同时检测杂质G和杂质H含量的方法和应用与流程

同时检测杂质g和杂质h含量的方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及一种同时检测杂质g和杂质h含量的方法和应用。


背景技术：

2.噻托溴铵，化学名为(1α,2β,4β,5α,7β)-7-[2-羟基-2,2-二(2-噻吩基)-乙酰氧基]-9,9-二甲基-3-环氧-9-氮阳离子三环[3.3.1.02,4]壬烷溴化物，是由德国柏林格殷格翰公司研发，与辉瑞公司共同销售，2002年6月在荷兰和菲律宾首次上市，商品名为spiriva。噻托溴铵是一种支气管扩张剂，适用于慢性阻塞性肺疾病(copd)的维持治疗，包括慢性支气管炎和肺气肿，伴随性呼吸困难的维持治疗及急性发作的预防，改善copd患者的生活质量，能够减少copd急性加重。
[0003]
噻托溴铵在合成或储存过程中，会产生相应的降解产物杂质g、杂质h，准确检测这两种杂质的含量有利于噻托溴铵原料药的质量控制。杂质g的结构式如下：
[0004][0005]
杂质h结构式如下：
[0006][0007]
文献1(hplc法测定噻托溴铵及有关物质；药学与临床研究；2007,15(2),124-126)中采用甲醇-磷酸盐缓冲液体系hplc法研究了噻托溴铵工艺中可能存在的起始原料及两种中间体的含量检测方法。文献2(噻托溴铵及其有关物质的hplc法测定，中国医药工业杂志，2015，46(12),1327-1329)中采用含三乙胺的辛烷磺酸钠溶液体系hplc法研究了噻托溴铵及六种中间体的含量检测方法。文献3(rp-hplc法测定噻托溴铵原料药中有关物质及其粉雾剂中主药的含量，中国药房，2009,20(25),1980-1981)中采用含三乙胺的磷酸溶液体系hplc法研究了噻托溴铵及有关物质的含量检测方法。文献4(bhairam bhoomaiah and anireddy jayasree.simultaneous quantification of olodaterol and tiotropium bromide by high performance liquid chromatograohy,asian journal of chemistry,vol.29,no.1(2017),145-148)采用磷酸盐-甲醇(v/v，55:45)缓冲体系逆相hplc法研究了同时定量测定奥达特罗和噻托溴铵含量的检测方法。文献5(k.srinivasu,j.venkateswara rao,n.appala raju,et al.simultaneous rp-hplc method for the estimation of formoterol fumarate and tiotropium bromide in pharmaceutical dosage forms.asian journal ofchemistry,vol.22,no.5(2010),3943-3948.)采用磷酸二氢钾-乙腈(v/v，65:35)缓冲体系逆相hplc法研究了同时定量测定rotacaps中富马酸福莫特罗和
噻托溴铵含量的检测方法。文献6(li ding,wenming tan,yindi zhang,et al.sensitive hplc
–
esi-ms method for the determination of tiotropium in human plasma.journal ofchromatographic science,vol.46,may/june 2008)采用醋酸铵-甲醇(v/v，56:44)缓冲体系hplc-esi-ms法人血浆中噻托溴铵含量的检测方法。上述文献中均未涉及到杂质g、杂质h的相关报道。
[0008]
由于该两种杂质均无紫外吸收，利用普通液相色谱洗脱体系进行检测，难以对两者进行有效的分离。目前噻托溴铵原料药在ep10.0、bp2020均有收载，但是各药典均未涉及该两种杂质的含量检测。故本发明对噻托溴铵原料药质量控制有着重要意义。
[0009]
有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0010]
本发明的主要目的在于提供一种同时检测杂质g和杂质h含量的方法和应用，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
[0011]
作为本发明的第一个方面，本发明提供了一种同时检测杂质g和杂质h含量的方法，采用lc-ms/ms联用法检测，所述杂质g的结构式如下：
[0012][0013]
所述杂质h的结构式如下：
[0014][0015]
进一步的，液相色谱条件包括：采用强酸性阳离子交换键合硅胶为填充剂的色谱柱；以醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相；等度洗脱。
[0016]
进一步的，采用0.01-0.03mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至3.8-4.2。
[0017]
进一步的，所述醋酸铵缓冲液与乙腈的体积比为(10-20)：(80-90)。
[0018]
进一步的，所用柱温为25-35℃。
[0019]
进一步的，所用流速为0.8-1.2ml/min。
[0020]
进一步的，质谱条件包括：采用三重四级杆质谱仪，
[0021]
离子源：esi(+)；
[0022]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0023]
毛细管电压：500-1000v；
[0024]
锥孔电压：10-50v；
[0025]
脱溶剂气温度：350-600℃；
[0026]
脱溶剂气流量：500-800l/hr；
[0027]
碰撞气：氩气；
[0028]
杂质g定量离子：170.1；
[0029]
杂质h定量离子：170.1。
[0030]
进一步的，采用lc-ms/ms联用法检测，
[0031]
所述液相色谱条件包括：
[0032]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0033]
流动相：0.01-0.02mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为10-15：85-90，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至3.8-4；
[0034]
柱温：25-30℃；
[0035]
流速：1.0-1.2ml/min；
[0036]
洗脱方式：等度洗脱；
[0037]
所述质谱条件包括：采用三重四级杆质谱仪，
[0038]
离子源：esi(+)；
[0039]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0040]
毛细管电压：800-1000v；
[0041]
锥孔电压：30-50v；
[0042]
脱溶剂气温度：350-500℃；
[0043]
脱溶剂气流量：500-700l/hr；
[0044]
碰撞气：氩气；
[0045]
杂质g定量离子：170.1；
[0046]
杂质h定量离子：170.1。
[0047]
进一步的，采用lc-ms/ms联用法检测，
[0048]
所述液相色谱条件包括：
[0049]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0050]
流动相：0.01mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为15：85，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至4；
[0051]
柱温：30℃；
[0052]
流速：1.0ml/min；
[0053]
洗脱方式：等度洗脱；
[0054]
所述质谱条件包括：采用三重四级杆质谱仪，
[0055]
离子源：esi(+)；
[0056]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0057]
毛细管电压：800v；
[0058]
锥孔电压：30v；
[0059]
脱溶剂气温度：500℃；
[0060]
脱溶剂气流量：700l/hr；
[0061]
碰撞气：氩气；
[0062]
杂质g定量离子：170.1；
[0063]
杂质h定量离子：170.1。
[0064]
作为本发明的第二个方面，本发明还提供了上述检测方法在噻托溴铵原料药或其制剂的质量控制中的应用。
[0065]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0066]
本发明提供的同时检测杂质g和杂质h含量的方法，首次建立了lc-ms/ms方法同时定量测定杂质g、杂质h，通过对流动相、色谱柱的优化设计，使杂质g、杂质h达到有效分离。经过系统方法学验证，可用于噻托溴铵原料药中杂质g、杂质h含量的检测。具有操作简便、专属性强、灵敏度高、耐用性好、含量检测准确、检测时间较短等优点，对于噻托溴铵原料药中杂质g、杂质h的有效控制具有重要意义。
附图说明
[0067]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0068]
图1为实施例1-1中空白溶剂的色谱图；
[0069]
图2为实施例1-1、实施例3-1中杂质混合对照品溶液的色谱图；
[0070]
图3为实施例1-1、实施例3-1中供试品溶液的色谱图；
[0071]
图4为实施例2中定量限溶液的色谱图；
[0072]
图5为实施例2中检测限溶液的色谱图；
[0073]
图6为实施例3-2中混合对照品溶液色谱图；
[0074]
图7为实施例3-2中供试品溶液色谱图；
[0075]
图8为实施例3-3中混合对照品溶液色谱图；
[0076]
图9为实施例3-3中供试品溶液色谱图；
[0077]
图10为实施例3-4中混合对照品溶液色谱图；
[0078]
图11为实施例3-4中供试品溶液色谱图；
[0079]
图12为实施例3-5中混合对照品溶液色谱图；
[0080]
图13为实施例3-5中供试品溶液色谱图；
[0081]
图14为实施例3-6中混合对照品溶液色谱图；
[0082]
图15为实施例3-6中供试品溶液色谱图；
[0083]
图16为实施例3-7中混合对照品溶液色谱图；
[0084]
图17为实施例3-7中供试品溶液色谱图；
[0085]
图18为实施例3-8中混合对照品溶液色谱图；
[0086]
图19为实施例3-8中供试品溶液色谱图；
[0087]
图20为实施例3-9中混合对照品溶液色谱图；
[0088]
图21为实施例3-9中供试品溶液色谱图。
具体实施方式
[0089]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0090]
杂质g对照品、杂质h对照品来自天津药业研究院股份有限公司。
[0091]
实施例1专属性试验
[0092]
(1)稀释液配制
[0093]
稀释剂1(1mol/l盐酸溶液)：精密移取8.3ml盐酸于100ml容量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀备用。
[0094]
稀释剂2：精密称取25.73mg乙二胺四醋酸二钠(edta)于200ml水中，再加入10ml稀释剂1，加水至1l，摇匀备用，同时作为空白溶剂。
[0095]
稀释剂3(0.01mol/l盐酸溶液)：精密移取0.83ml盐酸于1000ml水中，摇匀备用。
[0096]
(2)流动相配制
[0097]
流动相a(醋酸铵缓冲液)：精密称取0.77g醋酸铵至1000ml水中，振摇溶解，用冰醋酸调节ph至4备用。
[0098]
流动相b：乙腈。
[0099]
(3)杂质g单标对照品溶液配制
[0100]
精密称取杂质g对照品11.27mg于10ml容量瓶中，用稀释剂3稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为对照品储备液g-1。
[0101]
(4)杂质h单标对照品溶液配制
[0102]
精密称取杂质h对照品11.22mg于10ml容量瓶中，用稀释剂3稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为对照品储备液h-1。
[0103]
(5)杂质混合对照品溶液配制
[0104]
分别精密移取5ml对照品储备液g-1与5ml对照品储备液h-1于100ml容量瓶中，用稀释剂3稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为std-2。
[0105]
精密移取5ml std-2溶液于100ml容量瓶中，用稀释剂3稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为std-3。
[0106]
精密移取1ml std-3溶液于10ml容量瓶中，用稀释剂2稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为l-3。
[0107]
(5)供试品溶液配制
[0108]
精密称取噻托溴铵供试品6ml于50ml容量瓶，用稀释剂2稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为s_1。
[0109]
实施例1-1
[0110]
检测条件：
[0111]
采用lc-ms/ms联用法检测，
[0112]
所述液相色谱条件包括：
[0113]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0114]
流动相：0.01mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为15：85，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至4；
[0115]
柱温：30℃；
[0116]
流速：1.0ml/min；
[0117]
洗脱方式：等度洗脱；
[0118]
进样量：1μl；
[0119]
所述质谱条件包括：
[0120]
离子源：esi(+)；
[0121]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0122]
毛细管电压：800v；
[0123]
锥孔电压：30v；
[0124]
脱溶剂气温度：500℃；
[0125]
脱溶剂气流量：700l/hr；
[0126]
碰撞气：氩气；
[0127]
杂质g定量离子：170.1；
[0128]
杂质h定量离子：170.1。
[0129]
分别进样一针空白溶剂、一针杂质混合对照品l-3溶液、一针s_1供试品溶液、考察杂质g与杂质h的分离度。
[0130]
专属性试验结果：
[0131]
空白溶剂的色谱图如图1所示。
[0132]
杂质混合对照品溶液的色谱图如图2所示，检测数据如表1所示。
[0133]
供试品溶液的色谱图如图3所示。
[0134]
表1混合对照品溶液检测结果
[0135][0136][0137]
由图2和表1可知，空白溶剂对杂质测定无干扰，杂质h与杂质g分离度大于1.5，符合验证要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将杂质h与杂质g完全分离，且相互之间无干扰。
[0138]
实施例1-2
[0139]
检测条件：
[0140]
采用lc-ms/ms联用法检测，
[0141]
所述液相色谱条件包括：
[0142]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0143]
流动相：0.01mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为10：90，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至3.8；
[0144]
柱温：30℃；
[0145]
流速：1.0ml/min；
[0146]
洗脱方式：等度洗脱；
[0147]
进样量：1μl；
[0148]
所述质谱条件包括：
[0149]
离子源：esi(+)；
[0150]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0151]
毛细管电压：1000v；
[0152]
锥孔电压：30v；
[0153]
脱溶剂气温度：350℃；
[0154]
脱溶剂气流量：700l/hr；
[0155]
碰撞气：氩气；
[0156]
杂质g定量离子：170.1；
[0157]
杂质h定量离子：170.1。
[0158]
专属性试验结果：
[0159]
混合对照溶液检测数据如表2所示。
[0160]
表2混合对照品溶液检测结果
[0161]
物质名称保留时间(min)分离度拖尾因子杂质h10.862.11.15杂质g12.782.11.15
[0162]
由表2可知，空白溶剂对杂质测定无干扰，杂质h与杂质g分离度大于1.5，符合验证要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将杂质h与杂质g完全分离，且相互之间无干扰。
[0163]
实施例1-3
[0164]
检测条件：
[0165]
采用lc-ms/ms联用法检测，
[0166]
所述液相色谱条件包括：
[0167]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0168]
流动相：0.02mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为15：85，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至4；
[0169]
柱温：25℃；
[0170]
流速：1.2ml/min；
[0171]
洗脱方式：等度洗脱；
[0172]
进样量：1μl；
[0173]
所述质谱条件包括：
[0174]
离子源：esi(+)；
[0175]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0176]
毛细管电压：800v；
[0177]
锥孔电压：50v；
[0178]
脱溶剂气温度：500℃；
[0179]
脱溶剂气流量：500l/hr；
[0180]
碰撞气：氩气；
[0181]
杂质g定量离子：170.1；
[0182]
杂质h定量离子：170.1。
[0183]
专属性试验结果：
[0184]
混合对照溶液检测数据如表3所示。
[0185]
表3混合对照品溶液检测结果
[0186]
物质名称保留时间(min)分离度拖尾因子杂质h9.132.01.02杂质g10.562.01.02
[0187]
由表3可知，空白溶剂对杂质测定无干扰，杂质h与杂质g分离度大于1.5，符合验证要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将杂质h与杂质g完全分离，且相互之间无干扰。
[0188]
实施例1-4
[0189]
检测条件：
[0190]
采用lc-ms/ms联用法检测，
[0191]
所述液相色谱条件包括：
[0192]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0193]
流动相：0.01mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为20：80，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至4.2；
[0194]
柱温：25℃；
[0195]
流速：0.8ml/min；
[0196]
洗脱方式：等度洗脱；
[0197]
进样量：1μl；
[0198]
所述质谱条件包括：
[0199]
离子源：esi(+)；
[0200]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0201]
毛细管电压：500v；
[0202]
锥孔电压：10v；
[0203]
脱溶剂气温度：600℃；
[0204]
脱溶剂气流量：500l/hr；
[0205]
碰撞气：氩气；
[0206]
杂质g定量离子：170.1；
[0207]
杂质h定量离子：170.1。
[0208]
专属性试验结果：
[0209]
混合对照溶液检测数据如表4所示。
[0210]
表4混合对照品溶液检测结果
[0211]
物质名称保留时间(min)分离度拖尾因子杂质h7.561.91.02杂质g8.891.91.05
[0212]
由表4可知，空白溶剂对杂质测定无干扰，杂质h与杂质g分离度大于1.5，符合验证要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将杂质h与杂质g完全分离，且相互之间无干扰。
[0213]
实施例1-5
[0214]
检测条件：
[0215]
采用lc-ms/ms联用法检测，
[0216]
所述液相色谱条件包括：
[0217]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0218]
流动相：0.03mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，两者体积比为10：90，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至3.8；
[0219]
柱温：35℃；
[0220]
流速：1.2ml/min；
[0221]
洗脱方式：等度洗脱；
[0222]
进样量：1μl；
[0223]
所述质谱条件包括：
[0224]
离子源：esi(+)；
[0225]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0226]
毛细管电压：1000v；
[0227]
锥孔电压：50v；
[0228]
脱溶剂气温度：350℃；
[0229]
脱溶剂气流量：800l/hr；
[0230]
碰撞气：氩气；
[0231]
杂质g定量离子：170.1；
[0232]
杂质h定量离子：170.1。
[0233]
专属性试验结果：
[0234]
混合对照溶液检测数据如表5所示。
[0235]
表5混合对照品溶液检测结果
[0236]
物质名称保留时间(min)分离度拖尾因子杂质h8.692.01.01杂质g10.162.01.04
[0237]
由表5可知，空白溶剂对杂质测定无干扰，杂质h与杂质g分离度大于1.5，符合验证要求，在本发明的色谱条件下的检测方法能够将杂质h与杂质g完全分离，且相互之间无干扰。
[0238]
实施例2灵敏度试验
[0239]
(1)定量限溶液
[0240]
精密移取0.25ml std-2溶液于100ml容量瓶中，用稀释剂3稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为std-4；精密移取1ml std-4溶液于10ml容量瓶中，用稀释剂2稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为loq-1。
[0241]
(2)检测限溶液
[0242]
精密移取4ml线性loq-1溶液于10ml容量瓶中，用稀释剂2稀释并定容至刻度，摇匀备用，标示为lod-1。
[0243]
灵敏度试验结果：
[0244]
定量限溶液的色谱图如图4所示，检测限溶液的色谱图如图5所示。
[0245]
由图4-5可知，当杂质g、杂质h的浓度约为0.005μg/ml，即主成分含量的0.02％时，信噪比大于3，符合检测限验证要求；当杂质g、杂质h的浓度约为0.013μg/ml，即主成分含量
的0.05％时，信噪比大于10，符合定量限验证要求。
[0246]
实施例3耐用性试验
[0247]
溶液配制同实施例1。
[0248]
分别在实施例3-1至3-9的检测条件下进样供试品溶液。
[0249]
检测条件：
[0250]
采用lc-ms/ms联用法检测，
[0251]
所述液相色谱条件包括：
[0252]
色谱柱：安捷伦agilent zorbax 300scx离子交换色谱柱；
[0253]
流动相：0.01mol/l醋酸铵缓冲液-乙腈为流动相，所述醋酸铵缓冲液采用冰醋酸调节ph至4；
[0254]
洗脱方式：等度洗脱；
[0255]
进样量：1μl；
[0256]
所述质谱条件包括：
[0257]
离子源：esi(+)；
[0258]
检测方式：sim选择性离子监测模式；
[0259]
毛细管电压：800v；
[0260]
锥孔电压：30v；
[0261]
脱溶剂气温度：500℃；
[0262]
脱溶剂气流量：700l/hr；
[0263]
碰撞气：氩气；
[0264]
杂质g定量离子：170.1；
[0265]
杂质h定量离子：170.1。
[0266]
柱温、ph值、流速和流动相比例条件如下：
[0267][0268]
耐用性结果：
[0269]
实施例3-1
[0270]
混合对照品溶液色谱图如图2所示，供试品溶液色谱图如图3所示，检测数据如表8所示。
[0271]
表8混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0272][0273]
实施例3-2
[0274]
混合对照品溶液色谱图如图6所示，供试品溶液色谱图如图7所示，检测数据如表9所示。
[0275]
表9混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0276][0277]
实施例3-3
[0278]
混合对照品溶液色谱图如图8所示，供试品溶液色谱图如图9所示，检测数据如表10所示。
[0279]
表10混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0280][0281]
实施例3-4
[0282]
混合对照品溶液色谱图如图10所示，供试品溶液色谱图如图11所示，检测数据如表11所示。
[0283]
表11混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0284][0285]
实施例3-5
[0286]
混合对照品溶液色谱图如图12所示，供试品溶液色谱图如图13所示，检测数据如表12所示。
[0287]
表12混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0288][0289]
实施例3-6
[0290]
混合对照品溶液色谱图如图14所示，供试品溶液色谱图如图15所示，检测数据如表13所示。
[0291]
表13混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0292][0293]
实施例3-7
[0294]
混合对照品溶液色谱图如图16所示，供试品溶液色谱图如图17所示，检测数据如表14所示。
[0295]
表14混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0296][0297]
实施例3-8
[0298]
混合对照品溶液色谱图如图18所示，供试品溶液色谱图如图19所示，检测数据如表15所示。
[0299]
表15混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0300][0301]
实施例3-9
[0302]
混合对照品溶液色谱图如图20所示，供试品溶液色谱图如图21所示，检测数据如表16所示。
[0303]
表16混合对照品溶液及供试品溶液检测结果
[0304]
[0305][0306]
由图2-3、6-21，表8-16可知，在柱温、流速、流动相比例及流动相ph稍作改变时，杂质g与杂质h都能够准确地定量检出，说明在本发明的色谱条件下的检测方法耐用性良好。
[0307]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。