测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及医用诊断试剂领域，特别是涉及一种采用磁微粒化学发光技术和抗原-抗体结合技术检测人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。


背景技术：

[0002]
高尔基体蛋白(gp73)是一种包括400个氨基酸残基的跨膜高尔基体糖蛋白，定位9q21.33染色体基因组，亦称为golm1或golph2。gp73由膜内、膜外的c-端及疏水n-3组成，跨膜结构完整。gp73在正常人中仅在胆囊上皮细胞中表达，在肝细胞中几乎不表达，但在胆管上皮细胞中有较高的表达水平。当肝脏炎症时，肝细胞gp73水平升高，肝癌细胞的gp73表达水平会明显升高。相关资料显示gp73的调节机制可能主要存在于两个过程中：一方面在肝脏慢性疾病发生、发展过程中出现；另一方面可能与肝细胞的急性损伤具有密切联系。研究表明，肝硬化、肝癌以及慢性肝炎患者的血清gp73水平均会发生一定程度的升高，且随着肝脏损伤程度的加深gp73的表达率逐渐升高，这表明gp73的表达强弱对肝脏损伤的程度具有提示作用。
[0003]
当肝细胞受损或胆汁郁滞时，肝脏对高尔基体蛋白的摄取和排泄会发生异常，从而引发高尔基体蛋白代谢和循环紊乱，导致血液中的高尔基体蛋白含量升高。此外，高尔基体蛋白浓度的高低与肝细胞损害程度即胆汁酸代谢障碍程度直接相关。
[0004]
用于肝癌、肝硬化的辅助诊断，可协同afp项目对肝癌进行诊断检测，gp73对肝癌有着较高的灵敏度和特异性。
[0005]
原发性肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，癌细胞具有极强的增殖、侵袭、上皮间质转化活力且病灶局部的血管新生活力十分旺盛,容易早期发生血行转移并影响疾病的预后.在临床实践中，早期诊断肝癌并评估癌细胞血管新生、上皮间质转化的活力能够为治疗方案的制定提供依据[7]。肝癌作为癌症的第三大死亡原因，自然生存期不超过3-6个月。据统计，在我国人群中肝癌的年发病率高达37.6/10万。进展速度快、恶性程度高、预后差是导致肝癌致死率高的主要原因。
[0006]
目前已知的高尔基体蛋白检测方法主要有上转发光法、酶联免疫吸附法(基于纳米金探针)、磁微粒化学发光免疫法(辣根过氧化物酶系统)。但是，这些方法都存在一定的缺陷，上转发光法稀土元素的有限性、酶联免疫吸附法自动化程度低且操作复杂繁琐，辣根过氧化物酶系统的磁微粒化学发光免疫法试剂的稳定性有待提高。
[0007]
因此，目前尚需一种灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的高尔基体蛋白检测试剂盒和使用方法。


技术实现要素：

[0008]
本发明旨在开发一种灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好并且成本低廉的一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。
[0009]
基于上述目的，本发明提供一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检
测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；r1试剂为异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体稀释液，r2试剂为碱性磷酸酶标记的抗高尔基体蛋白多克隆抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒稀释剂，校准品液系列为含有不同浓度高尔基体蛋白抗原的稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液。
[0010]
另一方案，所述r1试剂即异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体稀释液是浓度为0.3～0.6μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体经缓冲液稀释配成。
[0011]
另一方案，所述r1试剂缓冲液ph值为6.7～7.6，缓冲液包括tris，浓度为12.0～12.3g/l；叠氮钠，浓度为0.98～1.02g/l；氯化钠，浓度为5.7～5.9g/l，牛血清白蛋白，浓度为9～10g/l；8苯胺-1-萘磺酸铵盐，浓度为0.98～0.99g/l；其余为去离子水。
[0012]
另一方案，所述r1试剂即异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体稀释液是浓度为0.5μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体经缓冲液稀释配成。
[0013]
另一方案，所述r1试剂缓冲液ph值为7.0，缓冲液包括tris，浓度为12.04g/l；叠氮钠，浓度为0.987g/l；氯化钠，浓度为5.79g/l，牛血清白蛋白，浓度为9.86g/l；8-苯胺-1-萘磺酸铵盐，浓度为0.986g/l；其余为去离子水。
[0014]
另一方案，所述r2试剂即碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体稀释液是由浓度为0.3～0.6μg/ml碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体经缓冲液稀释而成。
[0015]
另一方案，所述r2试剂缓冲液为ph值为6.7～7.6，优选为商品化的ap conjugate stabilizer。
[0016]
另一方案，所述r2试剂即碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体稀释液是由浓度为0.5μg/ml碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体经缓冲液稀释而成。
[0017]
另一方案，所述r2试剂缓冲液为ph值为6.8。
[0018]
另一方案，所述磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒悬浮于缓冲液配制成浓度为0.5～2mg/ml的磁微粒溶液。
[0019]
另一方案，所述抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被磁微粒的制备步骤包括，反应缓冲液选用摩尔浓度0.1～0.2m的mes，ph4.5～5.5，活化剂为200～300mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)和200～250mm的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)双活化剂活化交联，清洗缓冲液为摩尔浓度为0.05～0.15m的pbs+0.1～0.5％tween20。
[0020]
另一方案，所述磁分离试剂缓冲液为ph值为7.5～9.0，缓冲液组分为包括tris，浓度为10.5～11.3g/l；叠氮钠，浓度为1.91～1.95g/l；氯化钠，浓度为5.5～5.7g/l；摩尔浓度为1m的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1m的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为4.7～4.9g/l；特级马血清，浓度为4.8～5.0g/l，其余组分为去离子水。
[0021]
另一方案，所述磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒悬浮于缓冲液配制成浓度为1.0mg/ml的磁微粒溶液。
[0022]
另一方案，所述磁分离试剂缓冲液为ph值为8.0，缓冲液组分为包括tris，浓度为11.08g/l；叠氮钠，浓度为1.917g/l；氯化钠，浓度为5.56g/l；摩尔浓度为1.0m的氯化镁溶
液；摩尔浓度为0.1m的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为4.81g/l；特级马血清，浓度为4.91g/l，其余组分为去离子水。
[0023]
另一方案，所述校准品液系列为含有不同浓度高尔基体蛋白抗原的胎牛血清稀释液。
[0024]
另一方案，所述校准品液系列的缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.5g/l；硫酸庆大霉素，浓度为0.16g/l。
[0025]
另一方案，所述校准品液系列，浓度范围为0～1000ng/ml，缓冲液ph值为7.6。
[0026]
另一方案，所述校准品液系列的不同浓度为0ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml。校准品液系列的不同浓度设置会使曲线形状会发生改变，进而影响临床样本的检测结果。
[0027]
另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度0.1～0.3m的碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，ph值为8～10的摩尔浓度0.2m的tris-hcl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/ml的二氧杂环乙烷化合物(apcl)。
[0028]
另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度为0.2m，ph值为9.3的摩尔浓度0.2m的tris-hcl缓冲液，并含有0.3mg/ml的二氧杂环乙烷化合物(apcl)。
[0029]
一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0030]
配制试剂r1：1)按照试剂r1缓冲液组分含量配制缓冲液，调节ph；2)制备异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体；3)将异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体用r1缓冲液进行稀释。
[0031]
配制试剂r2：1)按照试剂r2缓冲液组分含量配制缓冲液，调节ph；2)制备碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体；3)将碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体用r2缓冲液进行稀释。
[0032]
配制磁微粒：1)制备抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒；2)按照磁微粒缓冲液组分含量配制缓冲液；3)将磁微粒用制备好的缓冲液进行稀释，得到浓度为0.5～2mg/ml的磁微粒溶液。
[0033]
配制校准品：1)按照校准品缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将高尔基体蛋白抗原溶解于校准品缓冲液中配制成不同的浓度。
[0034]
配制化学发光底物液：1)配制0.2m，ph值为9.3的tris-hcl缓冲液，并添加0.3mg/ml的二氧杂环乙烷；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。
[0035]
一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒使用方法包括如下步骤：
[0036]
(1)将待测样本或校准品、试剂r1、试剂r2 37℃混合温育10min；
[0037]
(2)将磁分离试剂加入上述反应体系后于37℃继续温育10min；
[0038]
(3)洗涤，去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物；
[0039]
(4)加入发光底物，alp催化底物发光后测定相对发光强度(rlu)；
[0040]
在一定范围内rlu与高尔基体蛋白抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的高尔基体蛋白含量。
[0041]
采用本发明上述检测试剂盒测定人体高尔基体蛋白含量时的方法学鉴定数据可
达到如下指标：
[0042]
灵敏度－最小检出量为5ng/ml；
[0043]
高尔基体蛋白线性检测范围，0～1000ng/ml；
[0044]
精密度－分析内精密度平均为4.17％(n＝10)，分析间精密度平均为6.06％(n＝10)，精密度远低于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；
[0045]
准确度－将已知高尔基体蛋白浓度的血清采用去激素血清经不同比例稀释后回收率为95％～105％；
[0046]
特异性－与甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白异质体(afp-l3)的交叉反应率均小于0.1％。
[0047]
上述步骤表明，本发明采用的夹心法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清样品中的高尔基体蛋白含量，确保了检测的灵敏度(磁微粒发光法)，及高度的特异性(免疫分离技术)、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。
[0048]
本发明的特点在于：(1)在r1试剂稀释液中添加了8苯胺-1-萘磺酸铵盐增加了反应体系中蛋白的指示作用，提高了检测的精度；(2)r1中使用单克隆抗体，r2中使用多克隆抗体，选择校准品液中特定组成的高尔基体蛋白抗原实现其与抗体的特异性结合，既保证了捕获高尔基体蛋白的特异形结合，又避免了信号转换过程中的漏检现象；(3)同种标志物的检测试剂中使用碱性磷酸酶标记方法改善了试剂盒的稳定性。本发明在针对人体高尔基体蛋白检测时选择特定的r1试剂及r2试剂包括浓度参数、反应时间及试剂、样本加样量等，通过磁微粒免疫分离技术能够实现高灵敏度、线性范围更宽的检测效果，为临床检测人血清中的高尔基体蛋白提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
[0049]
本发明极大地提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号。
附图说明
[0050]
图1为本发明实施例2试剂盒中高尔基体蛋白的浓度－发光值曲线图；
具体实施方式
[0051]
测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的组成
[0052]
一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒包括r1试剂、r2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液。
[0053]
r1试剂包括：1)r1抗体：异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体，浓度为0.3～0.6μg/ml；2)缓冲液：包括tris，浓度为12.0～12.3g/l；叠氮钠，浓度为0.98～1.02g/l；氯化钠，浓度为5.7～5.9g/l，牛血清白蛋白，浓度为9～10g/l；8苯胺-1-萘磺酸铵盐，浓度为0.98～0.99g/l；其余为去离子水。r1试剂的缓冲液ph值为6.7～7.6。
[0054]
r2试剂包括：1)r2抗体：碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体，浓度为0.3～0.6μg/ml；2)缓冲液：优选为商品化的ap conjugate stabilizer。r2试剂的缓冲液ph值为6.7～7.6。
[0055]
磁分离试剂包括：1)磁微粒：抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被磁微粒的浓溶液，
反应缓冲液选用摩尔浓度0.1～0.2m的mes，ph4.5～5.5，活化剂为200～300mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)和200～250mm的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)双活化剂活化交联，清洗缓冲液为摩尔浓度为0.05～0.15m的pbs+0.1～0.5％tween20，获得抗异硫氰酸荧光素(fitc)单克隆抗体包被的磁微粒；2)缓冲液：包括tris，浓度为10.5～11.3g/l；叠氮钠，浓度为1.91～1.95g/l；氯化钠，浓度为5.5～5.7g/l；摩尔浓度为1m的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1m的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为4.7～4.9g/l；特级马血清，浓度为4.8～5.0g/l，其余组分为去离子水。磁分离试剂的缓冲液ph值为7.5～9.0；3)用缓冲液将磁微粒稀释到浓度为0.5～2mg/ml，获得磁分离试剂。
[0056]
校准品液系列包括：1)高尔基体蛋白抗原的胎牛血清；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.5g/l；硫酸庆大霉素，浓度为0.16g/l。校准品液系列的缓冲液ph值为7.6。校准品液系列为含有不同浓度(0，20，50，200，500，1000ng/ml)的试剂系列。
[0057]
底物液为摩尔浓度0.1～0.3m碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(apcl)的浓度为0.2～0.4mg/ml，缓冲液为摩尔浓度为0.2m的tris-hcl，ph值为8～10。
[0058]
一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0059]
配制试剂r1：1)按照试剂r1缓冲液组分含量配制缓冲液，调节ph；2)制备异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体；3)将异硫氰酸荧光素标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体用r1缓冲液进行稀释。
[0060]
配制试剂r2：1)按照试剂r2缓冲液组分含量配制缓冲液，调节ph；2)制备碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体；3)将碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体用r2缓冲液进行稀释。
[0061]
配制磁分离试剂：1)制备抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒；2)按照磁微粒缓冲液组分含量配制缓冲液；3)将磁微粒用制备好的缓冲液进行稀释，得到浓度为0.5～2mg/ml的磁微粒溶液，即磁分离试剂。
[0062]
配制校准品液系列：1)按照校准品缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将不同浓度的高尔基体蛋白抗原分别溶解于校准品缓冲液中配制成不同浓度的校准品液。
[0063]
配制化学发光底物液：1)配制tris-hcl缓冲液，并添加二氧杂环乙烷化合物(apcl)；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。
[0064]
人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的测定方法和绘制标准曲线
[0065]
(1)首先，将20μl的校准品系列(浓度分别为0，20，50，200，500，1000ng/ml)分别与50μl试剂r1、50μl试剂r2依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
[0066]
(2)将上述试剂系列分别再与25μl磁分离试剂结合后于37℃继续温育10min；
[0067]
(3)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；
[0068]
(4)加入发光底物液150μl，alp催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(rlu)，获得高尔基体蛋白浓度-发光值系列数值。
[0069]
(5)根据高尔基体蛋白浓度-发光值系列数值进行拟合，获得高尔基体蛋白浓度-发光值标准曲线。
[0070]
(6)根据拟合的高尔基体蛋白浓度-发光值标准曲线计算测定待测样本的浓度值。
[0071]
在一定范围内rlu与高尔基体蛋白抗原浓度呈反比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的高尔基体蛋白含量。
[0072]
采用本发明上述检测试剂盒测定人体高尔基体蛋白含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：
[0073]
灵敏度，最小检出量为5ng/ml；
[0074]
高尔基体蛋白含量的线性检测范围为0～1000ng/ml；
[0075]
精密度，分析内精密度平均为4.17％(n＝10)，分析间精密度平均为6.06％(n＝10)，精密度远低于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；
[0076]
准确度，将已知高尔基体蛋白浓度的血清采用去激素血清经不同比例稀释后回收率为95％～105％；
[0077]
特异性，与甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、甲胎蛋白异质体(afp-l3)交叉反应率均小于0.1％。
[0078]
上述步骤表明，本发明采用的夹心法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清样品中的高尔基体蛋白含量，确保了检测的灵敏度(磁微粒发光法)，及高度的特异性(免疫分离技术)、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的高尔基体蛋白提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。
[0079]
实施例1一种测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒包括r1试剂、r2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和底物液。
[0080]
本实施例中，r1试剂包括：1)r1单克隆抗体：异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗高尔基体蛋白单克隆抗体，浓度为0.5μg/ml；2)缓冲液：tris，浓度为12.04g/l；叠氮钠，浓度为0.987g/l；氯化钠，浓度为5.79g/l，牛血清白蛋白，浓度为9.86g/l；8-苯胺-1-萘磺酸铵盐，浓度为0.986g/l；其余为去离子水。r1试剂的缓冲液ph值优选为7.0。
[0081]
本实施例中，r2试剂包括：1)r2多克隆抗体：碱性磷酸酶标记的高尔基体蛋白多克隆抗体，浓度为0.5μg/ml；2)缓冲液：为商品化的ap conjugate stabilizer。r2试剂的缓冲液ph值为6.8。
[0082]
本实施例中，磁分离试剂包括：1)抗异硫氰酸荧光素(fitc)单克隆抗体包被：反应缓冲液选用摩尔浓度0.m的mes，ph4.7，活化剂为摩尔浓度200mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)和摩尔浓度250mm的n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)双活化剂活化交联，清洗缓冲液为摩尔浓度为0.10m的pbs+0.2％tween20。2)磁微粒：抗异硫氰酸荧光素(fitc)单克隆抗体包被的磁微粒，稀释浓度为1mg/ml；2)缓冲液：tris，浓度为11.08g/l；叠氮钠，浓度为1.917g/l；氯化钠，浓度为5.56g/l；摩尔浓度为1m的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1m的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为4.81g/l；特级马血清，浓度为4.91g/l，其余组分为去离子水。磁分离试剂的缓冲液ph值为8.0。
[0083]
本实施例中，校准品液系列包括：1)高尔基体蛋白抗原的胎牛血清；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.5g/l；硫酸庆大霉素，浓度为0.16g/l。校准品液系列的缓冲液ph值为7.6。校准品系列为含有不同浓度(0，20，50，200，500，1000ng/ml)实际系列。
[0084]
本实施例中，底物液为碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液
中二氧杂环乙烷化合物(apcl)的浓度为0.3mg/ml，缓冲液为摩尔浓度为0.2m的tris-hcl，ph值为9.3。
[0085]
实施例2测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备和测定方法
[0086]
(1)首先，将实施例1的20μl的校准品系列(浓度分别为0，20，50，200，500，1000ng/ml)分别与实施例1的50μl试剂r1、50μl试剂r2依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
[0087]
(2)将上述试剂系列分别再与实施例1的25μl磁分离试剂结合后于37℃继续温育10min；
[0088]
(3)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；
[0089]
(4)加入实施例1的发光底物液150μl，alp催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(rlu)，结果如下表所示：
[0090]
表1
[0091]
校准品(ng/ml)020502005001000rlu(100000)0.0170.8112.0278.10820.51940.540
[0092]
(5)根据表1的数值进行拟合，获得图1所示的高尔基体蛋白浓度-发光值标准曲线。
[0093]
(6)将20μl的待测样品与实施例1的50μl试剂r1、50μl试剂r2依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
[0094]
(7)将上述试剂再与实施例1的25μl磁分离试剂结合后于37℃继续温育10min；
[0095]
(8)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；
[0096]
(9)加入实施例1的发光底物液150μl，alp催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度rlu为200000；
[0097]
(10)根据步骤(5)的高尔基体蛋白浓度-发光值标准曲线计算待测样品200000对应的高尔基体蛋白浓度值为50ng/ml，优化为肝脏开始出现纤维化的医学决定水平附近；
[0098]
(11)步骤(1)和步骤(2)中的反应物比例为20(校准品):50(试剂r1):50(试剂r2):25(磁分离试剂)(单位，μl)，反应最佳时间为10min免疫结合，10min固相捕获。
[0099]
本发明提供的人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
[0100]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0101]
本发明未述及之处适用于现有技术。