对水牛出生时间进行判断的血液外泌体标志物及其应用的制作方法

【
技术领域：
】本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及对水牛出生时间进行判断的血液外泌体标志物及其应用。
背景技术：
：外泌体(exosome)也被称为多泡小体(multivesicularbodies,mvb),是一类由细胞分泌而来，直径在30到150nm，具有单层膜结构的微小囊泡，它广泛的存在于生物的血浆、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中。近些年来，随着研究的深入，对外泌体的结构大小和形状的了解逐渐清晰，但其参与的生理过程中的分子机制及外泌体内含物的功能研究仍在起步阶段，外泌体研究所涉及的物种也依旧有限。目前，外泌体内含有蛋白质、dna、mrna以及一些非编码rna等多种活性物质，且外泌体的结构大小、形状和密度主要由外泌体的特定蛋白质、脂质、酶和矿物质含量决定。外泌体由细胞内溶酶体微粒内陷形成，包含许多整合膜信号蛋白，包括表皮生长因子受体(egfr)、细胞因子受体和g蛋白偶联受体(gpcr)等，参与细胞间信息的传递，作用于靶细胞进而调节靶细胞蛋白表达及各种信号通路。研究发现，根据外泌体来源的细胞不同，外泌体存在多种不用的功能，包括参与细胞迁移、促血管新生和肿瘤发展及转移、对抗肿瘤、免疫系统的建立及免疫调节等多种生理过程。水牛的犊牛在出生后逐渐建立自身的免疫系统，被动免疫系统的建立主要依赖母乳的补给，而自生免疫系统的成熟是一个复杂的过程。对犊牛自生免疫系统形成过程的研究尚处于一个初级阶段，仍有许多亟待解决的问题。已有报道称，外泌体可以以促进因子的角色参与到免疫应答反应中，还可以在抗原呈递、血管生成和炎性反应等过程中发挥作用。所以，有必要针对初生水牛的外泌体形态进行研究，并对分离的外泌体进行分子生物学特征的分析；即能有效分析初生水牛免疫系统建立过程，同时还能从外泌体蛋白含量角度对初生水牛的生长时间进行分析，可对初生牛犊所处的生长期进行判定，能有效利用该判定更好的对初生牛犊进行饲养和管理。技术实现要素：鉴于上述内容，有必要针对初生水牛的外泌体形态进行研究，并对分离的外泌体进行分子生物学特征的分析；即能有效分析初生水牛免疫系统建立过程，同时还能从外泌体蛋白含量角度对初生水牛的生长时间进行分析，可对初生牛犊所处的生长期进行判定，能有效利用该判定更好的对初生牛犊进行饲养和管理。为达到上述目的，本发明包括对水牛出生时间进行判断的血液外泌体标志物，所述外泌体标志物为标记蛋白calnexin、tsg101、cd9和cd81。进一步的，所述试剂盒包括calnexin、tsg101、cd9和cd81抗体。本发明还包括所述的血液外泌体标志物和所述试剂盒对水牛出生时间进行判断的应用，该应用包括以下步骤：(1)采集出生水牛牛犊的牛全血样本，采用离心法提取水牛血液中的外泌体；(2)对步骤(1)提取到的外泌体进行蛋白印迹检测，当检测出calnexin和tsg101蛋白阳性时，说明：水牛牛犊处于出生0-2h；当未检测出上述四种蛋白时，说明：水牛牛犊为出生3h-11d；当检测出tsg101和cd81蛋白阳性时，说明：水牛牛犊为出生12d以上。进一步的，步骤(1)所述离心法为差速离心法，即：取血清样本，向其中加入的磷酸盐缓冲液，在300g，4℃条件下进行一次离心15min；离心后取上清液，在12000g，4℃条件下进行二次离心40min；离心后取上清液，使其通过滤膜进行过滤；将过滤液在12000g，4℃条件下进行三次离心1.5h，将上清液丢弃保留沉淀；用磷酸盐缓冲液捶打洗涤沉淀，然后在100000g，4℃条件下进行四次离心1h，获取的沉淀即为外泌体。进一步的，步骤(2)所述蛋白印迹检测方法为：向外泌体悬液中添加5xlodaingbuffer混匀，加样本在10％丙烯酰胺凝胶中电泳2h后，使用电转仪将蛋白质转移到pvdf膜上，将转膜后的pvdf膜放到5％脱脂奶粉封闭液中，摇床孵育2h，经1xtbst缓冲液洗脱后，按蛋白质的分子质量进行裁膜，在4℃条件下孵育calnexin、tsg101、cd9、cd81一抗过夜，将pvdf膜取出后进行再次脱洗，加入相应的二抗试剂室温杂交1h，再用1xtbst缓冲液清洗pvdf膜，最后在蛋白呈像系统中进行曝光成像，即得。本发明具有以下有益效果：本申请特异性的针对初生牛犊进行研究，主要是采用全血样本通过对样本中的外泌体研究，判断水牛初生牛犊的免疫系统建立过程，为水牛免疫系统的建立过程进行长足研究，在研究过程中发现，初生牛犊的外泌体，随着免疫系统的建立其蛋白质的含量、种类都有很大差别，根据外泌体的变化情况，可将牛犊的出生时间划分为：出生2h内，出生3h-11d，出生12d以上，通过针对上述时间段外泌体蛋白的研究发现：当检测出calnexin和tsg101蛋白阳性时，说明：水牛牛犊处于出生0-2h；当未检测出上述四种蛋白时，说明：水牛牛犊为出生3h-11d；当检测出tsg101和cd81蛋白阳性时，说明：水牛牛犊为出生12d以上；采用上述蛋白印迹检测方法能有效的对初生牛犊的出生时间进行划分，对后期的免疫研究、管理、饲养等都起到了良好的指示作用。【附图说明】图1为出生2h的水牛牛犊在电镜下的血液外泌体的形态图；图2为出生5d的水牛牛犊在电镜下的血液外泌体的形态图；图3为出生12d的水牛牛犊在电镜下的血液外泌体的形态图图4为不同出生时期犊牛样本的外泌体直径结果图；图5为不同出生时期犊牛外泌体的westernblot蛋白印迹检测结果图。【具体实施方式】下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。实施例1：1、试剂及仪器：edta抗凝采血管购于美国bd公司；l-100xp低温超速离心机购自美国beckman公司；totalexosomeisolation(00520032)购自invitrogen公司；透射电镜(h7650)购自日本hitachi公司；纳米粒度及zeta电位仪(nanozs90)购于英国马尔文公司；pbs缓冲液购于以色列biologicalindustries公司；calnexin抗体(ac018-1)、tsg101抗体(af8259)、cd9抗体(af1192)和cd81抗体(af2428)购于上海碧云天生物技术有限公司。2、分时取样：选取分娩的摩拉水牛水牛牛犊9头，出生24h内，每隔2小时进行一次采样、在出生第2d，每天进行一次采样直至出生第14d；采集过程如下：使用edta抗凝采血管分别采集3头水牛犊牛全血样本，每只水牛采集的血液样本不少于10ml，采集后将采血管上下颠倒混匀8-10，对采集的全血进行离心，采用水平转子离心机，将采血管与其他离心管配平，1900g(3000rpm)，4℃离心10min。用移液枪吸取上层血浆到新的尖底离心管中(约4-5ml血浆)，3000g，4℃离心15min。吸取上清液到新的15ml离心管中，颠倒混匀后分装到1.5ml或2ml离心管中，储存在-20℃的环境中。3、外泌体提取：使用差速离心法提取水牛血液中的外泌体。取2ml血清样本，向其中加入13ml的磷酸盐缓冲液(pbs)后，300g，4℃离心15min。初步离心后取上清液，12000g，4℃离心40min。离心后取上清液，使其通过滤膜进行过滤。将过滤液超速离心，12000g，4℃离心1.5h，将上清液丢弃保留沉淀。用pbs捶打洗涤沉淀，然后100000g，4℃离心1h，获取的沉淀即为外泌体。针对上述样品对外泌体进行电子显微镜镜检、对外泌体粒径进行分析、对特异性蛋白标志物进行westernblot蛋白印迹检测；在申请人的实验中发现：在水牛牛犊生出生其血液中的外泌体蛋白变化不一样，根据实验结果可将实验样本分为3个时期：即水牛牛犊处于出生0-2h、水牛牛犊为出生3h-11d、水牛牛犊为出生12d以上；申请人选取3个最具有代表性的外泌体蛋白时期进行模型实验，分别为：水牛a：水牛牛犊处于出生第2h、水牛b：水牛牛犊出生第5d、水牛c：水牛牛犊出生第12d。检验及实验过程如下：1、电子显微镜鉴定外泌体：将样本离心，吸取10μl样品滴加到铜网上，静置数分钟后使用滤纸吸取样本的多余浮液。将10μl磷钨酸滴加到铜网上室温染色1min后，用滤纸吸去浮液，干燥数分钟后，放到透射电子显微镜下80kv-120kv成像，鉴定样本中囊泡的物理特征，包括形态、直径大小和膜结构，鉴定结果如图1-图3；图1-图3分别为：水牛牛犊出生2h、水牛牛犊出生第5d、水牛牛犊出生第12d的外泌体形态，从图中可见，在3个时期水牛牛犊的外泌体形态大小不一，呈现类似圆形或椭圆形，直径约为30～150nm差别较大。2、外泌体粒径分析吸取10μl提取的外泌体样本，使用1xpbs缓冲液稀释样本，用纳米粒度和zeta电位仪对外泌体进行粒径分析，测定样本中外泌体的粒径大小，进一步鉴定外泌体的分布情况。实验过程温度保持在23℃到37℃。其结果如图4所示，图4为样本外泌体的直径，中从左到右分别为水牛a、水牛b、水牛c；从图4中显示：水牛a血液样品的外泌体直径峰值为132.2nm，直径集中在(132。2±90.8)nm之间的颗粒占96.5％；水牛b血液样品的外泌体直径峰值为123.1nm，直径集中在(123.1±79.6)nm之间的颗粒占98.2％；水牛c血液样品的外泌体直径峰值为112.6nm，直径集中在(112.6±58.3)nm之间的颗粒占95.3％。三个样品均符合外泌体直径大小，且从峰值来看，水牛a、水牛b和水牛c的外泌体其直径峰值差别较大，说明，可能在分娩后不同时期，动物血液中的外泌体蛋白不一致。针对上述两个实验的观察，发现：水牛出生不同时期，其血液中外泌体蛋白不一致，因此针对蛋白质进行标记检测，方法和结果如下：首先，采用bca方法对样本中的蛋白浓度进行测定。然后，向外泌体悬液中添加适量的5xlodaingbuffer混匀。加样本在10％丙烯酰胺凝胶中电泳2h后，使用电转仪(100v电压，60min)将蛋白质转移到pvdf膜上。将转膜后的pvdf膜放到5％脱脂奶粉封闭液中，摇床孵育2h。经1xtbst缓冲液洗脱后，按蛋白质的分子质量进行裁膜，在4℃条件下孵育calnexin、tsg101、cd9、cd81一抗过夜。将pvdf膜取出后进行再次脱洗，加入相应的二抗试剂室温杂交1h，再用1xtbst缓冲液清洗pvdf膜。最后在蛋白呈像系统中进行曝光成像；结果见表1和图5：表1外泌体样本的蛋白浓度样本名称水牛a水牛b水牛cod560nm0.1600.1860.398cug/ul0.500.712.35mug27.7738.86129.30由表1结果显示，三个样本中蛋白浓度分别为0.50、0.71、2.35ug/ul。采用westernblot检测三个样本外泌体表面标记蛋白，结果如图5显示，水牛a(为牛犊出生2h的血液样本)外泌体膜上calnexin和tsg101蛋白阳性；水牛b(为牛犊出生5d的血液样本)外泌体膜上未检测到四种蛋白；水牛c(为牛犊出生12d的血液样本)外泌体膜上tsg101和cd81蛋白阳性；因此，就本申请而言，通过蛋白印迹检测外泌体中的蛋白：calnexin、tsg101、cd9和cd81的类型就能很好的实现对水牛出生时间的分型。综上所述，外泌体是细胞外环境的重要组成部分，它可以传递信号和分子到邻近细胞，参与重要的生物学过程。本研究首次专注于初生犊牛不同生长期水牛血液细胞中外泌体的分离，并进行其分子生物学特征的鉴定，发现了3个特征时期，并根据特征时期通过蛋白印迹法对其进行分型，为今后初生牛犊的免疫功能、外泌体功能、饲养和管理都提供了较为准确的时期分型基础。在研究过程中，申请发现：使用差速离心法相较于其他的外泌体提取方法，差速离心法获得的外泌体纯度较高。另外，有研究发现，差速离心法提取的外泌体中，microrna的含量较为丰富。本研究中获得的水牛血液外泌体形态结构得到很好的保留，在透射电子显微镜下可见圆形或椭圆形的微小囊泡，粒径分析结果显示其粒径在100nm左右，与已报到的外泌体形态相符。外泌体内存在多种类型的内含物，通过对初生牛犊外泌体内含物的研究，申请人发现发现新生犊牛的被动免疫系统的建立依赖出生后及时补给的初乳，而犊牛自生免疫系统的建立和成熟是个相对复杂的过程。细胞外泌在以往的研究中表明其参与了细胞的免疫调节过程，故深入探索犊牛从出生及初乳后细胞外泌体smallrna的变化情况，有助于预测其调控的靶基因，从而为从分子层面解析犊牛自生免疫系统构建提供依据。同时根据其蛋白产生时期，有助于研究水牛的免疫系统建立过程，为今后的水牛饲养、管理提供更科学、精准的依据，为水牛犊牛免疫系统的研究提供了重要的分子基础。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12