一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法与流程

1.本发明属于生物化工领域，具体涉及一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法。


背景技术：

2.石油降解菌的筛选，传统的工作主要是以菌体在含有石油为唯一碳源的培养基中生长作为指标。例如：耐碱海旋菌，该菌株ph耐受范围为ph值4
‑
11，适合在海上溢油环境生存，可利用并降解海水中石油，实现海上溢油的微生物降解。又如一种石油降解菌的筛选方法，该方法中使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是以石油作为唯一碳源的培养基，具体的是在培养基中加入石油和聚山梨酯
‑
80。还有一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法，该方法是将经高通量初筛获得的具有石油降解能力的菌株进行细胞破碎制备粗酶液，将粗酶液按体积比1：(90～110)的比例加入石油降解率检测体系中反应，以石油降解率作为筛选指标，筛选菌株即为高效石油降解菌株。再如：一种快速从油污土壤中分离并筛选产表面活性剂石油烃降解纯菌株的方法。首先从油田采集油污土壤，按5％的量添加至原油为唯一碳源并且含量逐渐提高的烃降解培养基中，在恒温摇床上进行富集培养。富集后的菌液稀释到一定程度后在血平板上涂布培养，30℃培养1
‑
3天，取血平板上透明圈边缘清晰而大的菌落，液体肉胨培养基培养后用灭菌牙签钝头蘸取菌液点种于油平板上，30℃培养3天，取噬油斑明显且较大的菌落接种于肉胨斜面并保存备用并用肉胨培养基培养后，先后接种烃降解培养基和产表面活性剂培养基中，30℃培养7天和3天，测定烃降解能力和产表面活性剂的能力，获得产表面活性剂的石油烃降解菌株。由此可知，上述技术方案的重点均在于如何筛选出可降解石油的微生物。
3.又有一种可催化石油的微生物的筛选方法。主要步骤为：将有机氮源、缓冲盐、表面活性剂和固体凝胶在水中混合，得到水溶液，水溶液的初始ph为6.0～8.0；将水溶液高温灭菌后与石油烃混合，得到液态培养基；将液态培养基与含石油催化菌的微生物原液混合后冷却，得到固态培养基；培养固态培养基至出现肉眼可见的菌落后，加入甲基橙、甲基黄、甲基红等ph指示剂溶液。ph指示剂的变色范围为3.0～5.0，若菌落周围的固态培养基变色，则菌落为能够代谢石油并产生酸性物质的石油催化菌。在低浓度有羧酸含量时则不灵敏也无法定量。
4.标准gb/t 18609
‑
2011中，是采用氢氧化钾滴定石油中脂肪酸的含量。其操作特征是：将试样溶解在由甲苯、异丙醇和少量蒸馏水组成的溶剂中，在使用玻璃电极和ag/agcl参比电极的电位滴定仪上，用氢氧化钾异丙醇标准溶液滴定。以电位读数为纵坐标，以滴定所消耗的标准溶液体积作图，取曲线的突跃点为滴定终点，计算石油的酸值。而当所得曲线上无明显突跃点时，取电位计上相应的电位值读数为滴定终点。其滴定所用的脂肪酸萃取溶液至少需要没过电位探头的玻璃泡，这需要至少3至5ml，如此少的溶液采用氢氧化钾滴定法往往难以操作滴定体积，而且不容易做到微量脂肪酸的滴定。
5.在自然界中存在一类微生物，可催化石油中的长链烃类分子产生末端带羧酸基的脂肪酸。生产实际中，对此类微生物的功能的鉴定，只需对这种脂肪酸做总羧基数目的定量，并不需要昂贵的液相或气相手段。但目前缺少这种准确方便直观的技术方法，使之可以提取水相和石油混合液中微量的长链脂肪酸并进行总脂肪酸的显色定量，因而无法简便地鉴定此类微生物催化能力大小。
6.因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。


技术实现要素：

7.本发明目的是提供一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法，解决上述问题。
8.本发明的技术方案是：
9.一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法，该方法包括如下步骤：
10.(1)将石油、曲拉通和水混合，获得初始催化反应液；
11.(2)将需要鉴定的微生物菌体投入所述初始催化反应液中，通过震荡获得最终催化反应液；
12.(3)将三乙醇胺和硝酸铜溶解到水中，获得铜胺溶液；
13.(4)将氯仿和石油醚混合，获得长链脂肪酸萃取剂；
14.(5)称取1,5
‑
二苯基碳酰二肼和对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在甲醇中得到显色剂；
15.(6)吸取所述最终催化反应液到一容器中，加入所述铜胺溶液和所述长链脂肪酸萃取剂，震荡混合并静置，得最终混合液；
16.(7)离心所述最终混合液，获得液体分层，即上层溶液和下层溶液；
17.(8)吸取所述液体分层中的上层溶液到另一容器中，加入所述显色剂后获得显色溶液，通过所述显色溶液的红色深浅判断最终催化反应液中长链脂肪酸的浓度。
18.进一步的，步骤(1)中所述曲拉通选自x
‑
100、x
‑
114或x
‑
405中的任意一种或多种，所述曲拉通在所述初始催化反应液中的浓度为0.1～10g/l。
19.进一步的，步骤(3)中所述三乙醇胺在所述铜胺溶液中的浓度为90～180
20.g/l，所述铜胺溶液的ph值为7.7～8.5。
21.进一步的，步骤(4)中所述氯仿和石油醚的体积比为1:2～1:20。
22.进一步的，步骤(7)中所述上层溶液为含有氯仿和石油醚的长链脂肪酸萃取剂。
23.本发明提供了一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法，该方法具有以下优点：
24.(1)灵敏度高，最低可以检测低至0.025mm浓度的脂肪酸含量。本发明是利用显色测定法，其基本原理是游离长链脂肪酸和碱性铜盐结合成铜皂复合物，在合适的有机溶剂中铜皂复合物中的铜离子进一步和显色剂络合形成红色产物，本发明中红色产物的浓度在吸光值0.1到1.7有良好的线性。当使用1ml的催化反应液样品，最低可以检测到0.025mm的浓度，这相当于25nmol长链脂肪酸的总量。所以，本方法容易做到脂肪酸的微量定量；
25.(2)所需样品量很少，最少可以到50μl。因为显色溶液的吸光值从0.1到1.7有良好
的线性，当使用催化反应液样品中脂肪酸含量超过0.5mm时，采用本发明的技术，可以用50μl的催化反应液样品得到最终显色溶液吸光值可达0.20以上，因而可以定量极微小的样品；
26.(3)对于含有长链脂肪酸的数十个样品，可同时检测、检测操作时间短。采用本技术方法，只需μl级的催化反应液，再加入铜胺溶液和长链脂肪酸萃取剂，震荡使之混合、离心，可使混合液分层和澄清，吸取ml级的最上层溶液到另一容器中，加入显色剂后可显红色，最后进行分光光度法测定。从上面的步骤可以看出，一个人可以同时操作数十个样品的检测，而且长链脂肪酸的定量时间能缩短到30分钟以内；
27.(4)本发明还可以凭借显示红色的深浅，用肉眼定性判断石油催化菌的活性。具体地，催化反应液经本发明提供的方法进行显色，其出现可变色所需的时间越短，红色越深，说明微生物催化石油产生带羧酸基的长链脂肪酸的能力越强。该技术使得用肉眼观察微生物催化石油烷烃类产脂肪酸的能力成为可能，避免了采用液相或气相色谱等昂贵、费时费力的手段进行筛选鉴定。
附图说明
28.图1为本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法在实施例1
‑
8中显色液的峰形扫描曲线图；
29.图2为本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法在实施例1
‑
8中显色后颜色稳定性示意图；
30.图3为本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法在实施例6中的标准曲线图。
具体实施方式
31.一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法，包括：
32.步骤一：配制含有0.1～10g/l的曲拉通、最低为0最高为5.0g/l有机氮源的水溶液，对含有曲拉通和有机氮源的水溶液高温灭菌，待冷却到室温后再加入浓度为0.5～80g/l的石油得到初始催化反应液，其中，石油为含有c5～c24长链烷烃的石油及其提炼物，包括原油、柴油、汽油、煤油等，有机氮源用于支持微生物生长，可以采用蛋白胨、酵母粉、酵母浸出粉、酵母浸膏中的一种或几种，也可以来自微生物样品中自带的成份；
33.步骤二：将需要鉴定的微生物菌体投入初始催化反应液中，震荡一定时间以进行分散和催化反应得到最终催化反应液，其中，需要鉴定的微生物菌体可以来自发酵液或者固体培养基上的微生物菌落或者含有微生物的固体或液体样本；
34.步骤三：将三乙醇胺和硝酸铜溶解到水中，得到铜胺溶液，其中，硝酸铜为三水硝酸铜，分子式为cu(no3)2·
3h2o，在水溶液中的最终浓度为20～45g/l，三乙醇胺浓度为90～180g/l，且三乙醇胺和硝酸铜两者配比使得铜胺溶液的ph为ph7.7～ph8.5；
35.在一些实施实例中，本步骤中硝酸铜的浓度可为30g/l，三乙醇胺的浓度为112g/l，此时铜胺溶液的ph为8.1
±
0.1。
36.步骤四：将氯仿和石油醚混合，氯仿和石油醚的体积比为1:2～1:20，得到长链脂肪酸萃取剂，其中，石油醚比例越高，脂肪酸萃取剂的密度越低，有利于漂浮在水相上层；
37.步骤五：称取1份重量的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和19份重量的对称二苯基偶氮羰酰
肼，溶解在4000份体积的甲醇中得到显色剂；
38.在本步骤中，1,5
‑
二苯基碳酰二肼，也叫1,5
‑
二苯基卡巴肼，其英文名称为1,5
‑
diphenylcabohydrazide，对称二苯基偶氮羰酰肼，也叫对称二苯基卡巴腙，其英文名称为diphenylcarbazone。
39.步骤六：吸取一部分的最终催化反应液到一容器中，加入铜胺溶液和长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒容器100～300次震荡混合，然后静置1～30分钟，得到最终混合液；
40.步骤七：离心最终混合液，使其由浑浊变成澄清的液体且肉眼可见液体分层，混合液分层可以在5ml的塑料离心管中进行，其中，台式离心机的转速设定为4000rpm以上，离心时间至少为20sec；
41.步骤八：吸取液体分层中的一部分最上层溶液到另一容器中，加入显色剂后即可得到显色溶液，显色溶液的红色越浓说明最终催化反应液中的长链脂肪酸类物质越浓。
42.在本步骤中，可以吸取最上层溶液2.0ml，使之与显色剂1.0ml混合后显红色，这样做可方便用普通的1cm光程的比色皿读取显色后的吸光值。
43.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
44.此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
45.实施例1
46.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
47.1)获得催化反应液：取0.1g曲拉通x
‑
114加入到1l自来水中，配制成含0.1g/l曲拉通x
‑
114的水溶液，以100ml/瓶分装摇瓶，于121℃蒸汽灭菌20min，使用前加入柴油62μl/瓶使之最终浓度达0.5g/l，得到初始催化反应液，然后加入需要鉴定的微生物液体样品1ml，于摇床中室温条件下震荡，进行催化反应5小时，获得最终催化反应液。
48.2)配制铜胺溶液：称取40g的cu(no 3
)2·
3h2o溶于1l去离子水中得40g/l的硝酸铜水溶液，称取180g三乙醇胺以去离子水定容至1l得180g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有20g/l的硝酸铜和90g/l三乙醇胺，其最终ph为8.2
±
0.1。
49.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取100ml氯仿和200ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:2。
50.4)配制显色剂：称取0.10g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和1.9g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在400ml的甲醇中得到显色剂。
51.5)吸取1ml最终催化反应液到一支15ml的洁净具塞离心管中，加入1ml铜胺溶液和6ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约200次混合得到混合液，静置5分钟后以5000rpm转速离心20min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置1分钟后于530nm波长下测定显色后的吸光值，挑选吸光值较高的最终催化反应液对应的微生物。
52.实施例2
53.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
54.1)获得催化反应液：取2g曲拉通x
‑
114加入到1l自来水中，配制成含2g/l曲拉通x
‑
114的水溶液，以100ml/瓶分装摇瓶，于121℃蒸汽灭菌20min，使用前加入煤油0.6ml/瓶使初始催化反应液最终浓度达5g/l，然后加入需要鉴定的微生物液体样品5ml，于室温摇床震荡，进行催化反应12小时，获得最终催化反应液。
55.2)配制铜胺溶液：称取40g的cu(no3)2·
3h2o溶于1l去离子水中得40g/l的硝酸铜水溶液，称取224g三乙醇胺以去离子水定容至1l得224g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有20g/l的硝酸铜和110g/l三乙醇胺，其最终ph为8.4
±
0.1。
56.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取500ml氯仿和2000ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:4。
57.4)配制显色剂：称取0.10g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和1.9g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在400ml的甲醇中得到显色剂。
58.5)吸取0.5ml最终催化反应液到一支5ml的洁净具塞离心管中，加入0.5ml铜胺溶液和3ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约300次混合得到混合液，静置15分钟后以8000rpm转速离心0.5min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置5分钟后于530nm波长下测定显色后的吸光值，挑选吸光值较高的最终催化反应液对应的微生物。
59.实施例3
60.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
61.1)获得催化反应液：取10g曲拉通x
‑
100加入到1l自来水中，配制成含10g/l曲拉通x
‑
100的水溶液，以100ml/瓶分装摇瓶，于121℃蒸汽灭菌20min，使用前加入柴油8.8ml/瓶使初始催化反应液最终浓度达70g/l，然后加入需要鉴定的微生物液体样品5ml，于室温摇床震荡，进行催化反应48小时，获得最终催化反应液。
62.2)配制铜胺溶液：称取9g的cu(no3)2·
3h2o以去离子水定容至100ml得90g/l的硝酸铜水溶液，称取22.4g三乙醇胺以去离子水定容至100ml得224g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有45g/l的硝酸铜和110g/l三乙醇胺，其最终ph为7.7
±
0.1。
63.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取50ml氯仿和500ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:10。
64.4)配制显色剂：称取0.05g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和0.95g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在200ml的甲醇中得到显色剂。
65.5)吸取1ml最终催化反应液到一支15ml的洁净具塞离心管中，加入1ml铜胺溶液和4ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约100次混合得到混合液，静置10分钟后以8000rpm转速离心2min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置10分钟后于530nm波长下测定显色后的吸光值，挑选吸光值较高的最终催化反应
液对应的微生物。
66.实施例4
67.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
68.1)获得催化反应液：取5g曲拉通x
‑
100、5g曲拉通x
‑
405和0.2g酵母浸出粉加入到1l自来水中，配制成含5g/l曲拉通x
‑
100、5g/l曲拉通x
‑
405和0.2g/l酵母浸出粉的水溶液，以100ml/瓶分装摇瓶，于115℃蒸汽灭菌30min，使用前加入汽油5ml/瓶使初始催化反应液最终浓度达38g/l，然后加入需要鉴定的微生物液体样品5ml，于室温摇床震荡，进行催化反应24小时，获得最终催化反应液。
69.2)配制铜胺溶液：称取60g的cu(no3)2·
3h2o溶于1l去离子水中得60g/l的硝酸铜水溶液，称取224g三乙醇胺以去离子水定容至1l得224g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有30g/l的硝酸铜和110g/l三乙醇胺，其最终ph为8.1
±
0.1。
70.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取25ml氯仿和500ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:20。
71.4)配制显色剂：称取0.05g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和0.95g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在200ml的甲醇中得到显色剂。
72.5)吸取1ml最终催化反应液到一支15ml的洁净具塞离心管中，加入1ml铜胺溶液和6ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约100次混合得到混合液，静置20分钟后以5000rpm转速离心20min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置2分钟后于530nm波长下测定显色后的吸光值，挑选吸光值较高的最终催化反应液对应的微生物。
73.实施例5
74.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
75.1)获得催化反应液：取1g曲拉通x
‑
405和5g酵母浸膏加入到1l自来水中，配制成含1g/l曲拉通x
‑
405和5g/l酵母浸膏的水溶液，以100ml/瓶分装摇瓶，于121℃蒸汽灭菌30min，使用前加入原油7ml/瓶使初始催化反应液最终浓度达55g/l，加入需要鉴定的微生物液体样品10ml，于室温摇床震荡，进行催化反应96小时，获得最终催化反应液。
76.2)配制铜胺溶液：称取5.0g的cu(no3)2·
3h2o溶于100ml去离子水中得50g/l的硝酸铜水溶液，称取22.4g三乙醇胺以去离子水定容至100ml得224g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有25g/l的硝酸铜和112g/l三乙醇胺，其最终ph为8.2
±
0.1。
77.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取100ml氯仿和500ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:5。
78.4)配制显色剂：称取0.05g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和0.95g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在200ml的甲醇中得到显色剂。
79.5)吸取1ml最终催化反应液到一支15ml的洁净具塞离心管中，加入2ml铜胺溶液和5ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约300次得到混合液，静置5分钟后以5000rpm转速离心
2min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置30分钟后于530nm波长下测定显色后的吸光值，挑选吸光值较高的最终催化反应液对应的微生物。
80.实施例6
81.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
82.1)获得催化反应液：取5g曲拉通x
‑
100和1g酵母浸出粉加入到1l自来水中，配制成含5g/l曲拉通x
‑
100和1g/l酵母浸出粉的水溶液，以100ml/瓶分装到摇瓶中，于121℃蒸汽灭菌20min，使用前加入煤油5ml/瓶摇匀，使煤油在初始催化反应液最终浓度达40g/l，催化反应前，以5ml/管分装到蒸汽灭菌后的50ml离心管中，以八层纱布封口，然后加入需要鉴定的微生物样品到初始催化反应液中，于30℃摇床震荡，进行催化反应72小时，获得最终催化反应液。
83.2)配制铜胺溶液：称取6.5g的cu(no3)2·
3h2o溶于100ml去离子水中得65g/l的硝酸铜水溶液，称取22.4g三乙醇胺以去离子水定容至100ml得224g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有32.5g/l的硝酸铜和112g/l三乙醇胺，其最终ph为8.1
±
0.1。
84.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取100ml氯仿和200ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:2。
85.4)配制显色剂：称取0.05g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和0.95g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在200ml的甲醇中得到显色剂。
86.5)吸取0.50ml最终催化反应液到一支5ml的洁净具塞离心管中，加入0.5ml铜胺溶液和3.0ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约300次得到混合液，静置15分钟后以5000rpm转速离心30sec，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置2分钟后于530nm波长下测定显色后的吸光值，挑选吸光值较高的最终催化反应液对应的微生物。请参阅图3，图3为本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法在实施例6中的标准曲线图。如图3所示，该标准曲线是添加不同浓度的月桂酸到煤油中溶解后再加入水溶液中按操作步骤显色做出的，由此可见在采用实施例6的操作步骤时，在显色1～20分钟内530nm的测定值线性良好，可以用来进行长链脂肪酸月桂酸的精确定量。
87.实施例7
88.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
89.1)获得催化反应液：取1g曲拉通x
‑
405和0.2g蛋白胨加入到1l自来水中，配制成含1g/l曲拉通x
‑
405和0.2g/l蛋白胨的水溶液，以100ml/瓶分装到摇瓶中，于121℃蒸汽灭菌20min，使用前加入汽油5ml/瓶摇匀，使汽油在初始催化反应液最终浓度达38g/l，以5ml/管分装到蒸汽灭菌后的50ml离心管中，以八层纱布封口，然后加入含有要筛选的微生物的样品固体颗粒，于30℃摇床震荡，进行催化反应约120小时，获得最终催化反应液。
90.2)配制铜胺溶液：称取8.2g的cu(no3)2·
3h2o以去离子水定容至100ml得82g/l的硝酸铜水溶液，称取22.4g三乙醇胺以去离子水定容至100ml得224g/l的三乙醇胺水溶液，
两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有41g/l的硝酸铜和112g/l三乙醇胺，其最终ph为7.9
±
0.1。
91.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取100ml氯仿和500ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:5。
92.4)配制显色剂：称取0.05g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和0.95g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在200ml的甲醇中得到显色剂。
93.5)吸取1ml最终催化反应液到一支15ml的洁净具塞离心管中，加入1ml铜胺溶液和6ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约100次得到混合液，静置5分钟后以5000rpm转速离心2min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液1ml到另一玻璃试管中，加入1ml显色剂，混合静置1分钟后观察各个催化反应液显色结果，挑选显色深的最终催化反应液对应的微生物样品。
94.实施例8
95.本实施案例按如下步骤展示一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法：
96.1)获得催化反应液：取10g曲拉通x
‑
114加入到1l海水中，配制成含10g/l曲拉通x
‑
114水溶液，以100ml/瓶分装到摇瓶中，加入原油10ml/瓶摇匀，使原油在初始催化反应液的最终浓度达80g/l，然后加入编号的要筛选的微生物液体样品10ml/瓶，以八层纱布封口，于30℃摇床震荡，进行催化反应约96小时，获得最终催化反应液。
97.2)配制铜胺溶液：称取9.0g的cu(no3)2·
3h2o以去离子水定容至100ml得90g/l的硝酸铜水溶液，称取37.5g三乙醇胺以去离子水定容至100ml得375g/l的三乙醇胺水溶液，两种水溶液等体积混合，所得的铜胺溶液即含有45g/l的硝酸铜和187.5g/l三乙醇胺，其最终ph为8.2
±
0.1。
98.3)配制长链脂肪酸萃取剂：取100ml氯仿和600ml石油醚混合即可，氯仿和石油醚的体积比为1:6。
99.4)配制显色剂：称取0.1g的1,5
‑
二苯基碳酰二肼和1.9g的对称二苯基偶氮羰酰肼，溶解在400ml的甲醇中得到显色剂。
100.5)吸取50μl最终催化反应液到一支15ml的洁净具塞离心管中，加入200μl铜胺溶液和5ml的长链脂肪酸萃取剂，上下颠倒约100次得到混合液，静置5分钟后以8000rpm转速离心2min，使混合液分层并澄清，吸取最上层溶液2ml到另一玻璃试管中，加入2ml显色剂，混合静置1分钟后肉眼观察，挑选显红色较深的最终催化反应液对应的微生物。
101.请参阅1至图2，图1为本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法在实施例1
‑
8中显色液的峰形扫描曲线图；图2为本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法在实施例1
‑
8中显色后颜色稳定性示意图。如图1所示，所述可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物在530nm左右有最大吸收，因此可以采用530nm作为分光光度法定量检测波长。如图2所示，在显色1～20分钟内530nm的测定值较为稳定，衰退的幅度小于5％，因此，建议可以在显色1～20分钟内进行分光光度法定量测定。
102.本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法还有如下的具体优点：
103.(1)该方法在铜胺溶液中采用三乙醇胺的最终浓度为90～180g/l，且铜胺溶液中只有硝酸铜和三乙醇胺两种组分，可以使得铜胺溶液的ph值稳定在7.7～8.5，并且铜胺溶液中不会形成沉淀物，这样做可以使高浓度长链脂肪酸的提取效果同低浓度时一样稳定，从而使该鉴定方法在长链脂肪酸定量检测时呈现良好的线性。
104.在现有技术中，有的铜胺溶液的组分含有乙酸，而本发明方法中的铜胺溶液不含有乙酸成分。用一定浓度的月桂酸作为长链脂肪酸，操作按实施例6进行，得到的乙酸影响最终吸光值的情形请参阅表1：
[0105][0106][0107]
表1
[0108]
如表1所示，乙酸的存在能显著降低显色吸光值。例如2％的乙酸含量降低了约66％的显色吸光值。
[0109]
本发明方法中的铜胺溶液不含有高浓度的氯化钠成分。有的铜胺溶液的组分含有高达300
‑
380g/l的氯化钠，用来增加铜胺溶液的密度。
[0110]
(2)本发明中采用的长链脂肪酸萃取剂可处于水相溶液上层，又能充分提取长链脂肪酸和铜离子的螯合物，从而可方便后继的萃取剂取样，有效杜绝了水相铜离子的影响。
[0111]
氯仿作为一种广泛使用的有机溶剂，不溶于水，其密度比水重，约为1.5g/ml，因而在提取水溶液中的长链脂肪酸时，氯仿是沉在水下的。而石油醚的密度约为0.74g/ml，故而可浮在水溶液上层。针对长链脂肪酸和铜离子的螯合物，氯仿可以高效萃取，但纯的石油醚萃取率又非常低导致显色吸光值约为氯仿的5％左右。因而，我们优化了氯仿与石油醚的体积比，使得两者混合后得到长链脂肪酸萃取剂的密度小于0.95g/ml从而实现上浮，又能够较为完全地萃取催化反应液中的铜离子与长链脂肪酸的螯合物。
[0112]
氯仿和石油醚作为测定中的萃取剂，其比例是有一定的范围的，本发明中提供的优化结果，可以方便地采用简单的离心操作即可快速分离上下层溶液，而且检测结果更为准确。若该萃取剂在水溶液下层，那么取样时的吸管必须通过含有铜离子的水溶液，溶液沾染铜离子从而使显色结果过高。
[0113]
(3)在实施方案中，本发明采用曲拉通x
‑
100、x
‑
114或x
‑
405作为初始催化反应液中石油成分的乳化剂，可对石油进行分散用，这样有利于石油组分与微生物的充分接触，并且其造成显色检测的背景干扰吸光值较低，不会过度影响催化液的显色光度值。根据检测数据显示，即使在10g/l的高浓度下，当使用曲拉通x
‑
100、x
‑
114或x
‑
405作为乳化剂，初始催化反应液的显色吸光值增量均小于0.08。若采用吐温
‑
80作为乳化剂，在1～10g/l浓度
时，初始催化反应液的530nm测定显色吸光值增量为0.2～0.80，会对最终催化反应液的显色造成过高的背景干扰。
[0114]
综上所述，本发明所述的一种可催化石油中烷烃分子产长链脂肪酸的微生物的鉴定方法，可以提取水体和石油混合液中微量的长链脂肪酸并显色，还可以用分光光度法对长链脂肪酸总量来进行定量，这样可用于鉴定微生物催化石油中烷烃类分子产长链脂肪酸的能力大小，并且灵敏度高、操作简单、花费低，还能同时处理多个样品。
[0115]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。