一种低聚麦芽糖的测定方法及在产品质量控制领域的应用与流程

本发明属于低聚麦芽糖分析检测技术领域，具体涉及一种低聚麦芽糖的快速测定方法以及该检测方法在工业低聚麦芽糖质量控制领域的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

低聚麦芽糖是葡萄糖基以α-(1→4)糖苷键连接而成，是在解枝酶如异淀粉酶、支链淀粉酶的作用下水解淀粉产生的不同链长低聚麦芽糖，这些α-淀粉酶具有不同的反应特性，因此可以生产出不同链长和不同低聚麦芽糖含量的糖浆。研究表明，低聚麦芽糖具有抑制肠道内细菌和有害菌生长，改善肠道内菌群，延长人体供能、快速强化机体耐力、提高机体免疫力、降低胆固醇和血脂等功效。另外，低聚麦芽糖具有甜度低、口感好、保湿性好等特点，近年来已在饮料、果冻、糖果、冰淇淋、糕点、焙烤食品、婴儿奶粉等中得到广泛应用。

目前，关于糖含量的测定方法主要有纸色谱法、薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法和生物传感器法等。纸色谱法和薄层色谱法精密度差，不能准确定量，且分析时间长。气相色谱法需要进行衍生后再分析，操作较繁琐，重复性比较差。hplc法较其它方法简单、快速，是当前应用较多的方法。近年来，麦芽糖的分析测定国内外报道较少，gb/t20883-2017中提供了麦芽糖的分析方法，但仅仅对麦芽糖总量进行了分析。有关低聚麦芽糖的组成分布和含量，是评判麦芽低聚糖产品质量的重要指标。同时，不同类型食品、饮料、保健品中添加的低聚麦芽糖的分析测定亦缺乏有效的分析质控方法。因此，开展低聚麦芽糖的分析测定方法研究，对提高低聚麦芽糖及相关产品的质量控制水平具有重要意义。

近年来，亲水色谱技术以极性分离材料为固定相，对糖类成分的分离表现出良好的效果，且与质谱有很好的兼容性。电喷雾飞行时间质谱技术能够提供目标化合物的精确分子量信息和多级碎片信息，可以在没有标准品的情况下推断化合物的分子式。

技术实现要素：

针对上述研究背景，本发明目的在于提供适用于工业生产中低聚麦芽糖的定量检测方法。本发明以工业生产的低聚麦芽糖样品为研究对象，建立了亲水色谱-蒸发光检测器-电喷雾飞行时间串联质谱技术分析测定低聚麦芽糖产品中低聚糖种类和含量的方法，以期为低聚麦芽糖工业产品及其在食品、饮料等相关领域的应用提供分析质控方法支持。

基于上述技术目的，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种低聚麦芽糖的测定方法，所述测定方法包括通过亲水作用色谱柱、乙腈-水体系配合梯度洗脱的方式对待测样品进行分离得到色谱峰，联合电喷雾飞行时间质谱对分离的色谱峰进行鉴定。

低聚麦芽糖类似水溶性植物纤维，具有易消化、低甜度和低渗透性，能够增加机体耐力和抗疲劳。作为代糖使用，随着聚合度增加，低聚麦芽糖的甜度主将下降，因此，针对聚合度为10以下的麦芽糖进行检测和鉴定在工业领域具有更加广泛的应用价值。

针对上述技术目的，本发明针对低聚麦芽糖的分离和鉴定条件进行探究，得到了一种具有良好检测精度，并且可以同时检测七种成分的检测方法。

本发明第二方面，提供第一方面所述低聚麦芽糖的测定方法在低聚麦芽糖产品质量控制领域的应用。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1.低聚麦芽糖作为工业食品添加成分具有良好经济意义，而目前针对低聚麦芽糖检测手段研究较为空白。本发明提供的检测方法是一种着重于区别低聚合度麦芽糖成分的检测方法，能够对相近结构、相近聚合度的麦芽糖成分进行区分，具有良好的应用价值。

2.本发明中提供的检测方法具有良好的检测精度，对于葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖七种化合物的检测限在0.004-0.070μg·ml^-1之间，检测精度达到ng级别，检测回收率均可以达到95％以上。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中所述混合对照品和样品的hilic-elsd色谱图；

其中，图1a为混合对照品的hilic-elsd色谱图，图1b为样品的hilic-elsd色谱图；图中，1：葡萄糖；2：麦芽糖；3：麦芽三糖；4：麦芽四糖；5：麦芽五糖；6：麦芽六糖；7：麦芽七糖。

图2为实施例1中不同类型色谱柱分离样品的色谱图；

其中，图2a为merckzic-hilic色谱柱；

图2b为watersxbridgehilic色谱柱；

图2c为watersxbridgeamide色谱柱。

图3为实施例1不同浓度缓冲盐获得色谱图。

图4为实施例1中峰7的ms和ms/ms质谱图。

图5为实施例1中峰8的ms和ms/ms质谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中针对低聚麦芽糖检测技术存在检测麦芽糖种类较少，检测精度不足的问题，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种低聚麦芽糖的测定方法。

本发明第一方面，提供一种低聚麦芽糖的测定方法，所述测定方法包括通过亲水作用色谱柱、乙腈-水体系配合梯度洗脱的方式对待测样品进行分离得到色谱峰，联合电喷雾飞行时间质谱对分离的色谱峰进行鉴定。

优选的，所述低聚麦芽糖包括单糖和以α-1，4糖苷键对相邻两葡萄糖进行连接的低聚合度麦芽糖。

进一步优选的，所述低聚合度麦芽糖为聚合度小于等于10的麦芽糖。

在一些具体的实施方式中，所述低聚麦芽糖为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖及麦芽七糖。

优选的，所述待测样品制备方法如下：将样品加入乙腈溶液中溶解、定量、纯化得到待测样品。

进一步优选的，所述乙腈溶液为乙腈的水溶液，浓度为75～85％。

进一步优选的，所述纯化采用过微孔滤膜的方式进行过滤，具体的，所述微孔滤膜尺寸为0.22μm。

进一步优选的，所述定量包括但不限于采用定量瓶进行定量。

优选的，所述亲水作用色谱柱包括但不限于硅胶基质色谱柱、亚乙基桥杂化基质色谱柱及酰胺基键合相色谱柱；进一步优选的，采用酰胺基键合相色谱柱。

在一些具体的实施方式中，所述酰胺基键合相色谱柱为watersxbridgeamide色谱柱。

优选的，所述乙腈-水体系中，所述流动相a为乙酸铵水溶液，所述流动相b为乙腈。

进一步优选的，所述乙酸铵水溶液浓度为8～12mm.

进一步优选的，所述流动相的流速为0.3～0.5ml/min.

在一些优选的实施方案中，所述梯度洗脱程序如下：时间：0-35min，b％：85％-50％。

优选的，所述色谱峰通过蒸发光检测器(elsd)进行检测；进一步优选的，所述elsd检测参数如下：气体源为n2，压力30～40psi，漂移管温度65～75℃，雾化器功率75～85％。

在一些优选的实施方案中，所述质谱电喷雾飞行时间质谱参数如下：电喷雾正、负离子模式.质量扫描范围m/z100-4000；毛细管电压：2.3～2.7kv；喷雾气压：2.0bar；干燥气流速：8.0l/min；干燥气温度：200℃；碰撞能量：8.0ev；传输时间：300.0μs。

本发明第二方面，提供第一方面所述低聚麦芽糖的测定方法在低聚麦芽糖产品质量控制领域的应用。

优选的，所述质量控制包括采用第一发明所述检测方法检测低聚麦芽糖产品中的低聚麦芽糖含量。

工业生产中，所述低聚麦芽糖通常作为蔗糖的代用品用于甜点、饮品、烘焙食品、果酱、罐头、香肠、酒类食品中，或完全代替蔗糖生产糖尿病人可使用的特殊保健食品；还应用于家禽、家畜、鱼类饲料的添加，起到促进生长和保健功效。

在上述优选技术方案的一些具体实施方式中，所述应用方式还包括检测上述食品、特殊保健食品及饲料中低聚麦芽糖含量的检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1材料与方法

1.1材料与试剂

对照品：葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖，均购于上海源叶生物科技有限公司(纯度≥98％)。乙腈(瑞典oceanpak，色谱纯)、乙酸铵(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，其余试剂均为分析纯。低聚麦芽糖样品由保龄宝生物股份有限公司提供。

1.2仪器与设备

brukerimpactiiesi-tof-ms质谱仪(德国布鲁克公司)；watersacquityh-class高效液相色谱仪(美国waters公司)；milli-q(18.2mω)超纯水处理系统(德国millipore公司)；万分之一电子分析天平(德国sartourius)；sbl-10dt型恒温超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1对照品溶液的配制

分别精密称取葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖对照品适量，精密称定，各置于10ml容量瓶中，加乙腈：水＝(80：20)适量，使其溶解并定容至刻度，作为标准储备液。

1.3.2样品溶液的制备

准确称取样品200mg，置于100ml容量瓶中，加乙腈：水＝(80：20)适量，使其溶解并定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜，即得，备用。

1.4色谱条件

watersacquityuplcamide柱(3.0×100mm，1.7μm)，流动相a为10mm乙酸铵水溶液，流动相b为乙腈，流速0.4ml/min，柱温45℃，elsd检测参数：气体源为n2，压力40psi，漂移管温度70℃，雾化器功率80％，梯度洗脱程序为t：0-35min，b％：85％-50％。

1.5质谱条件

高分辨飞行时间质谱电喷雾正、负离子模式；质量扫描范围m/z100-4000；毛细管电压：2.5kv；喷雾气压：2.0bar；干燥气流速：8.0l/min；干燥气温度：200℃；碰撞能量：8.0ev；传输时间：300.0μs。

2结果与分析

2.1质谱鉴别

在优化的亲水色谱分离条件下，采用亲水色谱-电喷雾飞行时间质谱联用技术对低聚麦芽糖中各色谱峰进行分析。根据化合物在负离子模式下产生的母离子、子离子的精确分子量信息，结合对照品和参考文献，分别对其进行定性鉴别。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系的考察

各吸取一定体积的7种对照品溶液，混合于同一容量瓶中，逐级稀释，配成不同浓度的混合标准液，按“1.4”项下色谱条件进样分析，测定各化合物的峰面积，以各化合物浓度(μg·ml^-1)的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程。结果见表2。

表2化合物分析回归方程、线性范围及检测限、定量限测定结果

由表1可以看出，7种化合物的回归方程的相关系数均优于0.9990，线性关系良好。将标准溶液稀释至低浓度进样，以3倍信噪比计算各成分的检测限，以10倍信噪比计算各成分的定量限，7种化合物的检测限在0.004-0.070μg·ml^-1之间，说明该方法灵敏度较高。在优化的色谱条件下，样品及对照品色谱图如图1所示。

2.2.2精密度试验

按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，依法测定，分别计算化合物的保留时间和峰面积的rsd，结果葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖7个化合物保留时间的rsd分别为0.40％、0.50％、0.45％、0.43％、0.30％、0.29％、0.30％，峰面积的rsd分别为2.91％、3.56％、0.83％、3.25％、3.29％、3.08％、3.20％。

2.2.3重复性试验

按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液6份，依法测定并计算6份样品中7个化合物的保留时间和峰面积的rsd，结果葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖7个化合物保留时间的rsd分别为0.35％、0.40％、0.49％、0.24％、0.20％、0.18％、0.14％，峰面积的rsd分别为3.98％、3.18％、3.93％、1.97％、1.57％、3.32％、2.13％。

2.2.4稳定性试验

按“1.3.2”项下方法制备样品溶液，于0、2、4、8、16、24h分别进样，依法测定，分别记录保留时间和峰面积，计算rsd，结果葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖保留时间的rsd分别为0.74％、0.87％、0.78％、0.79％、0.32％、0.33％、0.36％，峰面积的rsd分别为3.71％、2.63％、2.45％、2.28％、2.73％、2.72％、2.44％，表明供试品溶液中的7个成分在24h内稳定。

2.2.5加样回收率试验

取同一批已知含量的低聚麦芽糖样品适量，精密称定，分别以低、中、高3个浓度水平，准确加入一定量的7种化合物对照品，进样测定，计算回收率，结果见表3。结果显示本方法准确度良好。

表3加样回收率试验

2.3样品测定

在本研究建立的色谱条件下，采用“1.3.2”项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，采用“1.4”项下色谱条件进样分析，获得7个化合物的色谱峰面积，将测得结果带入表2线性回归方程，计算样品中各化合物的含量，结果如表4所示。

表47个化合物含量(％)测定结果(n＝6)

3讨论与结论

3.1色谱条件优化

寡糖类成分的极性较强，在普通c18色谱柱上难以保留。考察了三种不同类型亲水柱merckzic-hilic(a)、watersxbridgehilic(b)、watersxbridgeamide(c)对样品的分离效果，结果如图2，结果表明，采用watersxbridgeamide色谱柱，各化学成分分离较好，能够达到基线完全分离，因此选择watersxbridgeamide色谱柱用于进一步研究。考察了流动相类型和和缓冲盐浓度等对亲水色谱分离效果的影响，结果表明，采用乙腈-水体系，梯度洗脱，各化合物分离较好。考察了缓冲盐浓度(0、5mm，10mm，15mm)对色谱峰型的影响(见图3)，结果发现，缓冲盐浓度增加，多数色谱峰强度有明显增加趋势，当选择10mm乙酸铵作为流动相a时各化合物色谱峰对称性较好，峰型尖锐。

3.2色谱峰的质谱定性分析

首先，选择全扫描模式分别以正、负离子模式进行一级质谱扫描。通过对比，发现低聚麦芽糖在负离子模式下质谱响应较强，在正离子模式下几乎没有响应，故实验选择负离子模式对低聚麦芽糖进行质谱分析。为获得更丰富的质谱信息，增强质谱定性的可靠性，分别采用全扫描和二级离子扫描模式对各个色谱峰进行质谱鉴定分析。首先，在负离子模式(esi-)下进行全扫描分析，确定出母离子。然后给予一定的碰撞能量和碰撞气体，进行二级离子扫描。碰撞能量过高，由母离子生成的碎片过多，子离子响应过低；碰撞能量过低时，则不能生成所需的子离子。本研究通过优化裂解电压和碰撞能量，以获取丰度较强、干扰较小的子离子。对于有对照品的化合物(峰1-峰7)，根据其母离子、子离子的精确分子量信息并结合对照品进行准确鉴别；对于没有对照品的化合物(峰8-峰10)，根据其母离子、子离子的精确分子量信息并结合其裂解规律进行初步鉴别。结果如表1所示。

初步分析表明，低聚麦芽糖易形成稳定的[m-h]^-离子峰，相邻寡糖之间相差一个分子质量为162(c6h10o5)的六碳糖。下面以峰7为列，介绍各化合物的鉴别过程(峰7的一级和二级质谱图见图4)。在负离子全扫描模式下，峰7产生准分子离子峰m/z1151.3719[m-h]^-和1187.3430[m+cl]^-，推断可能分子式为c42h72o36。进一步通过二级离子扫描分析，发生糖苷键断裂，母离子丢失糖残基[m-h-(c6h10o5)n]^-(丢失162u)，形成m/z[m-h-(c6h10o5)]^-989.3125、[m-h-(c6h10o5)2]^-827.2673、[m-h-(c6h10o5)3]^-665.2157、[m-h-(c6h10o5)5]^-341.1092等碎片离子；或在丢失葡萄糖残基的基础上脱水[m-h-(c6h10o5)n-h2o]^-(丢失180u)，形成碎片离子m/z[m-h-(c6h10o5)6-h2o]^-161.0417，或者[m-h]^-母离子发生开环断裂，丢失60u，产生m/z[m-h-(c6h10o5)3-60]^-605.1913、[m-h-(c6h10o5)5-60]^-281.4931；此外，[m-h]^-母离子也发生了2，4开环断裂，丢失120u，产生碎片离子m/z[m-h-(c6h10o5)3-120]^-545.1717。进一步结合标准对照品的保留时间和质谱断裂规律等信息，可准确鉴定为麦芽七糖。

在负离子全扫描模式下，峰8产生准分子离子峰m/z[m-h]^-1313.4255、[m+cl]^-1349.4001和[m-2h]^2-656.1799，推断可能分子式为c48h82o41，通过二级离子扫描分析，出现以下碎片离子：[m-h-(c6h10o5)]^-1151.3745、[m-h-(c6h10o5)2]^-989.3125、[m-h-(c6h10o5)3]^-827.2673、[m-2h-c6h10o5]^2-575.1560、[m-h-(c6h10o5)6]^-341.1092，也符合上述裂解规律(峰8的一级和二级质谱图见图5)。进一步结合色谱峰出峰顺序，初步推断为麦芽八糖。

3.3各低聚麦芽糖含量特征

从表4中可以看出，低聚麦芽糖中麦芽七糖的含量最高，为14.31±0.13％，其次为麦芽三糖9.34±0.14％，麦芽六糖7.49±0.09％，麦芽糖、麦芽五糖和麦芽四糖的含量接近，而葡萄糖的含量最低，仅为0.80±0.02％。麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖的总含量则达到了43.39±0.35％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。