本发明涉及医药检测领域，尤其涉及到一种利用稳定同位素标记物作为内标测定药物浓度的质谱分析方法，更具体地说是利用氘代霉酚酸-d3测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法。
背景技术：
霉酚酸酯(mmf)作为主要的免疫抑制剂已被广泛用于器官移植后急性排异反应的预防和治疗。mmf口服吸收后在血浆酯酶的作用下水解为游离的活性代谢物mpa；后者通过抑制鸟嘌呤从头合成途径中的限速酶(次黄嘌呤核苷酸脱氢酶)，选择性阻滞t和b细胞增殖，对移植排异和自身免疫疾病均有显著的疗效。mmf的药物代谢动力学个体差异较大，其药-时曲线下面积(auc)与药效及不良反应相关，因此监测mpa在体内的药物浓度在临床用药中具有重要意义。目前检测霉酚酸的常见方法有：紫外分光光度法、均相免疫分析法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。
稳定同位素内标质谱法是将已知质量和丰度的浓缩稳定同位素作为内标物配制成一定浓度的内标液，定量加入样品中，均匀混合，用质谱仪测定混合前后同位素丰度的变化，由此计算出样品中该元素含量的方法。由于是根据同位素比值的测定来求含量，而比值的测定很少受到基质效应和仪器条件变化的影响，因而该法是一种准确度和精密度高的方法。
在现有检测霉酚酸的分析技术中，内标一般分为两种类型，即结构类似物内标(如吲哚美辛、奈普生)和同位素内标(霉酚酸-d3)。其中同位素内标和待测物在离子化效率和回收率上的差异更小，使用同位素作为内标的方法在精密度、准确度和稳定性上优于以结构类似物为内标的方法。
专利文献【申请号200810202401.x】发明了同时测定人尿液中霉酚酸酯、霉酚酸及其代谢产物的方法、专利文献【公开号cn110376386a】中发明的试纸条，虽然操作方便，但其准确性有待进一步验证，灵敏度低于质谱方法。专利文献【cn110554123a】“一种快速检测全血中免疫抑制剂的方法、试剂盒及其应用”在质谱检测中使用了10ng/ml的霉酚酸同位素内标，但对内标物的结构或其它可使用浓度没有做具体说明。目前未见报道利用霉酚酸-d3(浓度范围2.5μg/ml～10μg/ml)测定多种生物样本中霉酚酸含量的质谱方法。
技术实现要素：
本发明的目的之一是针对现有技术的不足，提供一种利用最适宜浓度和操作的霉酚酸-d3作为内标测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法，对血液、尿液、组织等多种生物样本中霉酚酸的浓度能够准确、稳定地监测。
本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：
1.一种利用霉酚酸-d3作为内标测定生物样本中霉酚酸含量的质谱检测试剂及其使用方法，其特征在于：本发明为一种含有霉酚酸-d3的质谱检测试剂及其使用方法，用于检测生物样本中霉酚酸的含量。
2.进一步的，所述霉酚酸-d3为稳定同位素(氘)标记的霉酚酸，分子质量数较霉酚酸高，质谱检测时能够区分两者。将霉酚酸-d3溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶液，配制成浓度范围200μg/ml～1mg/ml霉酚酸-d3内标储备液，使用前稀释至2.5μg/ml～10μg/ml。
3.进一步的，将霉酚酸标准品配制成6～8个浓度梯度的溶液(浓度范围在0.10～40.00μg/ml)，用于绘制标准曲线。将霉酚酸-d3作为内标，按照一定比例稀释待测样本，用质谱方法检测。
4.进一步的，所述标准曲线是以霉酚酸校准品的实测峰面积与内标霉酚酸-d3峰面积的比值(y)对霉酚酸标示浓度(x)作线性回归分析、采用加权最小二乘法获得的回归方程y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距。
5.进一步的，从服用霉酚酸酯后的生物体内采集样本，进行样本前处理。生物样本包括人体和动物来源的体液、细胞或组织，其中体液包括全血、血浆或血清、尿液、唾液、组织液(脑脊液、淋巴液)等。样本前处理采用乙腈沉淀蛋白。
6.进一步的，将检测信号(待测样本中霉酚酸与霉酚酸-d3的色谱峰面积比值)代入标准曲线方程，计算出霉酚酸含量。
本发明的优点在于：
1.采用了稳定同位素霉酚酸-d3做内标，该化合物与霉酚酸的提取效率及绝对基质效应非常接近，可以最大程度的减弱样本处理和检测过程效应对结果的影响。
2.多次验证时标准曲线的相关系数r>0.99，检测精密度的变异系数小于10％，准确度大于90％，方法较为稳定。
3.采用了直接乙腈沉淀蛋白法。该方法操作简便，成本较低，耗时短；流动相中含0.1％甲酸，有助于提高霉酚酸的离子化效率，进而提高方法的灵敏度。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、特征、达成目的与功效易于明白了解，下面以血浆和尿液两种生物样本为例，进一步阐述本发明的具体实施步骤。
具体实施例1:血浆样本
一、试剂配制：
1.霉酚酸对照品储备液：精确称取10.0mg霉酚酸标准品置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，浓度为1mg/ml；分装后，-80℃冷冻。
2.霉酚酸-d3内标溶液：精密称取5.0mg霉酚酸-d3置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，使成浓度为500μg/ml的储备液。吸取500μl加入50ml容量瓶中，甲醇定容，得到5μg/ml的工作液。分装后-80℃冷冻。
3.校准品(标准曲线试剂)：
吸取霉酚酸对照品溶液20μl，加空白血浆480μl，配制成40μg/ml溶液a。
吸取a150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为20μg/ml溶液b。
吸取b150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为10μg/ml溶液c。
吸取c150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为5μg/ml溶液d。
吸取d150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为2.5μg/ml溶液e。
吸取e150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为1.25μg/ml溶液f。
吸取f150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为0.625μg/ml溶液g。
吸取g150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为0.3125μg/ml溶液h。
4.质控品：用空白血浆稀释霉酚酸对照品储备液，配制成高中低三个浓度，分别为13.33μg/ml、4.44μg/ml、1.48μg/ml，每瓶分装1.0ml。以上组分均冻干于测定瓶底保存。
5.流动相a(含0.1％甲酸的2mmol/l乙酸铵水溶液)：精密量取200μl甲酸、30.9mg乙酸铵于200ml超纯水中，混匀，超声10min。
6.流动相b(含0.1％甲酸的乙腈)：精密量取900μl甲酸于900ml乙腈中，混匀，超声10min。
二、样本准备
1.样本采集：按照有限采样法采集血浆样本，根据采样时间点将浓度记为c0(服药前)、c0.5(给药后0.5h)、c2(给药后2h)。置于2～8℃保存备测。
2.样本预处理：
(1)准确移取血浆样本20μl于1.5mlep管中，加入20μl内标工作液，适当混匀。
(2)加入乙腈400μl。
(3)涡旋震荡5min，12000rpm，4℃离心10min。
(4)取200μl上清液用于质谱检测。
三、检测分析
1.适用仪器：acquityuplc超高效液相色谱仪、quattropremierxe三重四极杆质谱仪。
2.色谱条件：色谱柱采用watersbehc18(50×2.1mm，1.8μm)；流动相a为含有0.1％甲酸的乙酸酸铵水溶液，b为含0.1％甲酸的乙腈；柱温：40℃；进样量：2μl；流速：0.2ml·min-1，梯度洗脱参数设置见表1。
表1.梯度洗脱条件
3.质谱条件：正离子检测模式(+esi)下；毛细管电压：3.0kv；锥孔电压：12v；锥孔温度：120℃；离子源温度：350℃；脱溶剂气(n2)流速：800l·h-1；锥孔反吹气流速:10l·h-1；采用mrm扫描方式；监测离子对：霉酚酸321.2-207.2，霉酚酸-d3324.2-210.2。
4.测定：取校准品、质控品、待测样本进行前处理后，取上清液200μl进行定量分析，记录不同离子通道的色谱峰面积。
5.质量控制：每1分析批样本随行1条标准曲线(不同浓度值校准品样本各1个)和2个质控样本(从高、中、低浓度中选择相近的2个)。质控品样本测定结果偏差应小于15％，最多允许1/3的质控品样本结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控品样本中。如质控品样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废，重新检测。
6.结果计算
(1)标准曲线绘制：以8个不同标示浓度的校准品浓度为横坐标(x)，以8个校准品样本的实测峰面积与霉酚酸-d3峰面积比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。采用加权(1/x2)最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距。
(2)回收率的计算：将测定的质控品峰面积与霉酚酸-d3峰面积比值代入上述标准曲线方程，计算质控品样本的实测浓度。根据公式“回收率(％)＝实测浓度/标示浓度×100”，结果应在100±15％范围内。
(3)样本结果计算：将样本的峰面积代入标准曲线方程，计算样本的霉酚酸药物浓度。
具体实施例2：尿液样本
一、试剂配制：(除校准品和质控品外，其它步骤同实施例1)
校准品(标准曲线试剂)：
吸取霉酚酸对照品溶液15μl，加空白尿液485μl，配制成30μg/ml溶液a。
吸取a150μl，加入空白尿液150μl，配制成浓度为15μg/ml溶液b。
吸取b100μl，加入空白尿液200μl，配制成浓度为5μg/ml溶液c。
吸取c60μl，加入空白尿液240μl，配制成浓度为1μg/ml溶液d。
吸取d150μl，加入空白尿液150μl，配制成浓度为0.5μg/ml溶液e。
吸取e60μl，加入空白尿液240μl，配制成浓度为0.1μg/ml溶液f。
吸取f150μl，加入空白血浆150μl，配制成浓度为0.05μg/ml溶液g。
质控品：在霉酚酸中加入空白尿液配制成高中低三个浓度，分别为0.5μg/ml、5.0μg/ml、30μg/ml，-20℃保存。
二、样本准备
1.样本采集：取服药前0.5h内的中段尿液样本，置于2～8℃保存备测。
2.样本预处理：
(1)准确移取尿液样本20μl于1.5mlep管中，加入甲醇溶液100μl进行尿样稀释，离心后取上清80μl加入20μl内标工作液，适当混匀。
(3)加入乙腈400μl。
(4)涡旋震荡5min，12000rpm离心10min。
(5)取200μl上清液用于质谱检测。
三、检测分析
1.适用仪器：acquityuplc超高效液相色谱仪、quattropremierxe三重四极杆质谱仪。
2.色谱条件：色谱柱采用watersbehc18(50×2.1mm，1.8μm)；流动相a相为含有0.1％甲酸的甲酸铵水溶液，b相为甲醇；柱温：40℃；进样量：2μl；流速：0.2ml·min-1，梯度洗脱参数设置：
表2.梯度洗脱条件
3.质谱条件
正离子检测模式(+esi)下；毛细管电压：3.0kv；锥孔电压：12v；锥孔温度：120℃；离子源温度：350℃；脱溶剂气(n2)流速：800l·h-1；锥孔反吹气流速：10l·h-1；采用mrm扫描方式；监测离子对：霉酚酸321.2-207.2，霉酚酸-d3324.2-210.2。
4.测定
取校准品、质控品、待测样本进行样本前处理后，取上清液进样200μl进行定量分析，记录不同离子通道的色谱峰面积。
5.质量控制
每1分析批样本随行1条标准曲线(7个不同浓度值校准品样本各1个)和2个质控样本(从高、中、低浓度中选择相近的2个)。质控品样本测定结果偏差应小于15％，最多允许1/3的质控品样本结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控品样本中。如质控品样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废，重新检测。
6.结果计算
(1)标准曲线绘制：以校准品标示浓度为横坐标(x)，以校准品样本的实测峰面积与霉酚酸-d3峰面积比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。采用加权(1/x2)最小二乘法进行线性回归。拟合线性回归方程：y＝ax+b，其中a为斜率，b为截距，相关系数(r)应>0.9900。尿液样本中霉酚酸的浓度在0.1～30μg/ml范围内时，检测信号与浓度存在较好的线性关系，可以通过标准曲线计算。
(2)回收率的计算：将测定的质控品峰面积与霉酚酸-d3峰面积比值代入上述标准曲线方程，计算质控品样本的实测浓度。根据公式“回收率(％)＝实测浓度/标示浓度×100”计算回收率，应在100±15％范围内。
(3)样本结果计算：
将样本的峰面积代入标准曲线方程，计算出样本中霉酚酸浓度(μg/ml)。
总结
在该方法条件下，霉酚酸的标准曲线相关系数和质控品回收率均符合规定，可保证该方法所测样品结果的准确性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。