检测辣椒中黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及酶联免疫检测技术，具体设及一种用于检测辣椒中黄曲霉毒素B1的 酶联免疫试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒是中国很多地区的主要经济作物，因其营养丰富、口感极佳和饮食习惯，是餐 桌上最常见的主菜。干辣椒是由成熟的辣椒干制而成的一种重要调料，富含多种营养物质， 可制成辣椒油、辣椒酱、辣椒粉、食品添加剂，其在储运和销售等环节中，在溫度、湿度适宜 的环境条件下，极易滋生各种微生物，而使辣椒发霉变质，致使辣椒品质下降，其中W黄曲 霉毒素的污染和危害最为突出，严重制约了干辣椒产业的发展，造成重大经济损失。
[0003] 黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT)是一类化学结构类似的化合物，主要由黄曲霉 (aspergillusflavus)寄生曲霉（a.parasiti州S))产生的次生代谢产物，均为二氨巧喃香 豆素的衍生物，黄曲霉毒素（81、82、61、62)是一群结构相似，黄曲霉毒素81含有一个双巧 喃环和一个氧杂糞邻酬，前者为基本毒性结构，后者与致癌有关，黄曲霉毒素B1是毒性最 强的一种，可引起内脏器官的病变，给人类健康带来极大威胁，其毒性是氯化钟的10倍，祇 霜的68倍，因此受到世界各国的普遍关注，世界卫生组织（WT0)的癌症研究机构于1993年 将黄曲霉毒素划定为I类致癌物质。
[0004] 目前，黄曲霉毒素B1的检测方法主要有：免疫亲和层析净化高效液相色谱法、免 疫亲和层析净化巧光光度法、薄层色谱等多种检测方法。免疫亲和层析净化高效液相色谱 法，样品前处理过程较为复杂、耗时、需纯化处理，检测需要昂贵的实验室大型试验仪器和 设备，配备专业检测人员进行试验操作，难W满足现场大规模检测。免疫亲和层析净化巧光 光度法，样品前处理过程较为复杂、耗时、需纯化处理，检测需要巧光光度计，难W满足现场 检测需要。薄层色谱法样品前处理繁琐，实验过程复杂、耗时、准确性差，灵敏度低、特异性 不强，且对实验操作人员危害较大。本发明建立的酶联免疫法具有灵敏度高、特异性强，能 够满足现场大规模检测的快速筛选检验的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种检测辣椒中黄曲霉毒素B1的酶联免疫试 剂盒，本发明酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，能对辣椒及辣椒制品中黄曲霉毒素B1含 量进行快速检测，特别适合现场大批量样品的筛选检测。
[0006] 本发明提供一种黄曲霉毒素B1单克隆抗体和生产制备运种单克隆抗体的方法。 黄曲霉毒素B1是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应 答。对黄曲霉毒素B1分子进行结构改造，获得黄曲霉毒素B1半抗原，从而制备特异性抗体。 黄曲霉毒素B1与盐酸径胺缩合反应，引入一个新的径基，再与班巧酸酢反应得到具有簇基 的黄曲霉毒素B1半抗原（图2)，该黄曲霉毒素B1半抗原与大分子载体蛋白偶联得到黄曲 霉毒素B1完全抗原（免疫原或包被原）。
[0007] 前述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白常用载体蛋白。
[0008] 本发明采用混合酸酢法将黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，重点突出黄曲 霉毒素B1的特征结构，增加了黄曲霉毒素B1半抗原的免疫原性。经测定本发明中黄曲霉 毒素B1与牛血清白蛋白的结合摩尔比为14-18:1，满足抗体制备条件。
[0009] 所述黄曲霉毒素B1特异性抗体为黄曲霉毒素B1单克隆抗体，它们均是前述黄曲 霉毒素B1免疫原免疫动物制备得到的。
[0010] 所述黄曲霉毒素B1单克隆抗体优选为黄曲霉毒素B1鼠单克隆抗体。
[0011] 本发明过程中原材料制备过程： 1.半抗原的合成 黄曲霉毒素B1半抗原合成技术路线如图2。
[0012] 2.黄曲霉毒素B1抗体的制备 (1)免疫原制备 将黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白采用混合酸酢法进行偶联得到免疫原。
[0013] (2)黄曲霉毒素B1鼠单克隆抗体的制备 a)免疫：选取Ba化/c小鼠作为免疫动物，黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联物为 免疫原，血清效价大于1 : 10000后，取脾脏进行细胞融合。
[0014]b)细胞融合与克隆化：取免疫Ba化/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选 细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[001引 3.抗抗体的制备 羊抗鼠抗抗体是W羊作为免疫动物，W鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得 到羊抗鼠抗抗体； 4.本发明所提供的黄曲霉毒素B1检测方法及其检测试剂盒用于检测辣椒黄曲霉毒素B1含量。
[0016] 所述试剂盒还包括黄曲霉毒素B1标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涂液、 浓缩复溶液。
[0017] 所述黄曲霉毒素B1标准品溶液：6瓶，浓度分别为0,0. 02,0. 05,0. 15,0. 60和 1. 8μg/Lo
[0018] 所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性憐酸醋酶，其中优选辣根过氧化 物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用戊二醒法或过舰酸钢法将标记酶与抗抗体进行偶联得 到的。
[0019] 当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液 A液为过氧化氨或过氧化脈，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1~ 2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性憐酸醋酶时，显色液为对硝基憐酸盐缓冲 液、终止液为1~2mol/L氨氧化钢溶液。
[0020] 所述浓缩洗涂液为抑值为7. 2-7. 5、含有0. 8-1. 2 %吐溫-20、0. 3-0. 6%〇叠氮化 钢，0. 1-0. 2mol/L的憐酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。
[0021] 所述浓缩复溶液为抑7. 5-7. 8,含有2-4 %酪蛋白，0. 1-0. 2mol/L的憐酸盐缓冲 液，所述百分比为重量体积百分比。
[0022] 其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为抑值为9. 2-9. 6、0. 1-0. 2mol/L的 碳酸盐缓冲液，所用封闭液为含有5-8%脱脂奶粉，抑值7. 2-7. 6、0. 1-0. 2mol/L的憐酸盐 缓冲液，所述百分比为重量体积比。
[0023] 本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将黄曲霉毒素B1偶联抗原、抗体或 抗抗体稀释成0. 15-0. 25μg/ml，每孔加入100μ1，37°C溫育化或4°C过夜，倾去包被液，用 稀释的浓缩洗涂液洗涂2次，每次30秒，甩掉孔中液体，W吸水纸吸除残余水分后，向每孔 中加入200μ1封闭液，37°C溫育化，倾去孔内液体，干燥后用侣膜真空密封，4°C干燥处保 存备用。
[0024] 5.本发明的检测原理为： 当在酶标板上预包被黄曲霉毒素B1偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加 入黄曲霉毒素B1特异性抗体溶液，样本中残留的黄曲霉毒素B1药物与酶标板上包被的黄 曲霉毒素B1偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用 显色液显色，样本吸光值与黄曲霉毒素B1药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出 样本中黄曲霉毒素B1的残留量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的黄曲霉毒素 B1标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中黄曲霉毒素B1残留量的浓度范围。
[00巧]当在酶标板上预包被黄曲霉毒素B1特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液 后，再加入酶标记黄曲霉毒素B1半抗原溶液，样本中残留的黄曲霉毒素B1药物与酶标记抗 原竞争包被在酶标板上的黄曲霉毒素B1特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与黄曲霉 毒素B1药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中黄曲霉毒素B1的残留含量。 同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较可粗 略判断样品中黄曲霉毒素B1残留量的浓度范围。
[0026] 当在酶标板上预包被黄曲霉毒素B1偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后， 再加入酶标记黄曲霉毒素B