％a；1～3min，25％～30％a；3～13min，30％～55％a；13～15min，55％～70％a；15～25min，70％～100％a；25～28min，100％～5％a。进样量：1μl；流速：0.3ml/min，柱温：35℃。

5.3tof/ms质谱条件

采用esi离子源，正离子模式全波长扫描。质谱检测器参数设置如下：离子喷雾电压(ionvoltage)5.5kv，离子源温度(sorcetemperature)550℃，解簇电压(declusteringpotential)60v，碰撞能量(ce)：35ev；辅助气体为n2，气帘气(curtaingas)35psi，gas1(nebulizergas)55psi，gas2(heatergas)65psi；采用ms/ms二级质谱模式扫描，质量数扫描范围50～1000m/z；动态背景扣除。数据采集通过tf1.6软件获得(absciex公司)。

5.4温郁金不同炮制品入血成分结构鉴定

根据国内外文献及相关成分检索网站(pubmed,chemspider,scifindermassbank,andchinesenationalknowledgeinfrastructure(cnki))等，建立莪术化学成分数据库，采用analysttf1.6software(absciex,usa)软件采集原始图谱，peakview1.2软件提取化学成分的一级、二级质谱图，不同样品之间设置误差值≤10ppm，保留时间误差范围设为±0.2min，将二级碎片与数据库进行比对，根据分子量、化学结构式、特征碎片离子等多种信息匹配化合物，对片姜黄、生、醋莪术饮片提取物中的化学成分进行分析。

实施例3药效学实验

血液流变学是一门新兴的生物力学与生物流变学的分支，近20年来，逐渐发展为一门独立学科，主要研究血液流动、细胞变形、血液与血管、心脏之间相互作用规律以及生物化学成分的一门科学。其研究内容主要包括全血粘度、血浆粘度、红细胞电泳时间、血小板电泳时间、纤维蛋白原测定、血沉及红细胞变形能力等10多项指标。文献研究表明，目前有关血瘀证疾病的研究中凝血四项包括凝血酶原时间(pt)、凝血酶时间(tt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、纤维蛋白原(fib)等指标与血瘀证的发生发展关系密切。其中pt主要用于反映外源凝血系统情况，aptt主要用于反映内源凝血系统情况，tt代表纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间，fib代表纤维蛋白原的含量。血液流变学对中医血瘀证本质的研究、对活血化瘀机理的探讨具有重要意义。

血瘀症病人体内多可见不同程度的瘀斑，是由于血流不畅，血液瘀阻所致。血液凝固的过程会形成纤维蛋白，纤维蛋白的形成与分解过程(即纤溶系统)与血液凝固密切相关，在纤维蛋白酶溶解过程中，组织型纤溶酶原激活剂(t-pa)与血浆纤溶酶原激活物抑制剂(pai)是一对重要的调控因子，pai对t-pa具有抑制作用，而t-pa对防止血栓形成作用显著，二者的平衡对血管内血栓溶解具有重要意义，因此，研究纤溶因子对了解血瘀症的疾病状态及作为评价血瘀症的诊断指标具有重要意义；此外，血瘀与炎症的相关性，近年来得到越来越多的学者关注，血瘀过程中不可避免的存在炎症反应，进而加重血瘀症的病情，从改善炎症反应入手也可有效改善血瘀症。

此外，还有纤溶酶原激活物抑制物(pai-1)，白细胞介素-6(interleukin-6,il-6)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)水平。

基于以上原因，本发明在药效评价指标的选择上，除了考察常规的血液流变学指标，还考察了t-pa以及pai-1，二者作为一对拮抗因子，对维持体内纤溶系统平衡，血液流动状态具有重要作用，此外，还检测了相关炎症因子，综合评价三种饮片在血液流变、纤溶系统、炎症等多方面的药效差异。

1.实验方法

1.1样品制备

取片姜黄、生莪术、醋莪术饮片各1kg，加10倍量蒸馏水，浸泡0.5h，煎煮0.5h，煎煮两次，用纱布趁热滤过，合并两次水煎液，旋转蒸发仪55℃浓缩至2g/ml，贮存于4℃备用。

1.2动物分组及给药

动物房温度(25±1)℃，相对湿度55％。spf级sd雄性大鼠，适应性饲养5天后，按体重随机分为9组，每组10只，分别为空白组、模型组、复方丹参片组(1.5g/kg)、片姜黄高低剂量组、生莪术高低剂量组、醋莪术高低剂量组(高剂量按临床等效给药剂量3倍折算，三种饮片给药剂量均为4.5g/kg；低剂量按临床等效剂量折算，三种饮片低剂量组均为1.5g/kg)。各给药组分别灌胃给予相应药物，对照组与模型组灌胃给予等体积生理盐水，每天给药1次，连续给药7天。

1.3复制大鼠气滞血瘀模型

第7天给药后禁食，除空白对照组，其它各组颈部皮下注射盐酸肾上腺素0.8ml/kg，共注射两次，中间间隔4h，并在第一次皮下注射2h后将大鼠放入0～4℃冰水浴中游泳5min，复制气滞血瘀大鼠模型。

1.4血液流变学等药效指标测定

每日称定大鼠体重，观察大鼠毛色、排便及活动情况。第8天上午，各组大鼠正常给药0.5h后，10％水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，分装至枸橼酸钠真空采血管抗凝，取1ml全血测定全血高、中、低切黏度；剩余全血以3000r/min离心10min，测定血浆粘度，内、外源性凝血功能指标(tt、pt、aptt、fib)，elisa法测定t-pa、pai、il-6、tnf-α水平。

1.5统计学处理

采用spss20.0统计软件对数据进行双样本t检验及方差分析，实验数据以表示，p<0.05为有统计学意义。

2.实验结果

2.1温郁金不同炮制品对血瘀模型大鼠体重及毛色等的影响

各组大鼠灌胃给药期间体重稳步上升，第7天造模后除空白组外，各组大鼠体重显著下降，第8天各组大鼠体重回升(见图7)；造模过程中，片姜黄组大鼠冰水浴时间比其它组明显较短，且体力不支较快，除空白组外各组大鼠冰水浴后耳缘出现淤血症状，眼睛可见出血点，模型组淤血症状最为严重(见图8)。

2.2温郁金不同炮制品对气滞血瘀症血液粘度指标的影响

与对照组相比，模型组大鼠全血各切变率下黏度及血浆粘度均显著升高(p＜0.01)；与模型组比较，阳性药(复方丹参片)组可显著降低模型大鼠各切变率下全血黏度与血浆粘度(p＜0.01)；其中，除片姜黄低剂量组对血液流变学指标的改善没有统计学意义以外，其他各组对气滞血瘀模型均有显著改善作用，且高剂量组效果更为明显；醋莪术高剂量组对血瘀模型大鼠各切变率下黏度和血浆粘度具有极显著改善作用(p＜0.001)；结果见表11。

表11温郁金不同炮制品对气滞血瘀模型大鼠全血粘度及血浆粘度的影响(n＝10)

注：l代表低剂量；h代表高剂量。###，##，#分别代表与空白组比p<0.001，p<0.01，p<0.05；***，**，*分别代表与模型组比p<0.001，p<0.01andp<0.05。

2.3温郁金不同炮制品对气滞血瘀症凝血四项的影响

与对照组相比，模型组tt、pt、aptt时间显著延长，fib水平显著增加；与模型组相比，阳性组与各给药组的高剂量组对模型大鼠tt时间均有极显著缩短作用(p<0.001)；片姜黄各组和生莪术各组可缩短pt时间(p<0.05)，醋莪术高低剂量组缩短pt时间更为明显(p<0.01)；阳性组和片姜黄高剂量组可缩短aptt时间(p<0.05)，生莪术组和醋莪术组的高剂量组作用更为明显(p<0.01)；片姜黄组对fib的影响没有统计学意义，生莪术各组可明显降低fib水平(p<0.05)，醋莪术高剂量组对fib具有极显著降低作用。

表12温郁金根茎不同炮制品对气滞血瘀模型大鼠凝血四项的影响(n＝10)

注：l代表低剂量；h代表高剂量。###，##，#分别代表与空白组比p<0.001，p<0.01，p<0.05；***，**，*分别代表与模型组比p<0.001，p<0.01andp<0.05。

2.4温郁金不同炮制品对气滞血瘀症纤溶系统及炎症因子的影响

与对照组相比，模型组t-pa含量下降(p<0.05)，pai-1极显著增高，炎症因子il-6、tnf-α极显著增高；与模型组相比，阳性组与各给药组对t-pa均有极显著升高作用；片姜黄各组及生/醋莪术低剂量组均对pai-1的影响无统计学意义，生莪术可降低pai-1水平(p<0.05)，醋莪术效果更为明显(p<0.01)；除生、醋莪术低剂量组对il-6无显著影响，生莪术低剂量组对tnf-α无显著影响外，其余各给药组均可显著降低il-6、tnf-α水平(p<0.01)。

表13温郁金根茎不同炮制品对气滞血瘀模型大鼠t-pa、pai-1、il-6、tnf-α的影响(n＝10)

注：l代表低剂量；h代表高剂量。###，##，#分别代表与空白组比p<0.001，p<0.01，p<0.05；***，**，*分别代表与模型组比p<0.001，p<0.01andp<0.05。

3.小结

通过考察温郁金根茎不同炮制品对气滞血瘀模型大鼠的全血粘度及血浆粘度的影响，比较各炮制品化瘀作用的强弱。结果表明，温郁金根茎三种炮制品均可改善气滞血瘀大鼠全血高粘状态，其中醋莪术效果最佳。

通过比较各给药组对血瘀模型大鼠凝血四项的调节作用来进一步从凝血系统的角度比较三种炮制品的功效差异。结果表明，三种炮制品对tt均有极显著的调节作用，对pt、aptt有明显影响，其中片姜黄较生、醋莪术组作用较弱，片姜黄对fib的影响无统计学差异，而经炮制过后的生、醋莪术均对fib产生明显调节作用；总体上三种饮片均可通过内、外源性凝血系统改善血瘀证，醋制品疗效最佳。

此外，本研究同时考察了温郁金根茎不同炮制品对血瘀模型纤溶系统与炎症因子的影响。纤溶系统是纤溶酶原经特异性激活物作用转化为纤溶酶，导致体内纤维蛋白不断溶解的反应体系。研究表明，血瘀的本质是纤维结缔组织增生与变质以及微循环障碍，与机体纤溶系统的动态平衡及纤维蛋白溶解系统功能密切相关^[21]。纤溶酶活化后可将凝血过程中产生的不溶性纤维蛋白块分解成各种可溶片段，从而使血栓降解。t-pa是纤溶系统激活物，可促进纤维蛋白溶解，pai-1是t-pa抑制物，可降低纤溶功能、促进末梢微循环瘀滞、增加血栓形成趋势^[22]。模型组大鼠t-pa的量有降低趋势，pai-1的量增加，符合瘀血模型特征。各给药组对t-pa均有显著降低作用，片姜黄组对pai-1的调节作用呈上升趋势，但没有统计学差异，生莪术组可降低pai-1，醋莪术组效果更佳。

随着现代医学发展，免疫炎症机制认识的深入，炎症因子在血瘀证中渐渐占有一席之地。炎症因子可导致内皮损伤，损伤后使得血小板活化，活化的血小板促进血栓形成，即形成血瘀证。近年来，不少实验研究证实发挥致病作用的炎性因子与血瘀证相关^[23]。本研究中，模型组大鼠tnf-α、il-6水平显著升高，符合血瘀模型特征，三种炮制品对tnf-α、il-6炎症因子均有显著调节作用，但给药组之间无明显差异。

本研究从血液流变学、纤溶系统及炎症反应多角度评价温郁金三种饮片活血化瘀的治疗作用，结果表明三种饮片对气滞血瘀模型大鼠的血液流变、纤溶系统及炎症异常均有改善作用，并在一定范围内，呈剂量相关性，各饮片高剂量组的治疗效果均较低剂量组更好。三种饮片高剂量组之间，醋莪术的改善效果非常显著，验证了中药炮制的“醋制入肝”，增强活血化瘀作用的炮制理论。