L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺的分离检测方法及应用与流程

l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺的分离检测方法及应用
技术领域
1.本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺的分离检测方法及应用。


背景技术：

2.l-谷氨酰胺是一种氨基酸，可用于治疗胃及十二指肠溃疡、胃炎及胃酸过多，也用于改善脑功能。l-谷氨酰胺是合成甘氨酰-l-谷氨酰胺的原料，而甘氨酰-l-谷氨酰胺又是复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的原料药。鉴于控制原料药起始物料杂质对于终产物甘氨酰-l-谷氨酰胺的质量至关重要，对其原料的质量控制直接影响到制剂终产品的质量。因此，为更好控制原料药及制剂的质量，对l-谷氨酰胺的杂质研究尤为重要。
3.d-谷氨酰胺为l-谷氨酰胺的光学异构体，两者极性相近，利用普通液相色谱洗脱体系进行检测，难以对两者进行有效的分离。目前谷氨酰胺原料在中国药典2015、美国药典usp40和日本药典jp17均有收载，但是各药典均未涉及异构体d-谷氨酰胺的检测。该杂质及其检测方法也尚未有文献报道。故本发明对甘氨酰-l-谷氨酰胺原料药及其制剂质量控制有着重要意义。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺的分离检测方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
6.作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺的分离检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用手性色谱柱；以高氯酸水溶液-甲醇为流动相；等度洗脱；
7.所述l-谷氨酸的结构式如下：
[0008][0009]
所述d-谷氨酸的结构式如下：
[0010][0011]
进一步的，所述高氯酸水溶液的ph＝1.2-1.8。
[0012]
进一步的，所述高氯酸水溶液与甲醇的体积比为(75-85)：(15-25)。
[0013]
进一步的，所用检测器为紫外检测器，检测波长为190-210nm。
[0014]
进一步的，所用柱温为20-30℃。
[0015]
进一步的，所用流速为0.1-0.3ml/min。
[0016]
进一步的，所述手性色谱柱以共价键合手性冠醚硅胶为填充剂。
[0017]
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用日本大赛璐公司的crownpak cr-i(+)-ui021色谱柱；以ph＝1.3-1.6的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为(78-83)：(17-22)；所用检测器为紫外检测器，检测波长为195-205nm；所用柱温为22-28℃；所用流速为0.15-0.25ml/min；等度洗脱。
[0018]
进一步的，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用日本大赛璐公司的crownpak cr-i(+)-ui021色谱柱；以ph＝1.5的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为80：20；所用检测器为紫外检测器，检测波长为200nm；所用柱温为25℃；所用流速为0.2ml/min；等度洗脱。
[0019]
作为本发明的第二个方面，本发明还提供了上述分离检测方法在甘氨酰-l-谷氨酰胺原料药或其制剂的质量控制中的应用。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0021]
本发明提供的l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺的分离检测方法，通过对流动相、色谱柱的优化设计，使l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺达到有效分离，且分离度良好，不受其他杂质干扰。经过系统方法学验证，专属性强、灵敏度高，可用于甘氨酰-l-谷氨酰胺原料药或其制剂中d-谷氨酰胺的分离检测，提高了氨基酸注射液的安全性和有效性。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]
图1为实施例1-1中l-谷氨酰胺定位溶液的hplc谱图；
[0024]
图2为实施例1-1中d-谷氨酰胺定位溶液的hplc谱图；
[0025]
图3为实施例1-1中空白溶剂的hplc谱图；
[0026]
图4为实施例1-1中混合溶液的hplc谱图；
[0027]
图5为实施例2中l-谷氨酰胺检测限的hplc谱图；
[0028]
图6为实施例2中l-谷氨酰胺定量限的hplc谱图；
[0029]
图7为实施例2中d-谷氨酰胺检测限的hplc谱图；
[0030]
图8为实施例2中d-谷氨酰胺定量限的hplc谱图；
[0031]
图9为对照实施例1中混合溶液的hplc谱图；
[0032]
图10为对照实施例2中混合溶液的hplc谱图；
[0033]
图11为对照实施例3中混合溶液的hplc谱图。
具体实施方式
[0034]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获
得的常规产品。
[0035]
l-谷氨酰胺对照品为自制对照品，来自天津药业研究院股份有限公司。
[0036]
d-谷氨酰胺对照品为外购对照品，来自天津市九川科技有限公司。
[0037]
实施例1专属性试验
[0038]
l-谷氨酰胺定位溶液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为l-谷氨酰胺定位溶液。
[0039]
d-谷氨酰胺定位溶液：取d-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为d-谷氨酰胺定位溶液。
[0040]
混合溶液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入d-谷氨酰胺定位溶液0.15ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
[0041]
空白溶剂：流动相。
[0042]
实施例1-1
[0043]
色谱条件：
[0044]
色谱柱：crownpak cr-i(+)-ui021(150mm
×
3mm，5μm)；
[0045]
流动相：以ph＝1.5的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为80：20；
[0046]
检测波长：紫外检测器，检测波长为200nm；
[0047]
流速：0.2ml/min；
[0048]
柱温：25℃；
[0049]
进样量：1μl；
[0050]
等度洗脱。
[0051]
l-谷氨酰胺定位溶液的hplc谱图如图1所示。
[0052]
由图1可知，l-谷氨酰胺的保留时间为4.465min。
[0053]
d-谷氨酰胺定位溶液的hplc谱图如图2所示。
[0054]
由图2可知，d-谷氨酰胺的保留时间为3.762min。
[0055]
空白溶剂的hplc谱图如图3所示。
[0056]
混合溶液的hplc谱图如图4所示，检测数据如表1所示。
[0057]
表1混合溶液检测结果
[0058][0059]
由图3和表1可知，l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺完全分离，且相互之间无干扰。
[0060]
实施例1-2
[0061]
色谱条件：
[0062]
色谱柱：crownpak cr-i(+)-ui021(150mm
×
3mm，5μm)；
[0063]
流动相：以ph＝1.3的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为83：17；
[0064]
检测波长：紫外检测器，检测波长为195nm；
[0065]
流速：0.25ml/min；
[0066]
柱温：22℃；
[0067]
进样量：1μl；
[0068]
等度洗脱。
[0069]
混合溶液检测数据如表2所示。
[0070]
表2混合溶液检测结果
[0071][0072]
由表2可知，l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺完全分离，且相互之间无干扰。
[0073]
实施例1-3
[0074]
色谱条件：
[0075]
色谱柱：crownpak cr-i(+)-ui021(150mm
×
3mm，5μm)；
[0076]
流动相：以ph＝1.6的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为78：22；
[0077]
检测波长：紫外检测器，检测波长为205nm；
[0078]
流速：0.15ml/min；
[0079]
柱温：28℃；
[0080]
进样量：1μl；
[0081]
等度洗脱。
[0082]
混合溶液检测数据如表3所示。
[0083]
表3混合溶液检测结果
[0084][0085]
由表3可知，l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺之间的分离度大于1.5，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺完全分离，且相互之间无干扰。
[0086]
实施例1-4
[0087]
色谱条件：
[0088]
色谱柱：crownpak cr-i(+)-ui021(150mm
×
3mm，5μm)；
[0089]
流动相：以ph＝1.2的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为85：15；
[0090]
检测波长：紫外检测器，检测波长为190nm；
[0091]
流速：0.1ml/min；
[0092]
柱温：20℃；
[0093]
进样量：1μl；
[0094]
等度洗脱。
[0095]
混合溶液检测数据如表4所示。
[0096]
表4混合溶液检测结果
[0097][0098]
由表4可知，l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺完全分离，且相互之间无干扰。
[0099]
实施例1-5
[0100]
色谱条件：
[0101]
色谱柱：crownpak cr-i(+)-ui021(150mm
×
3mm，5μm)；
[0102]
流动相：以ph＝1.8的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为75：25；
[0103]
检测波长：紫外检测器，检测波长为210nm；
[0104]
流速：0.3ml/min；
[0105]
柱温：30℃；
[0106]
进样量：1μl；
[0107]
等度洗脱。
[0108]
混合溶液检测数据如表5所示。
[0109]
表5混合溶液检测结果
[0110][0111]
由表5可知，l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺之间的分离度大于2，符合要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将l-谷氨酰胺与d-谷氨酰胺完全分离，且相互之间无干扰。
[0112]
实施例2灵敏度试验
[0113]
溶液配制：
[0114]
l-谷氨酰胺对照品储备液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为l-谷氨酰胺对照品储备液；
[0115]
d-谷氨酰胺对照品储备液：取d-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为d-谷氨酰胺对照品储备液。
[0116]
色谱条件：
[0117]
色谱柱：crownpak cr-i(+)-ui021(150mm
×
3mm，5μm)；
[0118]
流动相：以ph＝1.5的高氯酸水溶液-甲醇为流动相，两者的体积比为80：20；
[0119]
检测波长：紫外检测器，检测波长为200nm；
[0120]
流速：0.2ml/min；
[0121]
柱温：25℃；
[0122]
进样量：1μl；
[0123]
等度洗脱。
[0124]
根据信噪比法来确定检测限和定量限，将用已知浓度的储备液逐级稀释，当s/n≈10时，为定量限浓度，当s/n≈3时，为检测限浓度。l-谷氨酰胺检测限的hplc谱图如图5所示，l-谷氨酰胺定量限的hplc谱图如图6所示，d-谷氨酰胺检测限的hplc谱图如图7所示，d-谷氨酰胺定量限的hplc谱图如图8所示，检测数据如表6所示。
[0125]
表6检测限(lod)、定量限(loq)结果
[0126][0127]
由图5-8和表6可知，当l-谷氨酰胺的浓度为0.1038μg/ml时，信噪比大于3，当d-谷氨酰胺的浓度为0.1031μg/ml时，信噪比大于3，符合检测限要求；当l-谷氨酰胺的浓度为0.4152μg/ml时，信噪比大于10，当d-谷氨酰胺的浓度为0.4124μg/ml时，信噪比大于10，符合定量限要求。
[0128]
对照实施例1
[0129]
l-谷氨酰胺定位溶液：取l-谷氨酰胺对照品约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为l-谷氨酰胺定位溶液。
[0130]
d-谷氨酰胺定位溶液：取d-谷氨酰胺对照品约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为d-谷氨酰胺定位溶液。
[0131]
混合溶液：取l-谷氨酰胺对照品约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入d-谷氨酰胺定位溶液0.1ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
[0132]
色谱条件：
[0133]
色谱柱：以十八烷基硅胶键合硅胶为填充剂agela mp c18(250
×
4.6mm，5μm)
[0134]
流动相：以辛烷磺酸钠溶液(取辛烷磺酸钠0.865g，加水1000ml溶解，加磷酸0.5ml，混匀)-乙腈为流动相，两者的体积比为95：5；
[0135]
检测波长：紫外检测器，检测波长为210nm；
[0136]
流速：1.0ml/min；
[0137]
柱温：30℃；
[0138]
进样量：20μl；
[0139]
等度洗脱。
[0140]
混合溶液的hplc谱图如图9。
[0141]
由图9可知，l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺保留时间均为9.62min，两者保留时间重合，不能分离。
[0142]
对照实施例2
[0143]
l-谷氨酰胺定位溶液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为l-谷氨酰胺定位溶液。
[0144]
d-谷氨酰胺定位溶液：取d-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为d-谷氨酰胺定位溶液。
[0145]
混合溶液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入d-谷氨酰胺定位溶液0.15ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
[0146]
空白溶剂：流动相。
[0147]
色谱条件：
[0148]
本对照实施例的色谱条件与实施例1的不同之处在于，色谱柱：agilent pursuit 5pfp(4.6mm
×
250mm，5μm)；其他条件均相同。
[0149]
混合溶液的hplc谱图如图10。
[0150]
由图10可知，l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺保留时间均为11.02min，两者保留时间重合，不能分离。
[0151]
对照实施例3
[0152]
l-谷氨酰胺定位溶液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为l-谷氨酰胺定位溶液。
[0153]
d-谷氨酰胺定位溶液：取d-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为d-谷氨酰胺定位溶液。
[0154]
混合溶液：取l-谷氨酰胺对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入d-谷氨酰胺定位溶液0.15ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
[0155]
色谱条件：
[0156]
色谱柱：以氨基硅胶键合硅胶为填充剂agilentnh2(250
×
4.6mm，5μm)；
[0157]
流动相：0.05mol/l磷酸二氢钠溶液(7.8g二水合磷酸二氢钠加水1000ml用磷酸调节ph值至4.5)-乙腈为流动相，两者的体积比为40：60；
[0158]
检测波长：紫外检测器，检测波长为210nm；
[0159]
流速：1.0ml/min；
[0160]
柱温：30℃；
[0161]
进样量：20μl；
[0162]
等度洗脱。
[0163]
混合溶液的hplc谱图如图11。
[0164]
由图11可知，l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺保留时间均为3.71min，两者保留时间重合，不能分离。
[0165]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。