一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法与流程

1.本发明涉及激素检测方法技术领域，尤其涉及一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法。


背景技术：

2.作为人体的八大系统之一，内分泌系统囊括了下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺、胰腺等腺体，它们通过分泌激素，影响人体的新陈代谢、生长发育、生殖衰老等生理活动，协调全身系统的机能水平，维持人体内环境的相对稳定性。正常情况下，各种激素保持相应的平衡。一旦这种平衡被打破，就可能引发各种不良反应，尤其是女性，症状更为明显。有数据显示，由于内分泌失调，28.2％的中青年女性出现面部黄褐斑、雀斑；27.5-31％的女性患子宫肌瘤等妇科疾病；而不孕不育人群中近10％-15％是内分泌失调导致的。类固醇激素又称甾体激素，是内分泌细胞分泌的高效能生物化学物质，在维持生命、调节机体物质代谢、促进性器官发育和维持生育等方面起着重要作用。类固醇激素是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核。它是在研究人体内分泌系统时发现的，具有多种药用价值。类固醇激素有很多种，按药理作用分为性激素和皮质激素，按化学结构分为雄甾烷类、雌甾烷类和孕甾烷类。临床上将类固醇激素水平作为较多疾病的诊断指标，包括先天性类固醇代谢紊乱和获得性类固醇代谢紊乱等，主要涉及到8个panel，包括肥胖组合、肾上腺皮质功能减退组合、原发性醛固酮增多症组合、库欣综合征组合、肾上腺增生组合、男性性功能减退组合、多囊卵巢综合征组合及地塞米松抑制实验组合，且一种疾病常伴有多种类固醇激素异常，如先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,cah)筛查时需要同时检测17-羟孕酮(17-oh-p)、雄烯二酮(a4)、肾上腺皮质醇(f)、11-脱氧皮质醇(s)和21-脱氧皮质醇(21-doc)等多种类固醇激素的水平。除此之外，外源性激素，如曲安奈德、曲安西龙、泼尼松、地塞米松、氟米龙、甲基泼尼松龙等在临床上作为抗炎类激素药物应用广泛，但这些药物的长期使用和过度使用会导致内分泌代谢混乱的临床表现，患者可能呈现库欣综合征的临床特征。目前，临床上大多采用液质联用法测定类固醇激素，但由于前处理方法及仪器局限，大多报道的方法很难准确测定人血清中类固醇激素含量，且大多分析时间长，测定品种少，不能涵盖多种内分泌激素代谢紊乱同时筛查诊断。文献报道内分泌激素测定方法，大多只测定少数几种内源性激素，而外源性激素测定方法仅测定地塞米松一种外源性激素，未见一种同时测定多种内源性激素及多种外源性激素的方法报道。因此，临床上急需一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法。


技术实现要素：

3.本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法，解决了现有技术中很难准确测定人血清中类固醇激素含量，且大多分析时间长，测定品种少，不能涵盖多种内分泌激素代谢紊乱同时筛查诊断的问题。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
5.一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法，包括以下步骤：
6.s1：向待测样品中加入内标物；
7.s2：向待测样品中加入蛋白沉淀剂；
8.s3：向待测样品中加入稀释溶剂；
9.s4：将处理后的待测样品高速离心；
10.s5：将上清液转移至hlb 96孔固相萃取板中；
11.s6：使用洗涤液洗涤上样后的hlb 96孔固相萃取板；
12.s7：使用洗脱液洗脱hlb 96孔固相萃取板；
13.s8：将洗脱液氮气吹干；
14.s9：向吹干后的洗脱液中加入复溶液，混匀；
15.s10：使用串联质谱测定分析物；
16.s11：根据对照品中测定物峰面积及内标峰面积制作标准曲线；
17.s12：将测定样品中分析物峰面积及内标峰面积带入标准曲线，计算结果。
18.优选的，所述s10中和s12中，分析物包括内源性激素及外源性激素；
19.其中内源性激素至少包括以下一种：醛固酮、可的松、皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、11-脱氧皮质酮、睾酮、脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、孕酮、孕烯醇酮、脱氢表雄酮硫酸酯、雌三醇、雌二醇、雌酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮等。
20.其中外源性激素至少包括以下一种：倍氯米松双丙酸酯、倍他米松、布地奈德、地塞米松、氟氢可的松、氟尼缩松、氟米龙、醋酸甲地孕酮、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、倍氯米松双丙酸酯、醋酸甲地孕酮、地塞米松醋酸酯、氟轻松醋酸酯、哈西奈德己酸羟孕酮、己烯雌酚、氢化可的松丁酸酯、炔诺孕酮等。
21.优选的，所述s10中和s12中，分析物还包括褪黑素。
22.优选的，所述s1中，内标物为所测定物质的氘代或13c取代的同位素内标，所使用的溶解内标溶剂为甲醇。
23.优选的，所述s2中，蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或乙醇，或者这三种以某种比例的混合溶液。
24.优选的，所述s3中，稀释溶剂为水，或含缓冲盐水溶液，缓冲盐指甲酸铵、乙酸铵、柠檬酸钠、抗坏血酸等。
25.优选的，所述s5、s6和s7中，hlb 96孔固相萃取板为亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂的固相萃取板，其规格为吸附剂重量：30mg、10mg、5mg、3mg或2mg。
26.优选的，所述s6中，洗涤液为甲醇、乙腈、水的混合溶液，其中甲醇、乙腈、水的比例为0-50：0-50：50-100。
27.优选的，所述s7中，洗脱液为乙腈。
28.优选的，所述s9中，复溶液为甲醇及水的混合溶液，其中甲醇与水的体积比为0-100：0-100。
29.优选的，色谱条件为：流动相a：氟化铵水溶液，其中氟化铵浓度为0.01mm-0.3mm；流动相b：甲醇及乙腈混合溶液，其中甲醇及乙腈的比例为0-100：0-100；色谱柱为c18色谱柱，色谱柱粒径范围为1.0μm-5.0μm之间，色谱柱内径为1.0mm-5.0mm之间，色谱柱长度为
50mm-200mm之间；柱温35-60℃；进样体积2μl-30μl。
30.优选的，质谱条件为：雾化器流量2-3l/min；干燥气流量5-15l/min；加热器流量5-15l/min；离子源温度200-500℃；加热器温度200-400℃；脱溶剂管温度150-300℃；碰撞气为氩气；扫描方式为mrm(多反应监测)。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
32.8分钟即可完成超过30种内源性激素及外源性激素同时测定的方法，该方法线性范围宽，分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可同时诊断多种激素代谢混乱的疾病。
附图说明
33.图1为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的醛固酮标准品谱图；
34.图2为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的可的松标准品谱图；
35.图3为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的皮质醇标准品谱图；
36.图4为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的21-脱氧皮质醇标准品谱图；
37.图5为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的11-脱氧皮质醇标准品谱图；
38.图6为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的雄烯二酮标准品谱图；
39.图7为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的11-脱氧皮质酮标准品谱图；
40.图8为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的睾酮标准品谱图；
41.图9为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的17α-羟孕酮标准品谱图；
42.图10为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的孕酮标准品谱图；
43.图11为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的孕烯醇酮标准品谱图；
44.图12为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的脱氢表雄酮硫酸酯标准品谱图；
45.图13为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的雌三醇标准品谱图；
46.图14为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的雌二醇标准品谱图；
47.图15为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的雌酮
标准品谱图；
48.图16为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的17-羟基孕烯醇酮标准品谱图；
49.图17为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的褪黑素标准品谱图；
50.图18为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的皮质酮标准品谱图；
51.图19为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的脱氢表雄酮标准品谱图；
52.图20为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的双氢睾酮标准品谱图；
53.图21为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的曲安西龙标准品谱图；
54.图22为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的泼尼松标准品谱图；
55.图23为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的泼尼松龙标准品谱图；
56.图24为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的地塞米松标准品谱图；
57.图25为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的氟米龙标准品谱图；
58.图26为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的甲基泼尼松龙标准品谱图；
59.图27为本发明提出的一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法的氟氢可的松准品谱图。
具体实施方式
60.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
61.参照图1-27，一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法，包括以下步骤：
62.s1：向待测样品中加入内标物；
63.s2：向待测样品中加入蛋白沉淀剂；
64.s3：向待测样品中加入稀释溶剂；
65.s4：将处理后的待测样品高速离心；
66.s5：将上清液转移至hlb 96孔固相萃取板中；
67.s6：使用洗涤液洗涤上样后的hlb 96孔固相萃取板；
68.s7：使用洗脱液洗脱hlb 96孔固相萃取板；
69.s8：将洗脱液氮气吹干；
70.s9：向吹干后的洗脱液中加入复溶液，混匀；
71.s10：使用串联质谱测定分析物；
72.s11：根据对照品中测定物峰面积及内标峰面积制作标准曲线；
73.s12：将测定样品中分析物峰面积及内标峰面积带入标准曲线，计算结果。
74.本发明中，所述s10中和s12中，分析物包括内源性激素及外源性激素；
75.其中内源性激素至少包括以下一种：醛固酮、可的松、皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、11-脱氧皮质酮、睾酮、脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、孕酮、孕烯醇酮、脱氢表雄酮硫酸酯、雌三醇、雌二醇、雌酮、17-羟基孕烯醇酮、18-羟基皮质酮等。
76.其中外源性激素至少包括以下一种：倍氯米松双丙酸酯、倍他米松、布地奈德、地塞米松、氟氢可的松、氟尼缩松、氟米龙、醋酸甲地孕酮、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、倍氯米松双丙酸酯、醋酸甲地孕酮、地塞米松醋酸酯、氟轻松醋酸酯、哈西奈德己酸羟孕酮、己烯雌酚、氢化可的松丁酸酯、炔诺孕酮等。
77.本发明中，所述s10中和s12中，分析物还包括褪黑素。
78.本发明中，所述s1中，内标物为所测定物质的氘代或13c取代的同位素内标，所使用的溶解内标溶剂为甲醇。
79.本发明中，所述s2中，蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或乙醇，或者这三种以某种比例的混合溶液。
80.本发明中，所述s3中，稀释溶剂为水，或含缓冲盐水溶液，缓冲盐指甲酸铵、乙酸铵、柠檬酸钠、抗坏血酸等。
81.本发明中，所述s5、s6和s7中，hlb 96孔固相萃取板为亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂的固相萃取板，其规格为吸附剂重量：30mg、10mg、5mg、3mg或2mg。
82.本发明中，所述s6中，洗涤液为甲醇、乙腈、水的混合溶液，其中甲醇、乙腈、水的比例为0-50：0-50：50-100。
83.本发明中，所述s7中，洗脱液为乙腈。
84.本发明中，所述s9中，复溶液为甲醇及水的混合溶液，其中甲醇与水的体积比为0-100：0-100。
85.本发明中，色谱条件为：流动相a：氟化铵水溶液，其中氟化铵浓度为0.01mm-0.3mm；流动相b：甲醇及乙腈混合溶液，其中甲醇及乙腈的比例为0-100：0-100；色谱柱为c18色谱柱，色谱柱粒径范围为1.0μm-5.0μm之间，色谱柱内径为1.0mm-5.0mm之间，色谱柱长度为50mm-200mm之间；柱温35-60℃；进样体积2μl-30μl。
86.本发明中，质谱条件为：雾化器流量2-3l/min；干燥气流量5-15l/min；加热器流量5-15l/min；离子源温度200-500℃；加热器温度200-400℃；脱溶剂管温度150-300℃；碰撞气为氩气；扫描方式为mrm(多反应监测)。
87.本发明所使用的仪器包括：lcms-8050 cl液质联用仪(日本，岛津)，医用高速离心机(美国，贝克曼)，超纯水仪(德国，密理博)，涡旋混合仪(德国，艾本德)，移液器(德国，艾本德),正压装置(美国，拜泰齐)。
88.本发明所使用的试剂耗材包括：甲醇(美国，霍尼韦尔)，乙腈(美国，霍尼韦尔)，水(美国，霍尼韦尔)，氟化铵(德国，sigma)，正己烷(德国，默克)，hlb96孔固相萃取板(日本，sglc)，96孔接收板(1ml，艾本德)，色谱柱：shim-pack velox sp-c18(50mm
×
2.1mm i.d.,
1.8μm)。
89.本发明所使用标准品包括：醛固酮、可的松、皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、11-脱氧皮质酮、睾酮、脱氢表雄酮、17α-羟孕酮、双氢睾酮、孕酮、孕烯醇酮、脱氢表雄酮硫酸酯、雌三醇、雌二醇、雌酮、17-羟基孕烯醇酮、地塞米松、氟氢可的松、氟米龙、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、褪黑素，均购自sigma公司。
90.本发明所使用同位素内标包括：褪黑素-d3、醛固酮-d7、可的松-d7、皮质醇-d4、地塞米松-d6、皮质酮-d8、11-脱氧皮质醇-d5、雄烯二酮-d3、11-脱氧皮质酮-d8、脱氢表雄酮-d4、17α-羟孕酮-d3、孕酮-d3、孕烯醇酮-d4、脱氢表雄酮硫酸钠-d4、雌三醇-d3、雌二醇-d3、雌酮-d4、睾酮-d3，均购自sglc公司。
91.一种内分泌代谢紊乱的辅助筛查诊断方法，包括以下步骤：
92.1、标准溶液制备：取27种激素混标母液，用甲醇稀释成相应浓度混标中间液，再用纯水稀释成系列浓度的标准工作液。内标溶液使用甲醇配置成内标工作液。取250μl标准工作液，加入10μl内标溶液，涡旋混匀，加入250μl甲醇，涡旋混匀，加入250μl水，涡旋混匀，具体标准溶液浓度见表2。
93.2、样品溶液制备：取250μl血浆样本，加入10μl内标溶液，涡旋混匀，加入250μl甲醇，涡旋混匀，加入250μl水，涡旋混匀后，13000rpm高速离心5min，具体内标溶液浓度见表3。
94.3、标准品及样品净化：取标准品溶液及样品上清液600μl至hlb型96孔固相萃取板中(固相萃取板使用前经200μl乙腈及200μl甲醇活化，再经200μl纯化水平衡两次)，下接废液收集板，弃去废液，使用200μl5％甲醇洗涤固相萃取板2次，弃去废液，再使用200μl正己烷洗涤固相萃取板1次，弃去废液，将接收板改为全新96孔接收板，使用50μl乙腈洗脱固相萃取板两次，将收集液氮气吹干，加50μl初始流动相复溶，振摇混匀后上机测定。
95.4、仪器测定：
96.液相色谱条件
[0097][0098]
表1：梯度洗脱时间程序
[0099][0100]
质谱条件：
[0101][0102][0103]
表2：mrm参数
[0104]
[0105][0106]
分析物谱图如图1-图27所示，所测定的27中物质选择性及分离度良好。
[0107]
用本方法8min内即可完成27种激素测定，包括20中内源性激素及7种外源性激素。
[0108]
5、定量计算：
[0109]
对浓度l1-l10的混合标准液进行前处理并测定，内标法制作标准曲线；标准曲线结果见表3，27种激素在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.994，准确度在87.3％～114.1％之间，满足测定需求。
[0110]
表3：标准曲线结果
[0111]
[0112][0113]
将待测样本的分析物峰面积及内标峰面积带入标准曲线，所测分析含量见下表4；
[0114]
表4：临床样品测定结果(ng/ml)
[0115][0116]
6、精密度测定结果
[0117]
取混合对照品溶液，连续进样6针，考察仪器精密度，具体测定浓度及峰面积精密度见表5，结果显示，27种激素在测定浓度下峰面积精密度在1.1％-8.9％之间，lcms-8050 cl测定27种激素精密度良好。
[0118]
表5：精密度实验结果(n＝6,ng/ml)
[0119][0120]
7、准确度测定结果
[0121]
按前述前处理方法对空白血浆添加低高浓度标准品作为低高浓度质控品，按分析条件对质控品进行分析，每个样品平行制备3份，质控品的准确度结果如表6所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，均在81.2％-116.6％之间，满足临床测定需求。样品平行制备3份进样分析，测定结果rsd在0.5％-9.5％之间，满足临床测定需求。
[0122]
表6：质控准确度考察结果(n＝3)
[0123]
[0124]
[0125][0126]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。