r>[0119] 将活化后的TG抗体（W溶液的形式加入）与活化后碱性憐酸酶（W溶液的形式 加入）按Img TG抗体加入Img碱性憐酸酶的比例混合，同时加入5 μ L 1M氯化儀水溶液混 匀，放置4°C反应20小时。
[0120] 使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的TG抗体和碱性憐酸酶， 用0. 05mol/LΞ乙醇胺缓冲液PH7. 0洗脱，洗脱流速为0. 75ml/min，柱子直径/长度为 1. 6/60cm，观察出峰位置并比对标准分子图谱收集连接物，保存于4°C，得到纯化后碱性憐 酸酶标记TG单克隆抗体。
[0121] 2)、试剂B的配制
[0122] 将上述1)的纯化后碱性憐酸酶标记TG单克隆抗体与上述3中1)的抗试剂缓冲 液混匀，得到试剂B，其中碱性憐酸酶标记TG单克隆抗体的浓度为0.加g/ml。
[0123] 5、样本稀释液
[0124] 样本稀释液为将牛血清白蛋白度SA)、trizmabase和水混匀，得到样本稀释液，牛 血清白蛋白的质量百分含量为0. 5%，trizmabase的浓度为0.Imol/L。
[0125] 6、磁分离试剂（结合有抗异硫氯酸巧光素抗体的磁微粒混悬液）
[0126] 磁分离试剂为将羊抗异硫氯酸巧光素抗体血清（多克隆抗体，厂家：解放军总医 院第一附属医院实验动物科货号：Y11005)共价连接在磁微粒表面，得到磁分离试剂；其 中，抗异硫氯酸巧光素抗体和磁微粒的配比为150μg:lmg。
[0127]磁微粒的直径在0. 5-1. 5μηι之间（厂家：me;rck公司，货号：EMl-100/40)，具有超 顺磁性，表面含有簇基（C00H-)活性基团。
[012引磁分离试剂的具体制备方法：
[0129] (1)将磁珠与活化剂邸C(购自SIMGA公司，CAS:25952-53-8,货号：E7750)和 NHS(购自SIMGA公司，CAS:6066-82-6,货号：130672)W-定比例混合，室溫反应120分 钟，得到活化磁珠；上述磁珠与活化剂混合比例为：l〇〇〇mg磁珠中加入5mgEDC和5mgN服； 似将活化后磁珠与羊抗异硫氯酸巧光素抗体W-定比例混合，混合比例为：l〇〇〇mg磁珠 中加入150mg羊抗异硫氯酸巧光素抗体，4度振荡反应10小时，得到连接蛋白的磁珠；（3) 将连接蛋白后的磁珠用封闭液进行处理，室溫封闭1小时，得到磁珠溶液；封闭液为含有 Ig/lOOmLBSA的抑7. 0、0. 01M的MES缓冲液；（4)将（3)得到的磁珠溶液在磁场作用下沉 降20分钟后弃上清；将磁珠悬浮于100mlpH7. 0、0. 01M的MES缓冲液后过1500目材质为 304钢的不诱钢筛，过筛过程中，不断振荡并用抑7. 0、0. 01M的MES缓冲液反复冲洗，直至筛 面上剩余不能过筛的团聚颗粒，过筛后的磁珠重新混悬后应颗粒均一，无凝集；（5)将过筛 后的磁珠用保存液稀释至5mg/ml，室溫混悬2小时后4°C保存，得到结合有抗异硫氯酸巧光 素抗体的磁珠；保存液为含1 %牛血清白蛋白的trizma base缓冲液；再将结合有抗异硫氯 酸巧光素抗体的磁珠悬浮在含1 %牛血清白蛋白的trizma base缓冲液中，得到磁分离试 剂；
[0130] 含1 %牛血清白蛋白的trizmabase缓冲液为将牛血清白蛋白、trizmabase和水 混匀，得到含牛血清白蛋白的trizmabase缓冲液，其中，牛血清白蛋白的浓度为1% (为质 量百分含量）、trizmabase的浓度为0.Imol/L。
[0131] 7、清洗液
[013引清洗液：将吐溫-20、氯化钢和抑为8. 0 + 0. 05浓度为0. 15M的Tris-肥1缓冲 液混合，得到清洗液，其中吐溫-20的浓度为0. 04% (体积百分含量），氯化钢的浓度为 0.25mol/L。
[0133] 8、底物溶液
[0134] 底物溶液：将二氨叮晚与浓度为0. 25M、抑为8. 0 + 0. 05的Tris-HCl缓冲液混匀， 溶解，使二氨叮晚终浓度为0. 25mg/mU得到的溶液。
[0135] 二、利用磁微粒子化学发光免疫试剂盒对样本中甲状腺球蛋白含量进行定量测定
[0136] 1、原理
[0137] 图1为磁微粒分离化学发光免疫法检测甲状腺球蛋白示意图。
[013引本发明为夹屯、法。利用磁微粒子化学发光免疫分析方法对样本中甲状腺球蛋白含 量进行定量测定。反应的技术原理为：碱性憐酸酶（A巧标记的甲状腺球蛋白抗体与异硫氯 酸巧光素（FITC)标记的甲状腺球蛋白抗体同样本、校准品或质控品中的甲状腺球蛋白结 合，形成"Ξ明治"结构的抗原抗体复合物。随后加入连有抗巧光素抗体的磁性微粒，通过 抗巧光素抗体与巧光素的特异性结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直 接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。弃上清后清洗沉淀复合物，加 入酶促化学底物溶液。底物在酶作用下便催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态 中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应。使用分析仪检测反应的发光强度。发光强 度与样本中甲状腺球蛋白的含量呈正比。
[0139] 2、甲状腺球蛋白磁微粒分离化学发光免疫检测方法
[0140] (1)免疫反应：分别将30μL上述一的试剂盒中的TG校准品、30μL质控品、30μL 待测样本至不同反应管内，再分别向各个反应管中加入30μL试剂A和30μL试剂Β，置于 振荡器上混匀，37°C溫育15min;
[01川 似磁分离：向经过（1)处理的各个反应管中再加入30μL磁分离试剂，置于振荡 器上混匀，37°C溫育15min，使磁微粒在磁场中沉降，去上清，加入200μL磁珠清洗液（将上 述一的试剂盒中的清洗液与纯化水按1:7稀释配制成磁珠清洗液），去除磁场，震荡使磁微 粒充分混悬30秒，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复2-4次；
[0142] (3)读值：向经过（2)处理的各个反应管每管加入200μL底物溶液，用化学发光 仪检测发光强度。
[0143] 具体如下；
[0144] 将各试剂、样品杯及反应管置于仪器中，严格按照全自动化学发光免疫分析 仪的操作程序进行实验操作并计算样本浓度。仪器已具备了实验所需要的反应溫度 37°C±rC，该项目的反应时间及操作步骤已输入到全自动的操作程序中，选定该项目 (CR巧后即可获得该此项目每一步试验所需的时间，仪器光谱测定范围300皿~650皿。
[0145] TG试剂盒在测定范围内，发光强度与待测样本中TG浓度成正比，使用改良的四参 数Logistic方程拟合计算出样本中TG浓度。
[0146] y= (Α1-Α0)/(1+(χ/Χ0Γ巧+A0
[0147] y:发光强度
[014引 X:浓度值
[0149] A1 :曲线上渐近线估值
[0150] AO:曲线下渐近线估值
[015。X0 :曲线拐点对应的浓度值
[0152] P:曲线斜率相关的参数
[0153] 实施例2、试剂盒性能评价
[0154] 根据体外诊断试剂的特点，按惯例检测实施例1制备的试剂盒的线性范围、灵敏 度、准确性、精密度。具体操作步骤如下：
[0155] 一、试剂准备：
[0156]实验前，先取出试剂A(异硫氯酸巧光素标记TG单克隆抗体的浓度为0. 3ug/ml)、 试剂B(碱性憐酸酶标记TG单克隆抗体的浓度为0.加g/ml)、校准品、磁分离试剂、发光底 物、样品稀释液、清洗液浓缩液、质控品，平衡至室溫。
[0157] 二、仪器准备：
[0158] 本试剂盒采用博奥生物集团有限公司的化emLite?1200全自动化学发光免疫分 析仪。
[0159] 具体如下；
[0160] 在样品杯中加入校准品、样本或质控品，样本单管反应加样量为30μ以根据重复 管数计算样品杯中加入量，最少加样量不小于50μ以加入充足量的试剂。
[0161] 将各试剂、样品杯及反应管置于仪器中，严格按照全自动化学发光免疫分析 仪的操作程序进行实验操作并计算样本浓度。仪器已具备了实验所需要的反应溫度 37°C±rC，该项目的反应时间及操作步骤已输入到全自动的操作程序中，选定该项目 灯G)后即可获得该此项目每一步试验所需的时间，仪器光谱测定范围300nm~650nm。
[0162] 四、性能指标检测结果：
[0163] 1、线性范围：
[0164] 待测样本为超出线性范围上限浓度的样本和超出或等于线性范围下段的样本， 混合成至少5个稀释浓度狂i)，具体如表1所示，其中稀释比例为1的待测样本为浓度为 750ng/mL的TG溶液（溶质：TG抗原，溶剂：校准品缓冲液浓度75化g/mL)。
[0165] 用实施例1中的一制备的试剂盒和二的检测方法对待测样本进行检测，测定线性 范围。每个稀释浓度测试3次。
[0166]分别求出测定结果的均值（Yi)，W稀释浓度狂i)为自变量，W测定结果均值（Yi) 为因变量，求出线性回归方程，按公式（1)计算线性回归系数（r)。
[0167] ........................(I)
[016引使用改良的四参数Logistic方程拟合，在1.0-75化g/mL检测范围内，剂量-反应 曲线相关系数r= 0. 9996。此检测范围远远优于有专利报道过的同类产品。
[0169] 表1线性范围实验结果
[0170]
[0171]
[0172] 2、准确度：
[0173] 待测样本为稀释甲状腺球蛋白（TG)国际标准品度CR-457)，使其最终浓度为 (50±10)ng/mL和（300±60)ng/mU将其作为样本按照说明书的步骤进行检测，重复测量3 次后，其平均值结果记为Cm,根据公式（1)计算测量浓度的相对偏差Cb，偏差应在±10%范 围内。
[0174] Cb= (Cm-Cr)/CrX100 %................................. (1)
[0175] 式中：
[017引 Cb:浓度的相对偏差
[0177]Cm:测量浓度的均值 [017引 化：标定浓度