一种甲状腺球蛋白的磁微粒分离化学发光免疫检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测分析技术领域，设及到食品安全相关的免疫分析检测技术， 尤其设及一种甲状腺球蛋白的磁微粒分离化学发光免疫检测方法，适用于人血清和血浆中 的甲状腺球蛋白的定量检测。
【背景技术】
[0002]甲状腺球蛋白灯hyroglobulin，Tg)，是甲状腺滤泡上皮分泌的660ku糖蛋白，每 个Tg约有2个甲状腺素灯4)和0.5个Ξ舰甲腺原氨酸灯3)分子，储存在滤泡腔中。溶酶 体水解Tg表面T4、T3并使之释放入血，同时少量的Tg也释放入血，部分Tg经甲状腺淋己 管分泌入血。血循环中的Tg被肝脏的巨隧细胞清除。刺激Tg的分泌因素包括促甲状腺素 (TSH)和膜岛素样生长因子-l(IGF-l);抑制因子是丫-干扰素、α-肿瘤坏死因子和维甲 酸。
[0003] 甲状腺球蛋白（TG)是分化型甲状腺癌值TC)的标志物。定期随访血清TG有助于 对DTC复发和转移的诊断、评价，W及监测病人预后的治疗效果。其它的良性甲状腺病，如 甲亢、甲状腺囊肿、桥本氏病等由于甲状腺滤泡的破坏，致使其中胶质内的TG亦进入到血 循环中，使血清TG水平增高。在先天性甲状腺功能低下患者中，检测甲状腺球蛋白可鉴别 甲状腺完全缺失、甲状腺发育不全或其他病理状况。另一方面，甲状腺滤泡壁的损伤可导致 大量的甲状腺球蛋白进入血液，因此，甲状腺球蛋白也被认为是甲状腺体形态完整性的特 殊标志物。甲状腺球蛋白测定也可用于鉴别亚急性甲状腺炎和假的甲状腺毒症。
[0004] 目前测量TG的方法主要有放射免疫分析法巧ΙΑ)和免疫量度分析法（ΙΜΑ)两大 类。ΙΜΑ包括免疫放射量度分析法（IRMA)、巧光免疫分析法（FIA)、发光免疫分析法（CLIA)、 电化学发光免疫分析法巧化IA)等。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种甲状腺球蛋白定量检测试剂盒。
[0006] 本发明提供的试剂盒，为1)或2):
[0007] 1)包括异硫氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和碱性憐酸酶标记 的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液；
[0008] 所述异硫氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和所述碱性憐酸酶标 记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液的溶剂均为抗试剂缓冲液；
[0009] 所述抗试剂缓冲液按照如下方法制备：将溶液A、牛血清、马血清、羊血清、防腐剂 混匀得到抗试剂缓冲液；
[0010] 所述溶液A由化\Mg2\Zn2\Trizmabase、动物血清白蛋白和水组成；
[0011]2)包括所述异硫氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体、所述碱性憐酸酶标 记的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液。
[001引上述试剂盒中，
[0013] 所述动物血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述防腐剂为ProcLin-300 ;
[0014] 所述溶液A、所述牛血清、所述马血清、所述羊血清、所述ProcLin-300的配比为 lOOOg：23-28ml：1. 5-2. 5ml：4. 〇-5. 0ml：0. 5-2. 0ml；
[001引所述溶液A中，所述化+浓度为0. 1-lmol/L，所述Mg2+的浓度为Immol/L，所述化2+ 的浓度为O.lmmol/L所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.2-1. 0%，所述化izmabase 浓度为 0.01-0. 5mol/L。
[0016] 上述试剂盒中，
[0017] 所述抗试剂缓冲液中，所述溶液A、牛血清、马血清、羊血清、ProcLin-300和水的 配比为lOOOg:25ml:2ml:4. 5ml:1. 0ml;
[0018]所述溶液A中，所述化+源于化Cl，所述化Cl浓度为0.Imol/L;
[001引 所述1邑2+源于MgCl2,所述MgClz浓度为1.Ommol/L;
[0020] 所述化2+源于化化2,所述化化2浓度为0.Immol/L;
[0021] 所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5% ;
[0022] 所述Trizmabase的浓度为 0.Imol/L。
[0023] 上述试剂盒中，
[0024] 所述异硫氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液由异硫氯酸巧光素标 记的甲状腺球蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述异硫氯酸巧光素标记的甲状 腺球蛋白单克隆抗体的浓度为0. 1-0. 5μg/mL;
[00巧]所述碱性憐酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液由碱性憐酸酶标记甲状腺球 蛋白单克隆抗体和所述抗试剂缓冲液组成，所述碱性憐酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体 的浓度为0. 5-1μg/mL;
[0026] 所述异硫氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体中的甲状腺球蛋白单克隆 抗体和所述碱性憐酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体中甲状腺球蛋白单克隆抗体不同。
[0027] 上述试剂盒还包括磁分离试剂；
[0028] 所述磁分离试剂为将抗异硫氯酸巧光素抗体共价连接在磁珠表面，得到磁分离试 剂；
[0029] 所述抗异硫氯酸巧光素抗体为多克隆抗体；
[0030] 所述抗异硫氯酸巧光素抗体和所述磁微粒的配比为30μg-200μg:lmg;
[0031] 所述磁微粒的直径为0. 5-1. 5μm。
[0032] 上述试剂盒还包括校准品；
[0033] 所述校准品由η个不同浓度的校准品溶液组成，所述校准品溶液由甲状腺球蛋白 抗原和校准品缓冲液组成，且所述甲状腺球蛋白抗原在所述校准品中为不同浓度；
[0034] 所述校准品缓冲液由化\蛋白类保护剂、防腐剂、Trizmabase、动物血清和水组 成，所述化+浓度为0.l-lmol/l，所述蛋白类保护剂的质量百分含量为0. 2-1. 0%，所述防 腐剂体积百分含量为0. 05-0. 2%，所述Trizmabase浓度为0. 01-0. 5mol/L所述动物血清 的体积百分含量为0. 05-1. 0%。
[0035] 上述试剂盒中，
[0036] 所述化+源于化C1，所述化C1浓度为0.lOmol/L;
[0037] 所述蛋白类保护剂为牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白质量百分含量为0. 5 % ;
[0038] 所述防腐剂为P;roclin-300,所述P;roclin-300体积百分含量为0. 1 % ;
[0039] 所述Trizmabase的浓度为 0.Imol/L;
[0040] 所述动物血清为羊血清，所述羊血清体积百分含量为0. 2%。
[0041] 上述试剂盒中，
[0042] 所述校准品由η个不同浓度的校准品溶液组成，η小于等于6 ;所述校准品为浓度 为0、10ng/mL50ng/mL150ng/血、300ng/mL750ng/血甲状腺球蛋白抗原溶液。
[0043] 所述试剂盒还包括质控品、样本稀释液、清洗液和底物溶液；
[0044] 所述质控品为2个不同浓度的校准品；所述质控品为浓度为lOng/mL和30化g/mL 的校准品。
[0045] 所述清洗液由吐溫-20、氯化钢和浓度为0. 15M、抑为8. 0 + 0. 05的Tris-HCl缓冲 液组成，其中，所述吐溫-20的体积百分含量为0. 04%，所述氯化钢的浓度为0. 25mol/L;
[0046] 所述底物溶液由二氨日丫晚和浓度为0. 25M、抑为8. 0 + 0. 05的Tris-HCl缓冲液组 成，其中，所述二氨日丫晚终浓度为0. 25mg/mL;
[0047] 所述样本稀释液由牛血清白蛋白、trizmabase和水组成，其中，所述牛血清白蛋 白的质量百分含量为0. 2% -5%，所述trizmabase的浓度为0.Imol/L。
[004引本发明的另一个目的是提供一种制备上述的试剂盒的方法。
[0049] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述试剂盒中8种组分均独立包装；再整体 包装为试剂盒。
[0050] 上述的试剂盒在甲状腺球蛋白定量检测中的应用也是本发明保护的范围；
[0051] 或上述的试剂盒在制备甲状腺球蛋白定量检测产品中的应用也是本发明保护的 范围；
[0052] 或上述的试剂盒中8种组分在制备甲状腺球蛋白定量检测产品中的应用也是本 发明保护的范围；
[0053] 或一种待测样本中甲状腺球蛋白定量检测方法，包括如下步骤：
[0054] 1)将上述的试剂盒中的校准品、质控品和待测样本分别与上述的试剂盒中的异硫 氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体溶液和碱性憐酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆 抗体溶液混匀，反应，得到免疫反应产物；
[0055] 2)将所述免疫反应产物与上述的试剂盒中的磁分离试剂混匀，反应，得到反应产 物，将所述反应产物中的沉淀与磁珠清洗液混悬，收集沉淀，即为磁分离产物；
[0056] 3)将所述磁分离产物和上述的试剂盒中的底物溶液混匀，得到混合产物，用化学 发光仪检测所述混合产物的发光强度，通过发光强度计算待测样本中全量程甲状腺球蛋白 定量；
[0057] 所述磁珠清洗液为将上述的试剂盒中清洗液与水按1:7混匀，得到溶液；
[005引或上述的试剂盒中磁分离试剂在甲状腺球蛋白定量检测中的应用。
[0059] 所述抗试剂缓冲液的抑值为8. 0 ±0. 05。
[0060] 所述校准品缓冲液的抑值为8. 0 + 0. 05。
[0061] 所述异硫氯酸巧光素标记的甲状腺球蛋白单克隆抗体为用异硫氯酸巧光素标记 甲状腺球蛋白单克隆抗体A得到的产物；
[0062] 所述碱性憐酸酶标记甲状腺球蛋白单克隆抗体为用碱性憐酸酶标记甲状腺球蛋 白的单克隆抗体B得到的产物。
[0063] 本发明所采用的检测方法是磁微粒分离化学发光免疫检测，酶标记技术，磁分离 技术和化学发光技术相结合，其操作方便、简单，反应条件溫和，发光值稳定且受外界条件 影响较小。相比于现有检测方法，本发明具有样本处理过程简单，检测成本低，检测快速，测 试结果准确、重复性好等优点。
[0064] 本发明具有W下优点：
[0065]1、使用磁微粒子为固相，使免疫