抗体偶联药T-DM1的中间体T-MCC偶联分布的检测方法与流程

抗体偶联药t-dm1的中间体t-mcc偶联分布的检测方法
技术领域
[0001]
本发明涉及药物领域，特别涉及抗体偶联药t-dm1的中间体t-mcc偶联分布的检测方法。


背景技术：

[0002]
t-dm1为曲妥珠单抗(trastuzumab)通过连接子smcc(linker)偶联0-8个小分子毒素dm1的抗体偶联药物(adc)。其偶联工艺为
①
smcc与抗体上的赖氨酸位点发生修饰反应得到t-mcc；
②
t-mcc和dm1通过化学偶联反应得到t-dm1。
[0003]
t-dm1的小分子偶联分布和药物抗体偶联比(dar)为t-dm1的关键质量属性，需要控制在一定的大小范围内。对中间体t-mcc进行linker偶联情况的分析，能够为工艺优化提供依据，对生产过程进行控制，进而保障最终产品的质量。
[0004]
目前测定t-dm1的小分子偶联分布分析主要采用icief法、lc-ms法，测定dar主要使用lc-ms法和uv法。
[0005]
icief法的原理为单抗上赖氨酸位点偶联不同个数dm1造成赖氨酸正电荷被封闭，等电点往酸性偏移，使用实时成像等电聚焦(icief)能够使t-dm1中不同偶联组分按等电点差异分离，计算出不同偶联组分的含量。此法缺点是，t-mcc电荷异质性复杂，图谱杂乱，解析困难。
[0006]
uv法通过检测t-dm1在280nm和252nm两个波长的吸光度值，根据抗体和dm1的消光系数，按照朗博比尔定律，计算出抗体和dm1的摩尔浓度，进而得出偶联比。但t-mcc不含有dm1，linker没有紫外特征吸收，无法使用uv法进行检测。
[0007]
lc-ms法可以通过分子量差异分析t-dm1的小分子偶联分布和dar。中间体t-mcc上的linker有可能通过共价键连接到相近的轻链、重链或其他抗体分子上。lc-ms可以通过分子量差异和信号强度，分析出t-mcc中错配linker的含量。通过研究发现，t-mcc的错配linker的比例越高，最终t-dm1的错配linker也是相同趋势，并且dar越高。lc-ms的缺点是，质谱响应信号和离子化效率有关，t-dm1和t-mcc因为偶联小分子可能导致离子化信号降低，数据的重现性不够好，数据分析复杂，仪器昂贵，成本高，不适用于生产工艺监测和放行检测。
[0008]
因此以上三种方法都不适用于中间体t-mcc样品的分析。
[0009]
根据lc-ms研究结果，t-mcc上的linker错配比例大小，与t-dm1的dar高低相关。因此可以通过测定linker错配的含量，来分析最终t-dm1的dar的高低。
[0010]
文献中有报道利用agilent 2100 bioanalyzer和agilent protein 230 kit进行芯片电泳，来分析t-mcc的片段大小及含量。原理是采用芯片染色，荧光染料与sds胶束中的蛋白质缔合，按分子量大小分离后由荧光检测器进行检测。还原剂作用下，linker间的共价键依然存在，产生重链-轻链(hl)，重链-重链(hh)等高分子共价结构产物。此法可以检测出linker错配导致的高分子共价产物的含量。此法的缺点是：由于系统中染料的存在以及蛋白内源性荧光的影响，导致背景有荧光的干扰。荧光染料与蛋白进行衍生化反应的程度也
会影响检测的准确性。
[0011]
因此需要建立一种操作简便、无需衍生化样品的还原型ce-sds检测方法，进行t-mcc中linker错配形成的高分子共价产物的含量分析，用于偶联工艺的研究和控制。


技术实现要素：

[0012]
有鉴于此，本发明提供了一种还原型ce-sds分析方法，操作简便，能够快速检测t-dm1中间体t-mcc中由linker错配形成的高分子共价片段，通过其含量，可提前分析最终产物t-dm1的偶联率dar大小，为工艺优化和控制提供参考依据，节约生产成本，保障产品质量。
[0013]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0014]
本发明提供了还原剂与sds的组合在抗体偶联药t-dm1的中间体t-mcc偶联分布分析和/或抗体偶联药t-dm1的药物抗体偶联比dar分析中的应用；所述还原剂包括β-巯基乙醇和/或二硫苏糖醇。
[0015]
基于上述研究，本发明还提供了抗体偶联药t-dm1的中间体t-mcc偶联分布的检测方法，包括如下步骤：
[0016]
步骤1：取t-dm1稀释获得t-dm1稀释液，与样品缓冲液、还原剂混合加热后，制得t-dm1供试品溶液；
[0017]
步骤2：取t-mcc稀释获得t-mcc稀释液，与样品缓冲液、还原剂混合加热后，制得t-mcc供试品溶液；
[0018]
步骤3：分别取所述t-dm1供试品溶液、所述t-mcc供试品溶液经还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳紫外检测法(还原ce-sds法)检测，获得图谱；
[0019]
步骤4：对步骤3获得的图谱进行积分，按面积归一化法获得轻链(l)、重链(h)、重链-轻链(hl)，重链-重链(hh)各组分的百分含量；
[0020]
各组分含量＝组分校正峰面积/总校正峰面积
×
100％；
[0021]
步骤1和步骤2的排序不分先后；
[0022]
所述还原剂包括β-巯基乙醇和/或二硫苏糖醇。
[0023]
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品缓冲液为包含1％sds的100mm tris-hcl，ph 9.0。
[0024]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1或步骤2中所述稀释为加水稀释至2mg/ml～6mg/ml；
[0025]
步骤1中所述t-dm1稀释液与样品缓冲液、还原剂的体积比为25:70:5；
[0026]
步骤2中所述t-mcc稀释液与样品缓冲液、还原剂的体积比为25:70:5。
[0027]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1或步骤2中所述加热为于60℃～70℃加热10min。
[0028]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述十二烷基硫酸钠毛细管电泳法中毛细管的温度为18℃～22℃，所述t-dm1供试品溶液、所述t-mcc供试品溶液的温度为10℃，检测波长220nm。
[0029]
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述检测包括：毛细管的预处理、毛细管的预填充、供试品进样和分离检测；
[0030]
所述供试品包括t-dm1供试品溶液和/或t-mcc供试品溶液。
[0031]
在本发明的一些具体实施方案中，所述毛细管的预处理为：取0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管5min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管3min。
[0032]
在本发明的一些具体实施方案中，所述毛细管的预填充为：取凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min；所述凝胶缓冲液为含0.2％sds的凝胶溶液，ph 8。
[0033]
在本发明的一些具体实施方案中，所述供试品进样为：5.0kv反向极性电动进样20s；所述分离检测为：在13.0kv～17.0kv反相极性下检测30min。
[0034]
基于上述研究，本发明还提供了抗体偶联药t-dm1的药物抗体偶联比dar的检测方法，如所述的抗体偶联药t-dm1的中间体t-mcc偶联分布的检测方法获得重链-轻链的百分含量和/或重链-重链的百分含量，所述重链-轻链的百分含量和/或重链-重链的百分含量与所述药物抗体偶联比dar呈正相关。t-mcc的hl和hh含量越高，dar结果越高；反之t-mcc的hl和hh含量越低，dar结果越低。
[0035]
本发明提供的检测方法，添加还原剂处理后的蛋白质与样品缓冲液中的sds缔合，根据分子量大小，在填充凝胶的毛细管中进行分离，因蛋白质在220nm紫外波长处有吸收，通过紫外检测器可直接对蛋白质进行检测。该方法操作简便，能够快速分析t-dm1中间体t-mcc中由linker错配形成的高分子共价片段，通过其含量多少，可提前分析最终产物t-dm1的偶联率dar大小。将该方法应用在抗体偶联药t-dm1的中间体偶联分布分析中，能为工艺优化和控制提供参考依据，节约成本，保障产品质量。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0037]
图1示实施例1中t-mcc还原型ce-sds图谱；
[0038]
图2示实施例1中t-dm1还原型ce-sds图谱；
[0039]
图3示实施例4中精密度图谱。
具体实施方式
[0040]
本发明公开了一种还原型ce-sds分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0041]
本发明提供的还原ce-sds法：添加还原剂处理后的蛋白质与样品缓冲液中的sds缔合，根据分子量大小，在填充凝胶的毛细管中进行分离，因蛋白质在220nm紫外波长处有吸收，通过紫外检测器可直接对蛋白质进行检测。
[0042]
仪器：pa800 plus毛细管电泳仪，sciex。
[0043]
供试品：中间体t-mcc、终产物t-dm1。
[0044]
样品缓冲液：100mm tris-hcl ph 9.0,1％sds。
[0045]
凝胶缓冲液：ph 8,0.2％sds。
[0046]
样品缓冲液、凝胶缓冲液来自protromelab sds-gel mw analysis chemistries试剂盒；货号3909053；公司：sciex
[0047]
还原供试品溶液制备：用水将供试品稀释至2mg ml/～6mg/ml。按供试品/样品缓冲液/β-巯基乙醇(或二硫苏糖醇)＝25/70/5的体积比配制，于65℃
±
5℃加热10min。
[0048]
毛细管卡盒安装：使用50μm id未涂层熔融石英毛细管(如sciex的uncoated capillary 50μm id)，切割为总长30cm，有效长度为20cm。检测窗口安装2号孔塞(100μm
×
200μm)。
[0049]
测定法：使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃
±
2℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管5min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管3min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv
±
2kv反相极性下检测30min。
[0050]
结果计算：对图谱进行积分，按面积归一化法计算轻链(l)、重链(h)、重链-轻链(hl)，重链-重链(hh)各组分的百分含量。
[0051]
各组分含量＝组分校正峰面积/总校正峰面积
×
100％
[0052]
结果分析：t-mcc的linker错配形成的共价高分子(主要是hl)含量高，其最终生产的t-dm1的dar(药物抗体偶联比)也越高，从而可以在工艺过程中提前判断出最终产物t-dm1原液的dar高低。t-mcc的hl含量在6％～10％范围，对应t-dm1的dar为3.2～3.8。
[0053]
本发明提供的还原型ce-sds分析方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0054]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0055]
实施例1对不同生产工艺合成的t-mcc和对应的t-dm1进行还原型ce-sds分析
[0056]
还原供试品溶液制备：
[0057]
t-mcc样品1(18mg/ml)：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。根据还原供试品溶液配制方法，取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0058]
t-mcc样品2(19.5mg/ml)：取50μl t-mcc样品2，加水194μl，稀释至4mg/ml。取25μl，加入样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0059]
t-mcc样品3(17.6mg/ml)：取50μl t-mcc样品3，加水170μl，稀释至4mg/ml。取25μl，加入样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0060]
t-dm1样品1(22.0mg/ml)：取50μl t-dm1样品1，加水225μl，稀释至4mg/ml。取25μl，加入样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0061]
t-dm1样品2(22.6mg/ml)：取50μl t-dm1样品2，加水232μl，稀释至4mg/ml。取25μl，加入样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0062]
t-dm1样品3(21.4mg/ml)：取50μl t-dm1样品3，加水218μl，稀释至4mg/ml。取25μl，加入样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0063]
毛细管卡盒安装：使用50μm id未涂层熔融石英毛细管(如sciex的uncoated capillary 50μm id)，切割为总长30cm，有效长度为20cm。检测窗口安装2号孔塞(100μm
×
200μm)。
[0064]
测定法：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0065]
对不同生产工艺合成的t-dm1进行lc-ms分析dar。
[0066]
供试品制备：取t-dm1样品50μg，加入50mm tris-hcl(ph 8.0)至50μl，加入2μl糖苷酶，37℃水浴2小时，取出后用流动相a脱盐并稀释至0.1mg/ml。
[0067]
将t-dm1样品1、t-dm1样品2、t-dm1样品3按上述方法进行制备。
[0068]
色谱条件：
[0069][0070]
洗脱梯度
[0071][0072]
质谱条件：
[0073]
[0074]
结果分析：
[0075]
见表1。不同工艺制备的中间体t-mcc，其对应linker错配形成的高分子共价产物hl和hh的含量不同，但与对应批次的t-dm1的hl和hh含量趋势一致。通过lc-ms结果，可以分析得出：t-mcc的hl和hh含量越高，dar结果越高；反之t-mcc的hl和hh含量越低，dar结果越低。t-mcc的hl含量在6％～10％范围，对应t-dm1的dar为3.2～3.8。
[0076]
因此，可以将此规律用于工艺研究和控制中，通过t-mcc的hl和hh含量，判断t-dm1的dar。
[0077]
表1 t-mcc和t-dm1的还原ce-sds和dar结果
[0078][0079]
注：t-mcc样品1，2，3分别对应为t-dm1样品1，2，3的中间体。
[0080]
实施例2
[0081]
还原供试品溶液制备：
[0082]
供试品溶液1：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0083]
供试品溶液2：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，二硫苏糖醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0084]
供试品溶液3：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于60℃加热10min。
[0085]
供试品溶液4：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于70℃加热10min。
[0086]
毛细管卡盒安装：使用50μm id未涂层熔融石英毛细管(如sciex的uncoated capillary 50μm id)，切割为总长30cm，有效长度为20cm。检测窗口安装2号孔塞(100μm
×
200μm)。
[0087]
测定法：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0088]
结果分析：
[0089]
不同样品处理条件下检测到的hl含量一致，说明β-巯基乙醇和二硫苏糖醇均可以
作为供试品溶液制备中使用的还原剂，样品还原加热温度可为65℃
±
5℃。
[0090]
表2 t-mcc样品1不同制备条件下供试品溶液检测结果
[0091][0092][0093]
实施例3
[0094]
还原供试品溶液制备：
[0095]
供试品溶液：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。
[0096]
毛细管卡盒安装：使用50μm id未涂层熔融石英毛细管(如sciex的uncoated capillary 50μm id)，切割为总长30cm，有效长度为20cm。检测窗口安装2号孔塞(100μm
×
200μm)。
[0097]
测定法1：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0098]
测定法2：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度18℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0099]
测定法3：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度22℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0100]
测定法4：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在13.0kv反相极性下检测30min。
[0101]
测定法5：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液
在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在17.0kv反相极性下检测30min。
[0102]
结果分析：
[0103]
不同检测方法测得的hl含量一致，说明毛细管温度可为20℃
±
2℃，检测电压可为15.0kv
±
2.0kv。
[0104]
表3 t-mcc样品1不同制备条件下供试品溶液检测结果
[0105]
测定法hl％16.2126.3136.1446.2756.16
[0106]
实施例4方法精密度验证
[0107]
还原供试品溶液制备：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。平行配制5份。
[0108]
毛细管卡盒安装：使用50μm id未涂层熔融石英毛细管(如sciex的uncoated capillary 50μm id)，切割为总长30cm，有效长度为20cm。检测窗口安装2号孔塞(100μm
×
200μm)。
[0109]
测定法：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0110]
5份样品分别检测1次，并计算hl含量的rsd值。
[0111][0112]
相对标准偏差(rsd)＝标准偏差(sd)/平均值(x)。
[0113]
结果分析：
[0114]
平行5份供试品溶液测得的hl含量的rsd为0.8％，≤2.0％，说明方法检测的精密度好。
[0115]
表4 精密度结果
[0116][0117]
实施例5方法准确度验证
[0118]
还原供试品溶液制备：
[0119]
100％浓度水平：取50μl t-mcc样品1，加水175μl，稀释至4mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。平行配制3份。
[0120]
80％浓度水平：取50μl t-mcc样品1，加水231μl，稀释至3.2mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。平行配制3份。
[0121]
120％浓度水平：取50μl t-mcc样品1，加水137μl，稀释至4.8mg/ml。取25μl稀释后的t-mcc样品1，加入sds样品缓冲液70μl，β-巯基乙醇5μl，混匀。于65℃加热10min。平行配制3份。
[0122]
毛细管卡盒安装：使用50μm id未涂层熔融石英毛细管(如sciex的uncoated capillary 50μm id)，切割为总长30cm，有效长度为20cm。检测窗口安装2号孔塞(100μm
×
200μm)。
[0123]
测定法：pa800plus使用毛细管电泳仪进行分析。毛细管温度20℃，样品室温度10℃，检测波长220nm。用0.1m的naoh溶液在70psi压力下冲洗毛细管3min，用0.1m的hcl溶液在70psi压力下冲洗毛细管1min，用超纯水在70psi压力下冲洗毛细管1min，用凝胶缓冲液在70psi压力下填充毛细管10min。用5.0kv反向极性电动进样20s，在15.0kv反相极性下检测30min。
[0124]
9份样品分别检测1次，并计算hl含量的rsd值。
[0125][0126]
相对标准偏差(rsd)＝标准偏差(sd)/平均值(x)。
[0127]
结果分析：
[0128]
3个浓度9份供试品溶液测得的hl含量的rsd为1.1％，≤2.0％，说明方法在浓度水平80％～120％范围内，准确度好。
[0129]
表5 准确度结果
[0130][0131]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。