一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法与流程

本发明属于羊蹄甲炮制品分析技术领域，具体涉及一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法。

背景技术：

羊蹄甲来源于绵羊或是山羊的蹄甲，民间用来调剂免疫及催乳，但需炮制后使用。目前尚无羊蹄甲药用标准，也无相关鉴定研究，市场上也有将羊蹄甲炮制品与猪蹄甲炮制品混用的现象，从而影响羊蹄甲炮制品的品质。因此，为了鉴定掺假的羊蹄甲炮制品，有必要建立一种羊蹄甲炮制品的鉴定方法，有效保证羊蹄甲炮制品的药材品质，保证药材的临床疗效。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法和羊蹄甲炮制品的鉴定方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法，该方法采用hplc法对羊蹄甲炮制品进行鉴定，其中色谱条件包括：

色谱柱为c18色谱柱；

检测波长为200-400nm；

流速0-2ml/min；

流动相：流动相a为甲醇或乙腈，流动相b为水，流动相a和/或流动相b添加0.01%-5%的三氟乙酸（tfa）；

流动相a的洗脱范围为0-10%。

进一步的，流动相a的洗脱浓度：

0～20min，流动相a为1%；

20～30min，流动相a为1-2%；

30～45min，流动相a为2%；

45～50min，流动相a为2-10%；

50～55min，流动相a为10-1%；

55～60min，流动相a为1%。

进一步的，所述方法还包括供试品溶液的制备方法：取净羊蹄甲，大小分开，用砂烫至鼓起呈金黄色时，取出，筛去砂子，放凉后粉碎；精密称取80目样品粉末1.0g，加15倍量水，称定质量，回流30min，冷却至室温，水补足减失的质量，收取滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

进一步的，所述方法还包括吸取10μl供试品注入液相色谱仪进行测定，得到羊蹄甲炮制品水溶性成分指纹图谱。

一种羊蹄甲炮制品的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）根据权利要求1-4任一项所述的方法测定待测样本的指纹图谱；

（2）将待测样本的指纹图谱与建立的标准指纹图谱进行对比，以特征峰计算，相似度不低于0.85为合格。

进一步的，保留时间为19.49min的成分峰为羊蹄甲炮制品的特征峰。

有益效果：本发明提供了一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法，该方法简单方便、重现性好、准确率高，提高了羊蹄甲炮制品鉴定的准确性，确保了羊蹄甲炮制品的中药品质。使用本发明的流动相体系和洗脱方法建立的指纹图谱，更好的呈现了羊蹄甲炮制品的特征峰，便于对样本进行区分和鉴定。该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，对羊蹄甲炮制品的鉴定起到重要的作用。

附图说明

图1为羊蹄甲炮制品hplc指纹图谱。

图2为羊蹄甲、猪蹄甲炮制品hplc指纹图谱对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1、色谱条件

sepaxbio-c18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温30℃，流动相a0.1%tfa甲醇，流动相b0.1%tfa水，梯度洗脱(0～20min，1%流动相a；20～30min，1-2%流动相a；30～45min，2%流动相a；45～50min，2-10%流动相a；50～55min，10-1%流动相a；55～60min，1%流动相a)；体积流量0.5ml/min，检测波长275nm，柱温40℃，进样量10μl。

2、样品制备

（1）取净羊蹄甲，大小分开，用砂烫至鼓起呈金黄色时，取出，筛去砂子，放凉后将其粉碎；

（2）供试品溶液的制备：精密称取样品粉末（80目）1.0g，加15倍量水，称定质量，回流30min，冷却至室温，水补足减失的质量，收取滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

3、精密度试验

取同一供试品溶液，按以上色谱条件，连续进样6次，记录色谱峰。选择次1号峰作为参照峰，利用《中药指纹图谱相似度评价系统软件》(2012版)进行处理，进行精密度评价。结果表明，羊蹄甲炮制品水溶性成分各主要色谱峰相对保留时间的rsd小于1.39%，相对峰面积的rsd小于2.71%。表明该方法精密度良好。

4、重复性试验

取同一批样品6份，按以上方法制备供试品溶液，在以上色谱条件下进样，测得羊蹄甲炮制品水溶性成分各主要色谱峰相对保留时间的rsd小于2.13%，相对峰面积的rsd小于2.65%。表明重复性良好。

5、稳定性试验

取同一供试品溶液，按以上色谱条件，分别于0、1、2、4、8、12、24h进样，测得羊蹄甲炮制品水溶性成分各主要色谱峰相对保留时间的rsd小于1.33%，相对峰面积的rsd小于2.95%，表明24h内供试品溶液的稳定性良好。

6、指纹图谱建立及相似度评价

对12批羊蹄甲炮制品分别进行测定，记录色谱图，如图1所示，并将图谱分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），进行相似度评价。分别以s1为参照图谱；中位数法；时间窗宽度为：0.20min；多点校正后进行谱峰匹配。得到羊蹄甲炮制品水溶性成分指纹图谱，并生成羊蹄甲炮制品水溶性部位共有模式的对照图谱，羊蹄甲炮制品确定了19个共有峰。羊蹄甲炮制品的相似度在0.865～0.998，结果见表1。

表1

根据图1结果所示，羊蹄甲炮制品保留时间为19.49min的成分峰面积最高，12批羊蹄甲均检测出此峰，为其标志性成分。由图2可知，羊蹄甲炮制品保留时间为19.49min的成分峰与猪蹄甲炮制品的hplc谱图存在显著差异，可以作为鉴定羊蹄甲炮制品的鉴别峰。

技术特征：

1.一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法采用hplc法对羊蹄甲炮制品进行鉴定，其中色谱条件包括：

色谱柱为c18色谱柱；

检测波长为200-400nm；

流速0-2ml/min；

流动相：流动相a为甲醇或乙腈，流动相b为水，流动相a和/或流动相b添加0.01%-5%的三氟乙酸；

流动相a的洗脱范围为0-10%。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，流动相a的洗脱浓度：

0～20min，流动相a为1%；

20～30min，流动相a为1-2%；

30～45min，流动相a为2%；

45～50min，流动相a为2-10%；

50～55min，流动相a为10-1%；

55～60min，流动相a为1%。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述方法还包括供试品溶液的制备方法：取净羊蹄甲，大小分开，用砂烫至鼓起呈金黄色时，取出，筛去砂子，放凉后粉碎；精密称取80目样品粉末1.0g，加15倍量水，称定质量，回流30min，冷却至室温，水补足减失的质量，收取滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述方法还包括吸取10μl供试品注入液相色谱仪进行测定，得到羊蹄甲炮制品水溶性成分指纹图谱。

5.一种羊蹄甲炮制品的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据权利要求1-4任一项所述的方法测定待测样本的指纹图谱；

（2）将待测样本的指纹图谱与建立的标准指纹图谱进行对比，以特征峰计算，相似度不低于0.85为合格。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，保留时间为19.49min的成分峰为羊蹄甲炮制品的特征峰。

技术总结
本发明公开了一种羊蹄甲炮制品指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液的制备和使用HPLC获取指纹图谱的步骤。色谱条件包括：色谱柱为C18色谱柱；检测波长为200‑400nm；流速0‑2mL/min；流动相：流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水，流动相A和/或流动相B添加0.01%‑5%的三氟乙酸；流动相A的洗脱范围为0‑10%。该方法简单方便、重现性好、准确率高，提高了羊蹄甲炮制品鉴定的准确性，确保了中药品质。使用本发明的流动相体系和洗脱方法建立的指纹图谱，更好的呈现了羊蹄甲炮制品的特征峰，便于对样本进行区分和鉴定。该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，对羊蹄甲炮制品的鉴定起到重要的作用。

技术研发人员：刘逊;张迪
受保护的技术使用者：苏州卫生职业技术学院
技术研发日：2020.05.28
技术公布日：2020.08.25