血清Sparcl1蛋白在非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及sparcl1蛋白在制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物中的应用。

背景技术：

由于生活方式的转变，包括：高脂肪性食物的摄入、高果糖性饮料的摄入、缺乏运动和体力活动等，肥胖症在包括我国在内的全球范围流行。肥胖症可引起多器官的功能紊乱，其中，在肝脏，肥胖症是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,nafld)的主要危险因素。nafld是一个连续的疾病谱，包括从单纯性脂肪肝(non-alcoholicfattyliver,nafl)到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,nash)，nafl的特征性表现为肝细胞内甘油三酯的大量沉积，而在此基础上，nash还包括肝脏炎性细胞浸润、炎症因子表达增加、肝细胞凋亡和坏死增多、肝损伤指标(如血清谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)和谷氨酰基转移酶(ggt))升高，伴或不伴胶原纤维的沉积。

单纯性脂肪肝的临床诊断，目前已有较多的无创检查方法，包括：血清生化检查、腹部b超、ct、核磁共振等；但nash诊断的金标准，仍然是进行穿刺活检吸取少量肝脏组织，开展病理学检测和评分。由于肝脏穿刺具有较大的创伤性，并存在一定的风险(如肝脏出血、感染等)，因此寻找无创或创伤较小的检测方法，成为临床上nash诊断亟待解决的一大难题。

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(secretedproteinacidicandrichincysteinelike1,sparcl1)是一种分泌型糖蛋白。人的sparcl1基因位于4号染色体上，包含11个外显子和10个内含子，碱基长度约为47kb，而小鼠的sparcl1基因则位于5号染色体上。sparcl1基因在脂肪、皮肤、大脑等多个器官和组织中丰富表达，在生理情况下，主要调节了细胞的增殖、分化和迁移等，在胚胎期与器官的正常发育密切相关，而在成年期则积极参与组织修复和重塑。此外，sparcl1的异常表达与包括非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和骨肉瘤在内的多个肿瘤的发生、发展和转移相关。截至目前，sparcl1和nash发生发展的关系，国内外尚无报道。

技术实现要素：

鉴于目前nash诊断金标准采用的肝穿活检检查存在有创性的缺陷，本发明的主要目的在于提供sparcl1蛋白的新用途，以及一种方便快捷且无创的诊断非酒精性脂肪性肝炎的药物和/或方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了sparcl1蛋白在制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物中的应用，所述诊断中的应用包括nash的早期诊断或确定nash的严重程度，所述诊断通过测定外周血血清中sparcl1蛋白的含量进行。

在本发明的实施方案中，所述非酒精性脂肪性肝炎包括肝细胞内甘油三酯的大量沉积，还包括但不限于肝脏炎性细胞浸润、炎症因子表达增加、肝细胞凋亡和坏死增多、肝损伤指标升高、伴或不伴胶原纤维的沉积。

在本发明的实施方案中，所述肝损伤指标包括但不限于血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷氨酰基转移酶。

在本发明的实施方案中，所述诊断通过酶联免疫定量检测试剂盒进行检测。

在本发明的实施方案中，所述药物包括试剂盒。

在本发明的实施方案中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。

在本发明的实施方案中，所述酶联免疫试剂盒中包含所述sparcl1蛋白的抗体。

在本发明的实施方案中，所述酶联免疫试剂盒中还包含预包被板、标准品、包被缓冲液、样品稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶、洗脱液和显色剂。

本发明还提供了用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎或用于确定非酒精性脂肪性肝炎的严重程度的方法，所述方法包含测定受试者外周血血清sparcl1蛋白的含量或水平的步骤，通过上述任一所述sparcl1蛋白在制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物中的应用来实现。

在本发明的实施方案中，基于外周血血清sparcl1蛋白的含量或水平计算肝脏nas积分，并且基于所述nas积分来诊断nash或确定nash的严重程度。

本发明的有益效果在于：本发明通过检测血清中sparcl1蛋白含量发现，同正常人和nafl患者相比，nash患者血清sparcl1蛋白含量显著升高，并同肝损伤指标(血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷氨酰基转移酶)呈现明显的正相关性。另外，通过肝穿组织病理结果的关联分析也表明，随着病理评分的增加，血清sparcl1蛋白含量显著升高，证实血清sparcl1蛋白可用于nash的新型无创性诊断。

附图说明

图1是实施例1中正常人、nafl患者和nash患者三组人群血清sparcl1蛋白含量测定。

图2是实施例1中正常人、nafl患者和nash患者三组人群血清sparcl1蛋白含量和谷丙转氨酶(a)、谷草转氨酶(b)、谷氨酰基转移酶(c)的相关性分析。

图3是实施例2中nafl患者和nash患者两组人群血清sparcl1蛋白含量和肝脏nas积分、肝细胞气球样变(ballooning)、脂肪变性(steatosis)、小叶炎症(inflammation)的相关性分析；其中：(a)随着肝脏nas积分的增加，血清sparcl1蛋白含量逐渐增加；(b)随着肝细胞气球样变严重程度的增加，血清sparcl1蛋白含量逐渐增加；(c)随着脂肪变性严重程度的增加，血清sparcl1蛋白含量逐渐增加；(d)随着小叶炎症严重程度的增加，血清sparcl1蛋白含量逐渐增加。

图4为：(a)受试者工作特征曲线下面积(areaunderthereceiveroperatingcurve，auroc)，数据表明血清sparcl1蛋白含量可单独诊断nash(auroc＝0.84，p<0.001)；(b)sparcl1-alt-ast联合诊断的auroc显著高于alt-ast联合诊断的auroc(p＝0.0012)。

具体实施方式

本发明的发明人发现，血清sparcl1蛋白含量和肝损伤指标(血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷氨酰基转移酶)和nas积分呈现明显正相关，从而提出sparcl1蛋白的新用途，并将其用于制备非酒精性脂肪性肝炎诊断药物，同时提出用于诊断受试者的非酒精性脂肪性肝炎或用于确定非酒精性脂肪性肝炎的严重程度的方法。

本发明中，sparcl1蛋白的氨基酸序列为：mktglfflcllgtaaaiptnarllsdhskptaetvapdntaipslraeaeeneketavsteddshhkaekssvlkskeesheqsaeqgksssqelglkdqedsdghlsvnleyaptegtldikedmsepqekklsentdflapgvssftdsnqqesitkreenqeqprnyshhqlnrsskhsqglrdqgnqeqdpnisngeeeeekepgevgthndnqerktelprehanskqeedntqsddileesdqptqvskmqedefdqgnqeqednsnaemeeenasnvnkhiqetewqsqegktgleaisnhketeektvseallmeptddgnttprnhgvdddgdddgddggtdgprhsasddyfipsqafleaeraqsiayhlkieeqrekvhenenigttepgehqeakkaenssneeetssegnmrvhavdscmsfqckrghickadqqgkphcvcqdpvtcpptkpldqvcgtdnqtyasschlfatkcrlegtkkghqlqldyfgacksiptctdfeviqfplrmrdwlknilmqlyeansehagylnekqrnkvkkiyldekrllagdhpidlllrdfkknyhmyvypvhwqfseldqhpmdrvlthselaplraslvpmehcitrffeecdpnkdkhitlkewghcfgikeedidenllf，如seqidno:1所示。

本发明中，sparcl1蛋白的抗体由美国明尼苏达州r&dsystems公司提供的elisa试剂盒提供，货号为dy2728。

本发明中，采用的试剂或材料如下：

(1)酶联免疫定量检测试剂盒由美国明尼苏达州r&dsystems公司提供，货号dy2728。

(2)以下试剂由上海冠泰生物科技有限公司提供，具体如表1所示：

表1：试剂清单

(3)其他试剂或材料：

①一抗、生物素二抗，标准品，hrp-strepavidin浓缩液；

②封板膜(platesealer)，有粘性，贴在板上，用于板的密封，防止异物跌落在板孔内；货号：el-cpx08；

③elisa洗涤液，货号el-00402，用于洗板；

④pbs缓冲液即磷酸盐缓冲液，能够提供相对稳定的离子环境和ph缓冲能力，是生物学中经常使用的缓冲盐溶液，ph为7.2-7.4，主要成分为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠以及氯化钠。

⑤el-cpi05-20，自封铝箔袋，干燥剂。

本发明中，试剂盒的使用说明和包被实验示例如下：

(1)原料配制

①coatingbuffer包被缓冲液：ph值9.6，包含：无水na2co31.59g、nahco32.93g，加双蒸水定容至1000ml；

②冲洗缓冲液(pbst)，ph值7.4，包含：nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4.12h2o2.9g、kh2po40.2g、tween-200.5ml，加双蒸水定容至1000ml；

③抗体稀释缓冲液(pbst-pvp)，ph值7.4，包含：上述pbst1000ml，加入牛血清蛋白(bovineserumalbumin,bsa)2.0g、polyvinylpyrrolidone(pvp)20g；

④碱性磷酸酶底物稀释缓冲液，ph值9.8，包含：二乙醇胺97ml、mgcl20.1g，加双蒸水定容至1000ml。

(2)包被实验

在elisa酶标板(el-cpx02)中每孔加入100微升包被液(包被液若有剩余可多包被一点，以条为单位)，在板上贴膜(封板，platesealer)，室温(控制室温在25℃，板放置处旁放置温度计控温)温育过夜(下午4点到第二天早上9点)；结束温育(参考抗体说明书的包被条件进行相应调整)，多余的配好的包被液不能保存。

(3)洗板封闭

①将洗液20×washbuffer(el-00402)(可用pbs+tween20代替)配制成1×washbuffer(实验前合理计算用量，配制成足够的量待用)，用1×washbuffer洗板4次(注：包被组分在加稳定剂前不能剧烈震荡或完全干燥，所以洗板过程需快速、温和，不要拼命拍板)；

②洗板后立即加入200微升每孔的酶标板稳定剂(el-cpx03)，37℃温育1小时；

③弃掉或吸取酶标板稳定剂。

(4)检测方法

采用双抗夹心法进行酶联免疫定量检测，具体步骤为：

1)以上的酶标板已经预包被抗体，选取相应的板条；

2)标准品用相应的稀释液稀释；

3)酶标板中加入适量稀释好的标准品和样品，各100微升；

4)37度温育1到2小时；

5)洗板四次(洗液同上)；

6)生物素二抗根据说明书，用生物素(biotin)稀释液(el-cpx04)进行稀释；

7)37度温育30分钟；

8)洗板四次；

9)hrp酶联物，用(el-cpx05)稀释；

10)每孔加入100微升稀释好的hrp酶联物，37度温育1小时或其他时间；

11)洗板四次；

12)加入显色液：显色液a，b(substratea，b)(el-cpx06)；使用前按照a液和b液1:1比例充分混匀，使用前15分钟配置；每孔加入50-100微升混合后的显色液，室温温育10-30分钟，显色时间根据目测最高浓度标准品的颜色，应为深蓝色，630读数，od值应在0.7以上；

13)加入终止液(stopsolution)(el-cpx07)100微升每孔，加入终止液50-100微升，显色从蓝色转为黄色，采用450-630nm的双波读数。

以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

以下实施例中，表2、表3、图1的分析由1-wayanova检验完成，图2的分析由pearson相关性分析完成，图3的分析由spearman相关性分析完成，图1至图3的绘制由graphpad软件完成(版本号6.01)，图4的auroc曲线分析和绘制由sas软件完成(版本号9.3)。

实施例1

招募年龄和性别匹配的正常人、单纯性脂肪肝(nafl)患者、非酒精性脂肪性肝炎(nash)患者，通过酶联免疫吸附实验(elisa)检测血清中sparcl1蛋白含量，具体为：

招募正常人314例、单纯性脂肪肝患者110例、非酒精性脂肪性肝炎患者107例三组人群，其中，正常人招募自复旦大学附属中山医院内分泌科，单纯性脂肪肝患者和非酒精性脂肪性肝炎患者招募自温州医科大学附属第一医院脂肪肝研究中心。上述三组人群均经过体格检查、血液生化检查、血液肝功能指标检查、腹部b超检查，血清sparcl1蛋白含量检测由美国明尼苏达州r&dsystems公司提供的elisa检测试剂盒完成(货号dy2728)，结果如表2、表3、图1和图2。

表2：正常人、nafl患者和nash患者三组人群的临床数据

所有数据标示为：平均数±标准差(或四分位差)，

a:经log转换后的统计学分析，

§:校正年龄、性别和体质指数后。

表3：nafl和nash患者两组人群的临床数据

所有数据标示为：平均数±标准差(或四分位差)，

a:经log转换后的统计学分析，

§:校正年龄、性别和体质指数后。

通过上述实验发现，正常人和nafl患者两组血清sparcl1蛋白含量无显著改变。同正常人和nafl患者组相比，nash患者组的血清sparcl1蛋白含量显著增加(p<0.001)，如图1所示。另外，目前血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷氨酰基转移酶是肝脏损伤的特异性指标，并被用于辅助诊断nash，通过pearson相关性分析发现，血清sparcl1蛋白含量同谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷氨酰基转移酶的含量呈现显著的正相关性(p<0.001)，如图2所示。

实施例2

对实施例1中110例nafl患者和107例nash患者的每一例均进行穿刺活检取少量肝脏组织行病理学分析，由温州医科大学附属第一医院脂肪肝研究中心完成，结果如表3、图3和图4所示。

肝脏nas积分包括脂肪变性、肝细胞气球样变、小叶炎症，是肝穿病理分析的指标；其中，nas积分4是nafl，5是nash。通过spearman相关性分析发现，随着nas积分的增加，血清sparcl1蛋白含量逐渐增加。此外，随着上述三个指标评分的增加，血清sparcl1蛋白含量逐渐增加，如表3和图3所示。

如图4所示，受试者工作特征曲线下面积的数据表明，血清sparcl1蛋白含量可单独诊断nash(auroc＝0.84,p<0.001)；此外，sparcl1-alt-ast联合诊断的auroc显著高于alt-ast联合诊断的auroc(p＝0.0012)。

综上所述，本发明发现血清sparcl1蛋白含量与nash具有相关性，并证明sparcl1蛋白可用于制备nash的诊断药物，通过检测受试者血清sparcl1蛋白的含量可作为nash的诊断提供新型而无创的方法。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>复旦大学附属中山医院

温州医科大学附属第一医院

<120>血清sparcl1蛋白在非酒精性脂肪性肝炎诊断中的应用

<141>2020-06-04

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>664

<212>prt

<213>unknown

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