巨噬细胞迁移抑制因子(mif)作为早期阿尔茨海默病血清分子标志物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测阿尔茨海默病血清中巨噬细胞迀移抑制因子的水平用来作为早期阿尔茨海默病诊断的生物标志物。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(AD)是最为常见的神经退化疾病，其主要临床症状为进行性认知功能损伤。当前，AD的诊断主要依赖病史、临床表现和神经心理学测试，同时排除可能引起痴呆的其他脑部和全身性疾病。该诊断方法存在手续繁琐、价格昂贵、损伤性、特异性差等缺点，且不适宜高风险人群筛查，对于早期AD的诊断更是具有极大限制。临床上迫切需要无创的或低创的、灵敏的、特异的、低成本的生物标记物检测手段实现AD早期诊断及药物疗效监测。
【发明内容】
[0003]本研究使用国际上广泛使用的AD转基因小鼠(3x Tg-AD transgenic miceharboring PS1M146V, APPSwe, and taup301L transgenes)为研究模型，通过酶联免疫吸附(ELISA)、免疫组织化学及神经行为学方法检测AD小鼠血浆中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的水平及空间记忆的变化，分析血浆MIF水平与空间记忆损伤的相关性。结果显示，血浆MIF的水平在早期阶段AD小鼠(2月龄)显著升高，而此阶段未见β淀粉样蛋白及空间记忆的损伤。而且，AD小鼠MIF的水平呈年龄依赖性升高。统计学分析显示，血浆MIF水平与空间记忆水平呈高度负相关。因此，这些结果提示，MIF充当早期AD血浆分子标志物，可用于抗AD药物的筛选或AD的早期诊断。
[0004]因此，本发明的一个目的是提供巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)作为早期阿尔茨海默病诊断的生物标志物在制备检测阿尔茨海默病的诊断试剂中的用途。
[0005]本发明的另一个目的是提供检测组织样本，优选血浆或血清样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的方法，包括:
[0006](Α)获取组织样本，优选血浆样本，检测巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的水平；
[0007](Β)将所检测到的巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的水平与正常水平进行比较。
[0008]本发明的再一个目的是提供检测组织样本，优选血浆样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，其包括:MIF标准品、稀释液、生物素标记的MIF检测抗体、ΤΜΒ底物(3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)、已包被酶标板、Str印tavidin-HRP (辣根过氧化物酶标记链霉亲和素)。
[0009]本发明的又一个目的是提供检测组织样本，优选血浆样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的免疫组织化学检测试剂盒，其包括:抗0_淀粉蛋白142仏0142)的抗体及HRP (辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔的二抗，DAB (3, 3- 二氨基联苯胺)底物及缓冲液。
[0010]MIF的酶联免疫吸附(ELISA)方法包括:根据商业上提供的试剂盒，即武汉优尔生科技股份有限公司提供的小鼠MIF检测试剂盒提供的方法进行(USCN，SEA698MU)，具体步骤如下:取已包被酶标板，加入MIF标准品、样品各ΙΟΟμΙ/孔，以稀释液作为空白对照，37°C孵育2h后，PBS洗涤3次；加入生物素标记MIF检测抗体100 μ 1/孔，37°C孵育lh, PBS 洗涤 3 次；然后加入 Streptavidin-HRP, 100 μ 1/ 孔，37°C孵育 lh, PBS 洗涤 3 次；加入TMB显色，100 μ 1/孔，室温放置10?15min，最后加入终止液终止反应，450nm测定A值，以空白对照的A值校零。以MIF标准的蛋白含量为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0011]免疫组织化学检测方法包括如下步骤:试剂主要包括来自ChemiconInternat1nal/Mi llipore (Temecula, CA, USA)公司的抗 β -淀粉蛋白:42 (A β 丨 42)的抗体及HRP标记的羊抗兔的二抗，DAB底物及缓冲液，具体步骤如下:小鼠经采血处理后，处死小鼠并经过心脏灌注PBS，迅速取出大脑，在4%的多聚甲醛中后固定24h，通过脱水透明后经石蜡包埋。通过石蜡切片机行冠状切片，厚度5 μ m，0.1 %过氧化氢处理后孵育一抗-抗Αβ 1 42(1:500)过夜，然后经辣根过氧化物酶标记的羊抗兔处理2h，缓冲液洗涤3次后加入底物显色，在普通显微镜下分析Αβ i 42的表达变化。
【附图说明】
[0012]图1所示为早期细胞内Αβ i 42沉积免疫组织化学分析图。
[0013]图2所示为AD小鼠血浆MIF水平与年龄相关图。
[0014]图3所示为血浆MIF水平与AD小鼠空间记忆能力(平台穿越次数)相关图。
[0015]图4A和图4B所示为血浆MIF水平与AD小鼠空间记忆能力(潜伏期及记忆错误次数)相关图。
【具体实施方式】
[0016]以下结合【具体实施方式】来说明本发明。
[0017]实施例1
[0018]用于检测组织样本，优选血浆或血清样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，包括已包被酶标板、MIF标准品xX 100 μ 1、样品xX 100 μ 1，xX 100 μ 1稀释液，PBS，生物素标记MIF检测抗体xX 100 μ 1，Streptavidin-HRP χΧΙΟΟμΙ,ΤΜΒ χΧΙΟΟμΙ，终止液。
[0019]实施例2
[0020]用于检测组织样本，优选血浆或血清样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的免疫组织化学检测试剂盒，其包括:抗β -淀粉蛋白:42 (Α β i 42)的抗体及HRP (辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔的二抗，DAB (3, 3- 二氨基联苯胺)底物及缓冲液。
[0021 ] 在以下的实验部分中，所使用的试验方法如下:
[0022]Morris水迷宫检测:学习过程持续5天，每次训练包括4个象限(每象限1次)。在实验前，小鼠被带到迷宫适应。房间温度和水温控制在23±2°C。训练过程中，如果60s内为找到平台，将小鼠放到平台适应5s，训练结束后5天，撤走平台，检测小鼠穿越平台的次数作为小鼠空间记忆保留能力。
[0023]电跳台实验:具体实验步骤如下:a)打开小鼠跳台测试箱，训练时置小鼠于反应箱适应3分钟；b)打开电源，启动小鼠测试仪，设定时间(5min)、电压(36V) ;c)打开测试箱电源使底面铜栅通电，按跳台测试仪“启/停”键开始实验，跳台测试仪即开始记录5分钟内动物跳下橡皮台的次数作为训练期错误次数，为学习成绩；d)24小时后，底部铜栅通电，重复前操作，此时测试仪记录小鼠第一次跳下平台的时间即潜伏期和5min内的跳下橡皮台的次数即测试期错误次数，作为记忆保持成绩。
[0024]如图1所示，使用AD转基因小鼠，每组3只动物(Bar = 20 μ m)，免疫组织化学分析揭示在早期阶段(2月龄)AD小鼠海马CA1、CA3、齿状回及皮层可检测到细胞内Αβ i 42沉积并呈年龄依赖性升高(2、4、8、12月龄)，此阶段小鼠未检测到认知功能的损伤。结果显示了早期细胞内Αβ142沉积。
[0025]如图2所示，使用AD转基因小鼠，每组9只动物，用统计学方法:Student’ st-test及单因素方差分析结合Student-Newman Keuls (SNK)法分析每组的差异。结果显示了 AD小鼠血浆MIF水平呈年龄依赖性升高，与野生小鼠相比，早期阶段(2月龄)AD小鼠血浆MIF显著升高，随着年龄的增加，AD小鼠血浆中MIF水平逐渐升高。*#vs.WT:P<0.001 ；# # # vs.2months 3x Tg-AD:P<0.001 ； Δ Δ Δ vs.4months 3x Tg-AD:P<0.001 ；▲ ▲▲ vs.8months 3x Tg-AD:P<0.001 ；n = 9for each group)。
[0026]如图3所示，动物数共35只，水迷宫训练5天后，检测AD小鼠空间记忆，发现血浆MIF水平与小鼠穿越平台象限次数呈显著负相关。统计学方法为Pearson相关性分析。该试验显示血浆MIF水平与AD小鼠空间记忆能力(平台穿越次数)呈显著负相关。
[0027]如图4所示，动物数共36只，统计学方法-Pearson相关性分析。电跳台训练后，检测AD小鼠空间记忆，发现血浆MIF水平与小鼠潜伏期呈显著负相关，与错误次数呈显著正负相关，提示，血浆MIF水平与空间记忆能力呈负性相关。结果显示，血浆MIF水平与AD小鼠空间记忆能力(潜伏期及记忆错误次数)呈显著相关。
[0028]通过上述实验可以发现，MIF血浆水平与阿尔茨海默病发病和疾病严重程度存在显著相关性。通过检测血浆MIF水平，可以对阿尔茨海默病进行早期诊断和治疗效果评价。
【主权项】
1.巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)作为早期阿尔茨海默病诊断的生物标志物在制备阿尔茨海默病的诊断试剂中的用途。2.—种检测组织样本，优选血浆样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的方法，包括: (A)获取组织样本，优选血浆样本，检测巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的水平； (B)将所检测到的巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的水平与正常水平进行比较。3.—种检测组织样本，优选血浆样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，其包括:MIF标准品、稀释液、生物素标记的MIF检测抗体、TMB底物(3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)、已包被酶标板、Streptavidin-HRP (辣根过氧化物酶标记链霉亲和素)。4.一种检测组织样本，优选血浆样本中巨噬细胞迀移抑制因子(MIF)的免疫组织化学检测试剂盒，其包括:抗3-淀粉蛋白142仏0142)的抗体及HRP (辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔的二抗，DAB (3，3- 二氨基联苯胺)底物及缓冲液。
【专利摘要】本发明涉及巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)作为早期阿尔茨海默病诊断的生物标志物在制备检测阿尔茨海默病的诊断试剂中的用途。本发明还提供了一种检测组织样本，优选血清样本中巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的方法及相关检测试剂盒。根据本发明的方法，可以对阿尔茨海默病进行早期诊断和治疗效果评价。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105277715
【申请号】CN201510281881
【发明人】罗晓斌, 杨细飞
【申请人】广州凯拓生物科技开发有限公司, 深圳市疾病预防控制中心
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年5月28日