一种布瓦西坦水解杂质的检测方法与流程

本发明涉及一种布瓦西坦水解杂质的检测方法，具体来说，涉及布瓦西坦杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的检测方法，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：布瓦西坦是由比利时制药商ucb最新开发的第3代抗癫痫药物。是一种新型的突触囊泡蛋白2a(sv2a)高亲和性配体，同时对电压依赖性钠离子通道亦有一定的抑制作用。2005年，布瓦西坦获得fda及欧盟批准用于治疗罕见症状性肌阵挛癫痫发作，目前正在进行包括癫痫部分发作辅助治疗的多项ⅲ期临床试验研究，研究结果表明，布瓦西坦对于全身性癫痫发作具有较好的疗效。布瓦西坦的化学名为(s)-2-(r)-3-丙基吡咯烷-1-基丁酰胺，分子式为c11h20n2o2，分子量为212.29，结构式如下：在合成布瓦西坦原料药时，由于接触到碱性溶液，可使布瓦西坦发生水解反应，产生水解杂质，该杂质化学名称为(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸，化学结构式如下：杂质在原料药中的存在，可导致制剂的不良反应增加，甚至对患者产生严重后果，因此国际国内的药典中，均对原料药杂质的含量规定了严格的限度。为更好地控制布瓦西坦原料药的产品质量，有必要对其水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸开发出定性和定量检测方法，以便控制其在布瓦西坦原料药中含量限度，确保布瓦西坦原料药质量符合相关药典的质量要求。目前，尚未见如何检测布瓦西坦水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的报道。技术实现要素：为了有效控制布瓦西坦原料药的质量品质，本发明提供了一种布瓦西坦水解杂质的检测方法，所述水解杂质为(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸，检测方法是高效液相色谱法检测，具体步骤如下：(1)制备供试品溶液：取待测布瓦西坦，溶解，即得；(2)制备系统适用性溶液；(3)分别吸取供试品溶液和系统适用性溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相由a相和b相组成，a相为磷酸水溶液，b相为乙腈。进一步地，步骤(1)中，所述供试品溶液中，待测布瓦西坦的浓度为0.5～1.5mg/ml；和/或，步骤(1)中，所述溶解待测布瓦西坦的溶剂为乙腈和水的混合溶液；优选地，步骤(1)中，所述供试品溶液中，待测布瓦西坦的浓度为1.0mg/ml；和/或，步骤(1)中，所述乙腈和水的混合溶液中乙腈和水的体积比为(10～20)：(80～90)；更优选地，步骤(1)中，所述乙腈和水的混合溶液中乙腈和水的体积比为10:90。进一步地，步骤(2)中，所述系统适用性溶液的制备方法为利用乙腈和水的混合溶液溶解布瓦西坦对照品和水解杂质对照品，得混合溶液，即得。进一步地，步骤(2)中，所述系统适用性溶液中，布瓦西坦对照品浓度为0.5～1.5mg/ml，水解杂质对照品浓度为1～10μg/ml；和/或，步骤(2)中，所述乙腈和水的混合溶液中乙腈和水的体积比为(10～20)：(80～90)；优选地，步骤(2)中，所述系统适用性溶液中，布瓦西坦对照品浓度为1.0mg/ml，水解杂质对照品浓度为5μg/ml；和/或，步骤(2)中，所述乙腈和水的混合溶液中乙腈和水的体积比为10:90。进一步地，步骤(2)中，所述系统适用性溶液的制备方法为：称取水解杂质对照品，利用乙腈和水的混合溶液溶解得水解杂质储备液；再称取布瓦西坦对照品，加入水解杂质储备液和乙腈和水的混合溶液，即得。进一步地，所述高效液相色谱仪检测时，检测波长为200～220nm；和/或，流速为0.5～1.5ml/min；和/或，柱温为30～40℃；和/或，进样量为10～30μl；优选地，所述高效液相色谱仪检测时，检测波长为210nm；和/或，流速为1.0ml/min；和/或，柱温为30℃；和/或，进样量为10μl。进一步地，所述色谱柱为inertsilods-3；和/或，所述a相为体积分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液；所述b相为乙腈；优选地，所述色谱柱的规格为4.6×250mm，5μm；和/或，所述a相为体积分数为0.1％的磷酸水溶液。进一步地，所述高效液相色谱仪检测时，流动相洗脱程序为梯度洗脱程序，梯度洗脱程序为：0～30min，流动a相的体积百分数含量由65～75％下降到35～60％，流动b相的体积百分数含量由25～35％上升到40～65％；30～35min，流动a相的体积百分数含量保持为35～60％，流动b相的体积百分数含量保持为40～65％；35～36min，流动a相的体积百分数含量由35～60％上升到65～75％，流动b相的体积百分数含量由40～65％下降到25～35％；36～50min，流动a相的体积百分数含量保持为65～75％，流动b相的体积百分数含量保持为25～35％。进一步地，所述高效液相色谱仪检测时，梯度洗脱程序为：0～30min，流动a相的体积百分数含量由70％下降到40％，流动b相的体积百分数含量由30％上升到60％；30～35min，流动a相的体积百分数含量保持为40％，流动b相的体积百分数含量保持为60％；35～36min，流动a相的体积百分数含量由40％上升到70％，流动b相的体积百分数含量由60％下降到30％；36～50min，流动a相的体积百分数含量保持为70％，流动b相的体积百分数含量保持为30％。进一步地，所述方法为定量检测方法，含量的计算方法为：根据所得高效液相色谱谱图，计算供试品溶液中水解杂质的峰面积和供试品溶液中所有峰面积之和，以面积归一化法计算布瓦西坦水解杂质的含量，计算公式如下：其中，xi％为供试品中水解杂质的含量，ai为供试品溶液中水解杂质的峰面积，a为供试品溶液中所有峰面积之和。本发明所述的水解杂质为(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸。本发明布瓦西坦水解杂质的检测方法可以将布瓦西坦与其水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸有效分离，可以用于检测布瓦西坦中的该杂质，准确测量布瓦西坦药物中杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的含量，测定结果稳定可靠，专属性强。方法学验证结果表明，本发明符合《中国药典》2015年版对分析方法学的要求。本发明检测方法可有效监控布瓦西坦的合成过程，用于布瓦西坦的质量检测，保证其质量，应用前景广阔。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为实施例1中供试品溶液的hplc图。图2为实施例2中供试品溶液的hplc图。图3为布瓦西坦系统适用性溶液的hplc图。图4为空白溶液的hplc图。图5为水解杂质定位溶液的hplc图。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。(1)主要材料布瓦西坦样品：成都惟邦药业有限公司提供，批号200101，200201。布瓦西坦对照品：成都惟邦药业有限公司提供，批号190601。水解杂质对照品：成都惟邦药业有限公司提供，批号200401；水解杂质对照品为(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸对照品。(2)主要仪器高效液相色谱仪：岛津lc-20at；色谱柱：inertsilods-3，规格4.6×250mm，5μm。实施例1、布瓦西坦样品水解杂质的测定(1)供试品溶液的制备：精密称取布瓦西坦样品(批号200101)置于容量瓶中，加体积比10：90的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成1.0mg/ml的布瓦西坦供试品溶液。(2)系统适用性溶液的制备：精密称取水解杂质对照品，加体积比10：90的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成浓度为125μg/ml的溶液，作为水解杂质储备液。精密称取布瓦西坦对照品25mg于25ml容量瓶中，精密加入水解杂质储备液1.0ml，以体积比10：90的乙腈和水的混合溶液定容，即得系统适用性溶液，系统适用性溶液的hplc图如图3所示。(3)分别精密吸取供试品溶液和系统适用性溶液10μl注入色谱仪，记录色谱图，以面积归一化法按下列公式计算供试品溶液中水解杂质含量：ai：供试品溶液中水解杂质峰面积值为3381，a：供试品溶液中所有峰面积之和值为9944118，xi％＝0.034％，即批号200101的布瓦西坦样品中，水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的含量为0.034％。该供试品溶液的hplc图如图1所示。(4)色谱条件：色谱柱：inertsilods-3，规格4.6×250mm，5μm；流动相：流动相a：0.1％磷酸水溶液；流动相b：乙腈；检测波长：210nm；柱温箱：30℃；色谱柱流量：1ml/min，进样量10μl；梯度洗脱条件：时间(min)流动相b(％)流动相a(％)0.013070306040356040363070503070实施例2、布瓦西坦样品水解杂质的测定(1)供试品溶液的制备：精密称取布瓦西坦样品(批号200101)置于容量瓶中，加体积比10：90的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成1.0mg/ml的布瓦西坦供试品溶液。(2)系统适用性溶液的制备：精密称取水解杂质对照品，加体积比10：90的乙腈和水的混合溶液溶解，配制成浓度为125μg/ml的溶液，作为水解杂质储备液。精密称取布瓦西坦对照品25mg于25ml容量瓶中，精密加入水解杂质储备液1.0ml，以体积比10：90的乙腈和水的混合溶液定容，即得系统适用性溶液。(3)分别精密吸取供试品溶液和系统适用性溶液10μl注入色谱仪，记录色谱图，以面积归一化法按下列公式计算供试品溶液中水解杂质含量：ai：供试品溶液中水解杂质峰面积值为3292，a：供试品溶液中所有峰面积之和值为10183870，xi％＝0.032％，即批号200101的布瓦西坦样品中，水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的含量为0.032％。该供试品溶液的hplc图如图2所示。(4)色谱条件：色谱柱：inertsilods-3，规格4.6×250mm，5μm；流动相：流动相a：0.1％磷酸水溶液；流动相b：乙腈；检测波长：210nm；柱温箱：30℃；色谱柱流量：1ml/min，进样量10μl；梯度洗脱条件：时间(min)流动相b(％)流动相a(％)0.012872306040356040362872502872以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果：试验例1、系统适用性评价1、实验方法仪器及色谱条件：岛津lc-20at；色谱柱：inertsilods-3，规格为4.6×250mm，5μm；流速：1.0ml/min；色谱柱温度：30℃；进样量10μl；检测器波长：210nm；流动相a：0.1％磷酸水溶液，流动相b：乙腈；梯度洗脱条件如下：时间(min)流动相b(％)流动相a(％)0.013070306040356040363070503070溶液配制：(1)空白溶液(下述稀释液)为：将乙腈和水按照体积比10:90混合，得稀释液，图4为空白溶液的hplc图；(2)水解杂质储备液：精密称取水解杂质对照品12.5mg于100ml容量瓶中，稀释液溶解并定容，得水解杂质储备液，其中水解杂质对照品的浓度为125μg/ml；水解杂质对照品为(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸对照品；(3)系统适用性溶液：精密称取布瓦西坦对照品25mg于25ml容量瓶中，精密加入水解杂质储备液1.0ml，再加稀释液稀释定容，得系统适用性溶液(系统适用性溶液中布瓦西坦对照品浓度为1.0mg/ml，水解杂质对照品浓度为5μg/ml)；(4)水解杂质定位溶液：精密移取水解杂质储备液1.0ml于25ml容量瓶，加稀释液溶解定容，即得水解杂质定位溶液，其中水解杂质对照品的浓度为5μg/ml；图5为水解杂质定位溶液的hplc图；(5)供试品溶液：精密称取布瓦西坦样品(批号200101)25mg于25ml容量瓶中，加稀释液溶液定容，即得供试品溶液。检测：按上述色谱条件分别进样空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液，记录色谱过程，分离度结果见表1。2、实验结果表1.系统适用性评价结果实验结果说明：空白无干扰，系统适用性溶液分离度为13.62，分离度远大于2.0，符合中国药典2015年版的要求。该方法能够很好的分离布瓦西坦和其水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸。试验例2、专属性实验1、实验方法仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。检测：方法专属性考察峰鉴别和选择性，按上述色谱条件进样分别进样空白溶液，水解杂质定位溶液，记录色谱图，结果见表2。2、实验结果表2.专属性实验结果溶液名称物质名称溶液浓度保留时间水解杂质定位溶液水解杂质5μg/ml12.522实验结果说明：该检测方法无其他杂质干扰，可用于本发明水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸峰鉴别。试验例3、检测限和定量限测试1、实验方法仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。检测：检测限(lod)和定量限(loq)根据信噪比来确定。把已知浓度的水解杂质储备液稀释到低浓度进样，检测信噪比s/n≥10确定为定量限，s/n＝2～4确定为检测限。测试结果见表3。2、实验结果表3.水解杂质的定量限和检测限测试结果实验结果说明：水解杂质的定量限和检测限远小于0.1％，满足国际药典通用规定的要求(大于0.1％的杂质应该定量)，可用于布瓦西坦原料中对该水解杂质的定性和定量分析。试验例4、线性和范围测试1、实验方法仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。检测：对于水解杂质，在loq浓度至不低于150％指标浓度范围内取6个点进行研究，线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物(即水解杂质对照品)浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数r2来证实良好的线性关系，要求该线性回归系数r2应不小于0.990。对于主成分布瓦西坦的线性和范围，结果见表4～6。2、实验结果表4.水解杂质的线性与范围测试结果表5.布瓦西坦线性与范围测试结果表6.有关物质校正因子名称线性方程斜率校正因子主成分(即布瓦西坦)126041.00(主成分默认为1.00)水解杂质121401.04实验结果说明：水解杂质在0.2153μg/ml～3.234μg/ml范围内线性良好，测得水解杂质校正因子为1.04，在0.9～1.1的范围内，因此可用面积归一化法计算水解杂质的含量。试验例5、精密度测试1、实验方法仪器及条件和溶液配制方法均同试验例1。检测：取布瓦西坦样供试品溶液作为测试溶液，平行配制6份，按照上述条件依次进样，重复性结果见表7。中间精密度采用相同操作方法，由不同人员在不同仪器上进行，结果见表8。2、实验结果表7.重复性测试结果序列水解杂质10.03520.03230.03440.03450.03160.036rsd％5.53表8.中间精密度序列水解杂质10.03520.03230.03440.03450.03160.03610.03120.03430.03240.03550.03560.034rsd％4.99实验结果说明：水解杂质重复性和中间精密度rsd值小于10％，符合国际药典及中国药典的检测要求。试验例6、准确度测试1、实验方法仪器及条件和溶液配制方法均同试验例1。检测：准确度是通过在布瓦西坦供试品中加入水解杂质限度0.1％的80％，100％，120％三个不同浓度水解杂质，测定水解杂质的回收率所得。已知水解杂质的准确度是加入已知量的水解杂质，再测定加样样品中已知水解杂质的含量和理论值之间的比值(回收率)，以百分率％表达。未知有关物质是用布瓦西坦来代替的。结果见表9。表9.水解杂质回收率实验结果说明：水解杂质的回收率在99.71％～102.18％之间，平均回收率为：100.68％，准确度良好，符合国际药典和中国药典的要求。试验例1～6的研究结果表明，本发明一种测定布瓦西坦水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的方法具有很好的专属性，精密度良好，准确度高和灵敏度高，符合《中国药典》2015年版对分析方法学的要求，适用于布瓦西坦原料药合成中对水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的质量控制。综上，本发明布瓦西坦水解杂质的检测方法可以将布瓦西坦与其水解杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸有效分离，可以用于检测布瓦西坦中的该杂质，准确测量布瓦西坦药物中杂质(s)-2-((r)-2-氧代-4-丙基吡咯烷-1-基)丁酸的含量，测定结果稳定可靠，专属性强。方法学验证结果表明，本发明符合《中国药典》2015年版对分析方法学的要求。本发明检测方法可有效监控布瓦西坦的合成过程，用于布瓦西坦的质量检测，保证其质量，应用前景广阔。当前第1页12