测量复合物溶液中分析物的结合动力学的系统和方法与流程

测量复合物溶液中分析物的结合动力学的系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月6日提交的第62/883,515号美国临时申请的优先权，所述美国临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文。


背景技术：

3.生物过程由成对的第一和第二分子之间的分子相互作用决定。此类分子相互作用的实例包括核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、酶-底物相互作用，以及受体-配体相互作用，例如抗体-抗原相互作用和受体-激动剂或拮抗剂相互作用。对dna杂交、抗原-抗体结合和dna-蛋白质相互作用的基于亲和力的感测在基础科学研究、临床诊断、生物分子工程和药物设计中都发挥着重要作用。随着最新技术的发展，对测定分子标识和反应细节的精确、灵敏、高通量且快速方法的需求持续要求逐渐发展的分析方法。为了满足这些迫切需要，研究人员已经转向分子标签来提高稀有分子检测的灵敏度。但是，此类标签可能改变扩散和空间现象。另外，高通量或速度要求通常会阻止经典平衡方法的使用，因此详细了解反应动力学、扩散现象和表面固定化的含义对于提取有意义的反应参数至关重要。
4.当评估给定分子相互作用的动力学时，可能会关注各种定量动力学参数。所关注的一个定量动力学参数是缔合速率常数。缔合速率常数(即ka、k
on
)是描述处于平衡状态的两个分子的结合亲和力，例如抗体和抗原的结合亲和力的数学常数。所关注的另一个定量动力学参数是解离速率常数(即kd、k
off
)。解离速率常数是描述较大对象可逆地分离(解离)成较小组分(如受体/配体复合物解离成其组分分子时)的倾向的数学常数。所关注的第三个动力学参数是扩散速率常数km，其是描述标记分子朝向传感器扩散的速率的数学常数。此外，所关注结合相互作用中不涉及的蛋白质或其它分子可能会抑制此类参数的精确测量。


技术实现要素：

5.提供用于定量测定分子结合相互作用的结合动力学参数的方法，例如，其中所述测定涉及复合物样品。所述方法的实施例的方面包括：产生包括磁性传感器的磁性传感器装置，所述磁性传感器与包括包含磁性标记分子的复合物样品的分析混合物接触以产生可检测的分子结合相互作用；从所述磁性传感器获得实时信号；以及根据所述实时信号定量测定所述分子结合相互作用的结合动力学参数。还提供配置用于所述方法的系统和试剂盒。
附图说明
6.图1示出根据本公开的实施例的抗体-抗原结合(非按比例绘制)的示意图。
7.图2示出本公开的实施例的范围内传感器产生和检测的示意图。使用磁性纳米颗粒作为标签。
8.图3示出实施例的示意图，其中猎物蛋白质包裹的mnp与诱饵蛋白质包裹的传感器接触以产生磁性传感器。
9.图4示出从磁性传感器收集的用于抗体5405检测的实时数据，其中分析混合物包括缓冲剂、50％血浆和80％血浆。还示出与缔合和解离过程相对应的最佳拟合线。
10.图5a示出使用具有不同浓度牛血清白蛋白(bsa)的传统表面等离子体共振(spr)仪器收集的实时数据。
11.图5b示出图5a所示的实时数据的一部分的展开图。
12.图6示出从磁性传感器收集的用于缓冲剂中吐温20(即，聚山梨醇酯20)浓度为0.05％、0.5％、1％和2％的抗体5405检测的实时数据。还示出缔合和解离过程的最佳拟合线。
具体实施方式
13.提供用于定量测定分子结合相互作用的结合动力学参数的方法，例如，其中所述测定涉及复合物样品。所述方法的实施例的方面包括：产生包括磁性传感器的磁性传感器装置，所述磁性传感器与包括包含磁性标记分子的复合物样品的分析混合物接触以产生可检测的分子结合相互作用；从所述磁性传感器获得实时信号；以及根据所述实时信号定量测定所述分子结合相互作用的结合动力学参数。还提供配置用于所述方法的系统和试剂盒。
14.在更详细地描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体实施例，因此这些实施例当然可能会有变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而并不旨在进行限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限制。
15.在提供了值范围的情况下，应理解，在所述范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确规定，否则到下限的单位的十分之一)以及在所陈述范围内的任何其它所陈述值或中间值均被涵盖在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述范围中的任何具体排除的限值。在所陈述范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些被包括在内的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
16.本文提供了在数值前面有术语“约”的某些范围。术语“约”在本文用于为其后面出现的精确数字以及接近或靠近所述术语后面的数字的数字提供文字性支持。在确定数字是否接近或靠近具体叙述的数字时，接近或靠近的未叙述的数字可以为这样的数字，其在出现的上下文中，提供具体叙述的数字的基本等同形式。
17.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料也可以用于对本发明的实践或测试，但是现在将对代表性说明方法和材料进行描述。
18.本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文中，就好像每个单独的出版物或专利被具体地并单独地指示为以引用的方式并入和以引用的方式并入本文中一样，以结合所引用的出版物来公开和描述所述方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，而不应被解释为承认本发明因先前的发明而无权先于此
类出版物。此外，提供的公开日期可以与实际公开日期不同，所述实际公开日期可能需要独立确认。
19.应注意，如本文以及所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。还要注意，权利要求可以被撰写为排除任何可选要素。因此，此陈述旨在充当结合权利要求要素的叙述使用如“单独(solely)”、“仅(only)”等排他性术语或使用“否定型(negative)”限制的前置基础。
20.应了解，为了清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征还可以提供于单个实施例中的组合中。相反，为了清楚起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何适合的子组合的方式提供。实施例的所有组合都具体地涵盖在本发明中并且在本文中公开，就好像每一个组合都是单独地和明确地公开一样，达到此类组合涵盖可操作的过程和/或装置/系统/试剂盒的程度。另外，描述此类变量的实施例中列出的所有子组合也具体地涵盖在本发明中并且在本文中公开，就好像化学基团的每一个这种子组合都是单独地和明确地在本文中公开一样。
21.如阅读本公开后对于本领域技术人员将清楚的是，本文描述和示出的单独实施例中的每一个都具有离散的组成部分和特征，这些组成部分和特征可以在不偏离本发明的范围或精神的情况下易于与任何其它一些实施例的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其它顺序来执行任何所叙述的方法。
22.在进一步描述本发明的实施例时，将首先更详细地描述方法实施例的方面。接下来，回顾可用于实践本发明方法的系统和试剂盒的实施例。
23.方法
24.如上文所概述，本发明的实施例涉及定量测定复合物样品中所关注分子结合相互作用的结合动力学参数的方法。在某些实施例中，所关注结合相互作用是第一和第二分子之间的结合相互作用，例如第一和第二生物分子之间的结合相互作用。例如，第一和第二分子中的一个可以是磁性标记分子，且第一和第二分子中的一个可以是特异性结合到磁性标记分子的分子。“定量测定”是指以数量表示(例如以数值表示)所关注结合动力学参数。“结合动力学参数”是指至少部分地定义给定分子相互作用并且可用于定义其行为的可测量结合动力学因子。所关注结合动力学参数包括但不限于缔合速率常数(即ka、k
on
)、解离速率常数(即kd、k
off
)、扩散限制速率常数(即km)、活化能(即ea)、例如扩散系数的传输参数等。
25.如上所述，本发明的方法可包括以下步骤：
26.1)产生与包括磁性标记分子的分析混合物接触的磁性传感器装置；
27.2)从磁性传感器装置获得实时信号；以及
28.3)根据实时信号定量测定分子结合相互作用的结合动力学参数。
29.现在将更详细地描述这些步骤中的每一个。
30.产生与包括磁性标记分子的分析混合物接触的磁性传感器装置
31.所述方法的方面包括产生与包括磁性标记分子的分析混合物接触的磁性传感器装置。所述方法包括产生装置或构造，其中磁性传感器与包括所关注结合相互作用的成员分子(即，所关注结合相互作用的结合对成员)和磁性标签的组合物(例如，分析混合物)接触，其中磁性标签可以是所关注结合相互作用的成员分子之一的部分或域，或者是相异分子(例如，特异性结合到所关注结合相互作用的两个成员分子之一的第三分子)的组分。在
与磁性传感器接触的组合物或分析混合物中，磁性标签可与结合对成员之一稳定缔合，例如共价或非共价缔合，以产生磁性标记分子。如下文将进一步描述的，产生与包括磁性标记分子的分析混合物接触的磁性传感器装置的步骤例如关于结合对成员彼此接触的时间、和/或磁性传感器、结合对成员相对于装置的配置等可包括各种不同的过程子组合。
32.结合对
33.要根据本文描述的方法进行定量动力学分析的给定结合相互作用可由例如第一和第二生物分子的结合分子对组成。结合分子对可取决于所关注结合相互作用而大不相同。所关注结合相互作用包括结合分子对之间的任何相互作用，其中在结合相互作用的环境条件下在结合分子对之间以特异性发生结合相互作用。所关注结合相互作用的实例包括但不限于：核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、酶-底物相互作用，以及受体-配体相互作用，例如抗体-抗原相互作用和受体-激动剂或拮抗剂相互作用。
34.具有所关注分子结合相互作用的分子的实例包括但不限于：生物聚合物和小分子，它们可能是有机或无机小分子。“生物聚合物”是一种或多种重复单元的聚合物。生物聚合物可以在生物系统中找到(尽管它们可以合成)，并且可包括肽、多核苷酸和多糖，以及由氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团组成或包含氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团的化合物。因此，生物聚合物包括其中常规主链已被非天然存在的或合成的主链取代的多核苷酸，以及其中一个或多个常规碱基已被能够参与watson-crick型氢结合相互作用的基团(天然的或合成的)取代的核酸(或合成或天然存在的类似物)。例如，“生物聚合物”可包括dna(包括cdna)、rna、寡核苷酸、以及pna和如第5,948,902号美国专利中所描述的其它多核苷酸和其中引用的参考。“生物单体”指单个单元，所述单元可与相同或其它生物单体键联以形成生物聚合物(例如，具有两个键联基团的单个氨基酸或核苷酸，其中一个或两个可能具有可移动的保护基团)。
35.本文使用的术语“肽”是指通过在一个氨基酸的α-羧基和另一个基团的α-氨基之间形成酰胺而产生的任何聚合物化合物。本文使用的术语“寡肽”是指少于约10至20个残基的肽，即氨基酸单体单元。本文使用的术语“多肽”是指具有10至20个以上残基的肽。本文使用的术语“蛋白质”是指具有超过约50个残基的特异性序列的多肽，包括d和l形式、修饰形式等。术语“多肽”和“蛋白质”可以互换使用。
36.本文使用的术语“核酸”指由核苷酸组成的聚合物，例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或合成产生的化合物(例如，如第5,948,902号美国专利中所描述的pna和其中引用的参考)，其可与天然存在的核酸以与两种天然存在的核酸杂交的方式类似的序列特异性方式杂交，例如，可以参与watson-crick碱基配对相互作用。核酸可以具有任何长度，例如2个碱基或更长、10个碱基或更长、100个碱基或更长、500个碱基或更长、1000个碱基或更长，包括10,000个碱基或更长。本文使用的术语“多核苷酸”是指由长度通常大于约100个核苷酸的核苷酸单体组成的单链或双链聚合物。多核苷酸包括单链或多链配置，其中一条或多条链可与另一条链完全对齐，也可不完全对齐。本文使用的术语“核糖核酸”和“rna”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。本文使用的术语“脱氧核糖核酸”和“dna”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。本文使用的术语“寡核苷酸”表示长度为约10至约200个核苷酸的单链核苷酸多聚体，例如长度为约25至约175个核苷酸，包括长度为约50至约160个核苷酸，例如长度
为150个核苷酸。
37.在一些情况下，结合分子对是配体和受体，其中给定受体或配体可以是也可以不是生物聚合物。本文使用的术语“配体”是指能够共价或以其它方式化学结合所关注化合物的部分。配体可以是天然存在的，也可以是人造的。配体的实例包括但不限于用于细胞膜受体、毒素和毒液、病毒表位、激素、鸦片剂、类固醇、肽、酶底物、辅因子、药物、凝集素、糖、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白质等的激动剂和拮抗剂。
38.本文使用的术语“受体”是对配体具有亲和力的部分。受体可以是天然存在的，也可以是人造的。它们可以在未改变的状态下使用，也可以作为其它物种的聚集使用。受体可以直接地或经由特异性结合物质共价或非共价附着到结合成员。受体的实例包括但不限于抗体、细胞膜受体、与特异性抗原决定簇反应的单克隆抗体和抗血清、病毒、细胞、药物、多核苷酸、核酸、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞膜、细胞器等。在本领域中，受体有时被称为抗配体。由于本文中使用了“受体”一词，因此不存在意义上的差异。当两个分子通过分子识别组合以形成复合物时，形成“配体-受体对”。
39.如图3所示，磁性纳米颗粒(mnp)可以被猎物蛋白质包裹，并且磁性传感器可以被诱饵蛋白质包裹。猎物蛋白质与诱饵蛋白质之间的相互作用可以是测定结合动力学参数的相互作用。在一些情况下，猎物蛋白质可以是完全抗体。在其它情况下，猎物蛋白质可以是抗体的片段。
40.事实上，在本发明的方法中可以使用结合对中的每个结合成员的各种类型。在一些情况下，结合对的第一成员是抗体，并且结合对的第二成员是对应抗原。此类抗体和抗原可以是完全的抗体或抗原，例如天然存在的，或者可以使用抗体片段或抗原片段，或者两者。在一些情况下，结合对可包括链霉亲和素和生物素。
41.磁性传感器装置
42.所关注磁性传感器装置是响应于磁性标签与传感器表面缔合而生成电信号的装置。所关注磁性传感器装置包括但不限于磁阻传感器装置，包括巨磁阻(gmr)装置。所关注gmr装置包括但不限于自旋阀检测器和磁性隧道结(mtj)检测器。
43.自旋阀检测器
44.在一些情况下，磁性传感器是自旋阀检测器。自旋阀检测器是金属多层薄膜结构，由例如铜的非磁性层隔开的两个铁磁性层组成。称为钉扎层的一个铁磁性层的磁化被钉扎到某个方向，而称为自由层的另一个铁磁性层的磁化可以在外加磁场作用下自由旋转。自旋阀的电阻取决于自由层的磁化方向相对于钉扎层的磁化方向。当两个磁化平行时，电阻最低；当反平行时，电阻最高。电阻的相对变化称为磁阻(mr)比。在一些情况下，在小磁场(例如，约100oe)下，自旋阀的mr比可以达至约10％以上。因此，自旋阀可以用作感测元件，用于检测与传感器表面缔合的磁性标记分子。
45.在某些实施例中，自旋阀具有约1％至约20％的磁阻(mr)比，例如约3％至约15％，包括约5％至约12％。因此，在某些实施例中，自旋阀可以在窄带宽(即，约1hz或更小)内或通过锁定检测来检测约10nm大小的单个磁性标签。在这些情况下，通过缩小噪声带宽，即使对于单个纳米颗粒检测，也能获得足够的信噪比(snr)。
46.自旋阀检测可通过平面内模式进行(例如，见li等人，《应用物理学杂志(j.appl.phys.)》，第93卷(10)：7557(2003))。在其它实施例中，当检测系统中的ac微扰场
引起的电磁干扰(emi)信号可检测时，可使用垂直模式。emi信号倾向于在ac微扰场的频率f处集中，因此可以通过在频率2f处执行锁定检测来基本上消除或减少emi信号。此外，在一些情况下，可以使用双桥电路来基本上消除剩余的emi。可以使用在两个不同频率下利用ac调制感测电流和ac微扰场的其它信号采集和处理方法(例如，s-j han、s-j han、b.murmann、n.pourmand和s.x.wang，ieee国际固态电路会议(isscc)，数字技术论文(dig.tech.papers)，美国加利福尼亚州旧金山万豪酒店，2007年2月11日至15日)。
47.在某些实施例中，磁性标签引起的来自自旋阀检测器的信号取决于磁性标签与自旋阀自由层之间的距离，以及自旋阀本身的几何形状和偏置场。来自单个磁性标签的检测器电压信号随着颗粒中心到自旋阀自由层中间平面的距离增大而减小。
48.在某些实施例中，自旋阀中的自由层位于钉扎层的顶部，以便于检测磁性标签，因为来自磁性颗粒的感测磁场随传感器与颗粒之间的距离而单调下降。将磁性标签与自由层顶表面之间的距离最小化，包括将保护自旋阀的钝化层的厚度最小化，可有助于磁性颗粒检测。
49.在某些实施例中，自旋阀传感器可包括一个或多个检测器表面上的钝化层。在一些实施例中，检测器组合薄钝化层(例如，60nm或更小，例如50nm或更小，包括40nm或更小，30nm或更小，20nm或更小，或10nm或更小)(例如，在这些实施例中，检测器使用平均直径为50nm或更小的磁性纳米颗粒标签。在某些实施例中，使用更大的、微米大小的磁性颗粒。在一些情况下，适合与本文公开的检测器一起使用的薄钝化层的厚度可为约1nm至约10nm，例如约1nm至约5nm，包括约1nm至约3nm。在某些实施例中，适于与本文公开的检测器一起使用的薄钝化层的厚度可为约10nm至约50nm，例如约20nm至约40nm，包括约25nm至约35nm。钝化层可包括但不限于ta、au或其氧化物、其组合等。
50.关于自旋阀检测器及其使用方案的更多详细信息，请参考美国专利出版物第2005/0100930号和第2009/0104707号；其公开内容以引用的方式并入本文。
51.磁性隧道结检测器
52.在某些实施例中，磁性传感器是磁性隧道结(mtj)检测器。mtj检测器的构造类似于自旋阀检测器，不同之处在于非磁性间隔物被例如氧化铝或mgo的绝缘层(例如，绝缘隧道屏障)取代，感测电流垂直于薄膜平面流动通过所述绝缘层。两个铁磁性电极之间的电子隧穿由两个铁磁性电极的相对磁化控制，即当它们平行时隧穿电流高，且当它们反平行时隧穿电流低。在某些实施例中，mtj检测器包括底部电极、设置在隧道屏障任一侧的磁性多层，以及顶部电极。在一些情况下，mtj检测器具有超过200％的磁阻比(s.ikeda、j.hayakawa、y.m.lee、f.matsukura、y.ohno、t.hanyu和h.ohno，ieee电子装置交易，第54卷，第5期，991-1001(2007))和大的装置电阻，从而产生更高的输出电压信号。
53.在某些实施例中，mtj检测器具有双层顶部电极。第一层可以是金属层(例如，金层)，其中所述层在一些情况下的厚度可以是60nm或更小，例如50nm或更小，包括40nm或更小、30nm或更小、20nm或更小或10nm或更小。第二层可以是导电金属，例如铜、铝、钯、钯合金、钯氧化物、铂、铂合金、铂氧化物、钌、钌合金、钌氧化物、银、银合金、银氧化物、锡、锡合金、锡氧化物、钛、钛合金、钛氧化物，其组合等。在一些情况下，第二层中的孔径大小比mtj稍小。在某些实施例中，传感器配置成使得在使用期间缔合的磁性标签与自由磁性层顶表面之间的距离范围为5nm至100nm，例如5nm至50nm，包括5nm至30nm，例如5nm至20nm，包括
5nm至10nm。在一些情况下，这种布置有助于减少或基于上防止顶部电极内的电流拥塞(例如，见van de veerdonk、r.j.m.等人，《应用物理学快报(appl.phys.lett.)》，71:2839(1997))，如果仅使用薄金电极，可能会发生这种现象。
54.除了感测电流垂直于薄膜平面流动外，mtj检测器的工作方式也可与自旋阀检测器类似，可以采用平面内模式，也可以采用外加调制场的垂直模式。如上文关于自旋阀检测器所讨论的，在某些实施例中，外加调制场的垂直模式可用于减少emi，并且类似地，薄钝化也适用于mtj检测器。此外，mtj检测器上的第一薄金顶部电极还可有助于导电、钝化和特异性生物分子探针附着。
55.在某些实施例中，在相同的检测器宽度和颗粒-检测器距离下，mtj检测器可以发出比自旋阀检测器更大的信号。例如，对于结面积为0.2μm
×
0.2μm和电阻面积乘积为1kohm-μm2的mtj检测器，在250mv的偏置电压下且hb＝35oe、h
t
＝100oe rms时以250％的mr进行操作，来自单个直径为11nm、中心距自由层中平面35nm的co纳米颗粒的电压信号可能约为200μv。在一些情况下，此电压比类似大小的自旋阀检测器的电压大一个或更多个数量级。
56.有关mtj检测器及其使用方案的更多详细信息，请参考美国专利出版物第2005/0100930号和第2009/0104707号，其公开内容以引用的方式并入本文。
57.磁性传感器装置配置
58.磁性传感器装置可具有多种不同的配置，例如，关于传感器配置，装置是否配置为批量使用或流通使用等。因而，可以采用使装置的磁性传感器与所关注分子结合相互作用的结合成员和磁性标签的混合物接触的任何配置。因此，磁性传感器装置的配置可包括但不限于：井配置(其中传感器与例如井的流体容纳结构的底部或壁缔合)；流通配置，例如，其中传感器与具有流体输入和输出的流通池壁缔合；等。
59.在某些实施例中，本发明主题的磁性传感器装置包括基板表面，在所述基板表面上显示两个或更多个相异磁性传感器。在某些实施例中，磁性传感器装置包括具有磁性传感器阵列的基板表面。
[0060]“阵列”包括可寻址区域(例如，空间可寻址区域)的任何二维或基本二维(以及三维)布置。当阵列上有多个传感器位于特定的预定位置(即“地址”)时，阵列是“可寻址的”。阵列特征(即，传感器)可由中间空间隔开。任何给定的基板可携带设置在基板的前表面上的一个、两个、四个或更多个阵列。根据使用情况，任何或所有阵列可感测彼此相同或不同的靶，并且每个阵列可包含多个相异磁性传感器。阵列可以包含一个或更多个，包括两个或更多个、四个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个、或100,000个或更多个磁性传感器。例如，64个磁性传感器可以排列成8
×
8阵列。在某些实施例中，磁性传感器可布置成面积为10cm2或更小，或5cm2或更小，例如1cm2或更小，包括50mm2或更小，20mm2或更小，例如10mm2或更小甚至更小的阵列。例如，磁性传感器的尺寸范围可为10μm
×
10μm至200μm
×
200μm，包括100μm
×
100μm或更小，例如90μm
×
90μm或更小，例如50μm
×
50μm或更小的尺寸。
[0061]
在某些实施例中，磁性传感器可包括多个线性磁阻段。例如，磁性传感器可包括4个或更多个，例如8个或更多个，包括12个或更多个，或16个或更多个，例如32个或更多个，例如64个或更多个，或72个或更多个，或128个或更多个线性磁阻段。磁阻段的宽度可分别
为1000nm或更小，例如750nm或更小，或500nm或更小，例如250nm或更小。在一些情况下，磁阻段的厚度可分别为50nm或更小，例如40nm或更小，包括30nm或更小，或20nm或更小，例如10nm或更小。磁阻段的长度可分别为1000nm或更小，或750nm或更小，或500nm或更小，或250nm或更小，例如100nm或更小，或50nm或更小。
[0062]
磁阻段可以串联连接在一起，或者磁阻段可以并联连接在一起。在一些情况下，磁阻段串联以及并联连接在一起。在这些情况下，两个或更多个磁阻段可以并联连接在一起，并且两组或多组这些并联连接的磁阻段可以串联连接在一起。
[0063]
在某些实施例中，给定装置的至少部分或全部磁性传感器具有与传感器表面稳定缔合的结合对成员。结合对成员可有所不同，这取决于所执行的特定分析的性质。因此，结合对成员可以是特异性结合到所关注分子结合相互作用的分子的捕获探针，或参与所关注分子结合相互作用的分子，例如，特异性结合到磁性标记分子的分子。“稳定缔合”是指在使用条件下，例如在分析条件下，结合对成员和传感器表面在空间中相对彼此保持其位置的时间超过瞬时时间段。因此，结合对成员和传感器表面可以非共价或共价稳定地彼此缔合。非共价缔合的实例包括非特异性吸附、基于静电的结合(例如离子、离子对相互作用)、疏水相互作用、氢结合相互作用、通过共价附着到支撑表面的特异性结合对成员的特异性结合等。共价结合的实例包括在结合对成员和传感器表面上存在的官能团(例如，-oh)之间形成的共价结合，其中所述官能团可天然存在或作为引入的键联基团的成员存在。因此，结合对成员可以被吸附、物理吸附、化学吸附或共价附着到磁性传感器表面。
[0064]
如果给定装置包括两个或更多个磁性传感器，则每个传感器可具有与其表面缔合的相同或不同的结合对成员。因此，与磁性标记分子结合的不同捕获探针或分子可存在于此类装置的传感器表面上，使得每个磁性传感器特异性结合到相异分子。此类装置还可包括不受任何结合对成员约束的传感器(例如，此类空白传感器可作为参考或对照电信号源)。
[0065]
在多传感器装置中，磁性传感器之间可能存在不携带任何分析物特异性探针的区域。当存在时，此类传感器间区域可以具有各种尺寸和配置。在一些情况下，这些传感器间区域可配置成减少或防止不同传感器之间的流体运动，例如，其中传感器间区域包括疏水材料和/或流体屏障(例如壁)。
[0066]
在某些实施例中，例如可携带相异传感器的一个或多个阵列的装置基板的形状通常为矩形实体(尽管也可能有其它形状)，其长度为1mm或更大和150mm或更小，例如1mm或更大和100mm或更小，例如50mm或更小，或10mm或更小；宽度为1mm或更大和150mm或更小，例如100mm或更小，包括50mm或更小，或10mm或更小；并且厚度为0.01mm或更大和5.0mm或更小，例如0.1mm或更大和2mm或更小，包括0.2mm或更大和1.5mm或更小，例如0.5mm或更大和1.5mm或更小。
[0067]
可以存在电子通信元件，例如导电引线，其配置成以电子方式将传感器耦合到“芯片外”组件，例如装置组件，例如处理器、显示器等。
[0068]
如下文更详细地描述的，除了如上所述的例如阵列的传感器结构之外，给定磁性传感器装置还可包括各种组件。额外装置组件可包括但不限于：信号处理组件、数据显示组件(例如，图形用户界面)；数据输入和输出装置、电源、流体处理组件等。
[0069]
磁性标签
[0070]
在方法实施例中，可以采用任何方便的磁性标签。磁性标签是当与磁性传感器充分缔合时可由磁性传感器检测到并使磁性传感器输出信号的标记部分。如果标签中心与传感器表面之间的距离为200nm或更小，例如100nm或更小，包括50nm或更小，则所关注磁性标签可与磁性传感器充分缔合。
[0071]
在某些实施例中，磁性标签是纳米颗粒。在某些实施例的实践中有用的纳米颗粒是磁性(例如，铁磁性)胶体材料和颗粒。磁性纳米颗粒可以是超顺磁性的高磁矩磁性纳米颗粒，或者包括两层或多层反铁磁性耦合高磁矩铁磁性体的合成反铁磁性纳米颗粒。这两种类型的纳米颗粒在没有磁场的情况下看起来都是“非磁性”的，并且基本不会团聚。根据某些实施例，适于使用的可磁化纳米颗粒包括一种或多种材料，例如但不限于顺磁性、超顺磁性、铁磁性和亚铁磁性材料，以及其组合。
[0072]
在某些实施例中，磁性纳米颗粒(在本文中也称为磁性标签)具有小的剩余磁化强度，使得它们不会在溶液中团聚。具有小的剩余磁化强度的磁性纳米颗粒的实例包括超顺磁性颗粒和反铁磁性颗粒。在一些情况下，磁性标签在约100oe的磁场下具有可检测的磁矩。在一些情况下，磁性标签的大小与靶生物分子的大小相当，因此磁性标签不会干扰所关注分子之间的结合相互作用。在某些实施例中，磁性标签在生物环境下形状基本均匀且化学稳定，这可有助于其在分析条件下的使用。在一些情况下，磁性标签具有生物相容性，即水溶性和功能化，因此它们可以容易地附着到所关注生物分子，例如特异性结合到靶分析物的受体。
[0073]
在某些实施例中，磁性纳米颗粒是高磁矩磁性纳米颗粒，例如co、fe或cofe纳米晶体，其在室温下可以是超顺磁性的。磁性纳米颗粒可以通过化学途径制备，例如但不限于盐还原或在适当溶液中的化合物分解。此类磁性纳米颗粒的实例包括但不限于以下文献描述的磁性纳米颗粒：s.sun和c.b.murray，《应用物理学杂志(j.appl.phys.)》85：4325(1999)；c.b.murray等人，《美国材料研究学会公告(mrs bulletin)》，26：985(2001)；以及s.sun、h.zeng、d.b.robinson、s.raoux、p.m.rice、s.x.wang和g.li，《美国化学会志(j.am.chem.soc.)》126，273-279(2004)。在某些实施例中，磁性纳米颗粒可以按可控大小(例如，约5-12nm)合成，为单分散的并且用油酸稳定。适用于本文的磁性纳米颗粒包括但不限于co、co合金、铁氧体、氮化钴、氧化钴、co-pd、co-pt、铁、铁合金、fe-au、fe-cr、fe-n、fe3o4、fe-pd、fe-pt、fe-zr-nb-b、mn-n、nd-fe-b、nd-fe-b-nb-cu、ni、ni合金等。在一些实施例中，将薄金层镀到磁芯上，或将多聚-l-赖氨酸包裹的玻璃表面附着到磁芯上。合适的纳米颗粒可从nanoprobes,inc(伊利诺伊州诺斯布鲁克)和reade advanced materials(罗得岛州普罗维登斯)等公司购买。
[0074]
在一些情况下，磁性纳米颗粒标记通过物理方法(例如，w.hu、r.j.wilson、a.koh、a.fu、a.z.faranesh、c.m.earhart、s.j.osterfeld、s.-j.han、l.xu、s.guccione、r.sinclair和s.x.wang，《先进材料(advanced materials)》20，1479-1483(2008))而不是化学途径制备，并且适用于标记待检测的靶生物分子。磁性标签可包括两个或更多个铁磁性层，例如fe
x
co
1-x
(其中x为0.5至0.7)或fe
x
co
1-x
基合金。在一些情况下，fe
x
co
1-x
的饱和磁化强度为24.5千高斯。这些铁磁性层可由例如ru、cr、au等或其合金的非磁性间隔层分离。在一些情况下，间隔层包括反铁磁性耦合的铁磁性层，从而产生的颗粒的净剩余磁化强度为零或接近零。在某些实施例中，可经由rkky交换相互作用(参考例如s.s.p.parkin等人，
《物理评论快报(phys.rev.lett.)》，64(19)：2304(1990))和静磁相互作用(j.c.slonczewski等人，《ieee磁学汇刊(ieee trans.magn.)》，24(3)：2045(1988))实现反铁磁性耦合。在一些情况下，反铁磁性耦合强度使得颗粒可以被100oe的外部磁场饱和(即，所有层的磁化变得平行)。在一些情况下，反铁磁性耦合强度取决于间隔层的层厚度和合金组合物。
[0075]
在特定实施例中，为了促进纳米颗粒的生物共轭，金帽(或功能类似或等效材料的帽)层叠在反铁磁性材料层的顶部，使得纳米颗粒可以经由金硫醇或其它方便的键联与生物分子共轭。可以将表面活性剂施用于纳米颗粒，使得纳米颗粒可以是水溶性的。为了化学稳定性，纳米颗粒的边缘也可以用au或其它惰性层钝化。
[0076]
可采用任何方便的方案来制备上述纳米颗粒。例如，纳米颗粒层可包括沉积在基板上的纳米级铁磁性和间隔层，或具有基本光滑表面的释放层。在一些情况下，可通过压印、蚀刻、自组装等形成掩模层。随后，可移除并彻底清除掩模层和其它不需要的层。然后，可以移除释放层，剥离作为掩模层负像的纳米颗粒。然后这些颗粒可以与表面活性剂和生物分子接触。在一些情况下，在彻底清洁和化学机械抛光(cmp)后，基板可以重复使用。
[0077]
在其它实施例中，使用减材制造方法来制备纳米颗粒。在这种情况下，将各层直接沉积在释放层上，然后沉积掩模层。这些层通过掩模层蚀刻，且最终从基板上释放。与增材制造方法中的情况相反，这些纳米颗粒来自掩模层的正像。
[0078]
在某些实施例中，适合与本发明一起使用的磁性纳米颗粒的大小与所关注分子结合相互作用的生物分子的大小相当，使得纳米颗粒不会干扰所关注结合相互作用。因此，在一些实施例中，磁性纳米颗粒的大小为亚微米大小，例如5nm至250nm(平均直径)，例如5nm至150nm，包括5nm至20nm。例如，本文中适合使用平均直径为5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm和300nm的磁性纳米颗粒以及平均直径在这些值中任意两个值之间的纳米颗粒。此外，除了球形外，适合在本文中使用的磁性纳米颗粒的形状还可为圆盘、棒、线圈、纤维等。
[0079]
在一些实施例中，磁性标签是胶体稳定的，例如，纳米颗粒组合物可以作为稳定的胶体存在。胶体稳定是指纳米颗粒均匀地分散在溶液中，使得纳米颗粒基本不会团聚。在某些实施例中，为了防止结块，纳米颗粒在零外加磁场中可没有净磁矩(或非常小的磁矩)。反铁磁性颗粒在任何大小的零场中都可能具有零磁矩。相反，对于铁磁性颗粒，其大小可能低于“超顺磁性极限”，在一些情况下，所述极限为约20nm或更小，例如约15nm或更小，包括约10nm或更小。
[0080]
在某些实施例中，可使用大型晶圆和标准真空薄膜沉积工艺大量产生合成纳米颗粒。例如，对于6英寸的圆形晶圆，假设每个颗粒占据晶圆上60nm
×
60nm的正方形，则可以以每批大致5
×
10
12
个颗粒的速率产生直径为30nm的纳米颗粒。
[0081]
在一些情况下，所关注给定结合相互作用的分子和磁性标签稳定地相互缔合。“稳定缔合”是指在使用条件下，例如在分析条件下，生物分子和磁性标签在空间中相对彼此保持其位置的时间超过瞬时时间段。因此，生物分子和磁性标签可以非共价或共价稳定地彼此缔合。非共价缔合的实例包括非特异性吸附、基于静电的结合(例如离子、离子对相互作用)、疏水相互作用、氢结合相互作用、通过共价附着到支撑表面的特异性结合对成员的特
异性结合等。共价结合的实例包括在生物分子和标签表面上存在的官能团(例如-oh)之间形成的共价结合，其中所述官能团可天然存在或作为引入的键联基团的成员存在。
[0082]
分析混合物产生
[0083]
可以使用任意数量的不同方案来产生包括与包括磁性标记分子的分析混合物接触的磁性传感器的磁性传感器装置。在一些情况下，分析混合物包括一个或多个复合物样品，例如一个复合物样品。在一些情况下，分析混合物包括一个或多个简单样品，例如单个简单样品和非复合物样品。
[0084]
复合物样品和简单样品
[0085]
与传感器表面接触的样品可以是简单样品或复合物样品。“简单样品”是指包括一个或多个结合相互作用成员以及除溶剂之外的少量(如果有的话)其它分子物种的样品。“复合物样品”是指包括一个或多个所关注结合相互作用成员且还包括许多不同蛋白质和并非所关注分子的其它分子的样品。在某些实施例中，在本发明的方法中分析的复合物样品是包括10个或更多个，例如20个或更多个，包括100个或更多个，例如103个或更多个，104个或更多个(例如15,000个；20,000个或甚至25,000个或更多个)在分子结构方面彼此不同的相异(即，不同)分子实体的样品。
[0086]
在某些实施例中，复合物样品是血液样品。在一些情况下，血液样品是全血。在一些情况下，血液样品是全血的一部分，例如血清或血浆。
[0087]
在一些情况下，复合物溶液是来自生物体的非血液流体。在一些情况下，来自生物体的非血液流体是脑脊髓液(csf)、唾液、精液、阴道液、淋巴液、尿液、泪液、乳汁，或皮肤、呼吸道、肠道或泌尿生殖道的外部部分。
[0088]
在一些情况下，复合物样品是组织样品。在一些情况下，组织样品从肿瘤提取。在一些情况下，组织样品从非肿瘤组织提取。在一些情况下，复合物样品是细胞培养物或细胞培养物的一部分。在一些情况下，细胞培养物或组织样品是人类或动物的细胞培养物或组织样品。
[0089]
复合物样品可以来自任何生物体，包括但不限于人类、灵长类动物、猴子、果蝇、大鼠、小鼠、猪或犬。
[0090]
在一些情况下，复合物样品是人类、小鼠、大鼠、猪、犬或猴子的全血、血浆或血清。在一些情况下，复合物样品是人类、小鼠、大鼠、猪、犬或猴子的脑脊髓液、唾液或尿液。
[0091]
在一些情况下，复合物样品包括的非所关注组分的浓度不足以抑制用常规方法精确测量结合动力学参数。例如，在一些情况下，复合物混合物的抑制组分可能会抑制使用表面等离子体共振(spr)精确测定此类参数，而使用本发明的磁性传感器方法可以相对精确地测定此类参数。有几种方式可用于评估每种方法测定结合动力学参数的精确性。这些方式可包括平滑实时数据的导数是具有单次正负号变化还是多次正负号变化。在其它情况下，这些方式可包括实时数据中是否存在不连续性。
[0092]
分析混合物可包括各种量的复合物样品，例如，分析混合物中复合物样品的量可以是按质量计0.1％或更多，例如1％或更多、2％或更多、5％或更多、10％或更多、25％或更多、50％或更多、75％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、或100％。在一些情况下，分析混合物中复合物样品的量在0.1％至98％之间，例如在1％至95％之间，在5％至90％之间，或在10％至80％之间。
[0093]
产生分析混合物
[0094]
可以使用任意数量的不同方案来产生包括与包括磁性标记分子的分析混合物接触的磁性传感器的磁性传感器装置。例如，可将特异性结合到磁性标记分子的第一分子结合到传感器表面上的捕获探针，接着随后将其与磁性标记分子(例如，可磁性标记的第二生物分子)接触。在这些情况下，方法可包括提供具有磁性传感器的磁性传感器装置，所述磁性传感器显示特异性结合到第一分子的捕获探针，所述捕获探针也特异性结合到磁性标记分子；然后将磁性传感器与第一分子和磁性标记分子接触。接触可包括依次施用第一分子，所述第一分子结合到表面并且能够特异性结合到磁性标记分子，然后将磁性标记分子施用到磁性传感器。
[0095]
替代地，在与传感器接触之前，可将特异性结合到磁性标记分子的第一分子和磁性标记分子组合以形成复合物，并且可允许所得复合物与传感器上的捕获探针结合(例如，第一分子与捕获探针之间的结合相互作用的结合动力学是所关注结合动力学)。在这些情况下，接触包括产生反应混合物，所述反应混合物包括特异性结合到磁性标记分子的第一分子和磁性标记分子，然后将反应混合物施用到磁性传感器。
[0096]
在又其它实施例中，首先将特异性结合到磁性标记分子的第一分子定位在传感器上，然后将其与磁性标记的第二分子接触。在这些情况下，方法包括提供具有显示第一分子的磁性传感器的磁性传感器装置(无介入捕获探针)；然后将磁性传感器与磁性标记分子接触。
[0097]
图4提供可用于结合动力学定量分析的分析方案的示例性示意图。在根据图2所示的方案制备装置时，可关注捕获结合成员(例如，捕获抗体或捕获dna)与靶成员(例如，分析物或靶dna)之间的相互作用的结合动力学。在这些实施例中，首先在结合条件下将靶成员和标记成员彼此接触，并且将所得复合物与传感器表面接触。替代地，在根据图2所示的方案制备装置时，可关注标记结合成员(例如，标记抗体或标记dna)与靶成员(例如，分析物或靶dna)之间的相互作用的结合动力学。在这些实施例中，首先在结合条件下将靶成员和捕获成员彼此接触，并且将所得的与传感器表面缔合的复合物与标记成员接触。
[0098]
上述接触(包括施用)步骤是在可能发生所关注结合相互作用的条件下进行的。虽然接触温度可能不同，但在一些情况下，温度范围为1至95℃，例如5至60℃，包括20至40℃。分析的各种组分可能存在于水性介质中，水性介质可能包括也可能不包括例如盐、缓冲剂等多种额外组分。在一些情况下，接触是在严格的条件下进行的。严格条件的特征在于温度范围在15至35℃之间，例如比探针-靶双工器的熔化温度低20至30℃，熔化温度取决于多种参数，例如温度、缓冲剂组合物、探针和靶的大小、探针和靶的浓度等。因此，杂交的温度范围可能在约55至70℃之间，通常在约60至68℃之间。在存在变性剂的情况下，温度范围可能在约35至45之间，通常在约37至42℃之间。严格的杂交条件的特征在于存在杂交缓冲剂，其中，缓冲剂的特征在于以下一个或多个特性：(a)具有高盐浓度，例如3至6
×
ssc(或类似浓度的其它盐)；(b)存在洗涤剂，例如sds(0.1％至20％)、triton x100(0.01％至1％)、monidet np40(0.1％至5％)等；(c)其它添加剂，如edta(例如，0.1至1μm)、四甲基氯化铵；(d)加速剂，例如peg、硫酸葡聚糖(5％至10％)、ctab、sds等；(e)变性剂，例如甲酰胺、尿素等；等等。严格条件是严格程度至少与上述特异性条件相同的条件。
[0099]
在一些情况下，分析混合物可以是复合物样品和一种或多种其它组分的组合。在
一些情况下，分析混合物可包括清洗剂、防腐剂、缓冲剂、表面活性剂、乳化剂、洗涤剂、增溶剂、溶解剂、水、稳定剂或其组合。在一些情况下，额外组分是表面活性剂。在一些情况下，额外组分配置成抑制复合物混合物中的一种或多种元素与磁性传感器的非选择性结合。在一些情况下，额外组分配置成增加一种或多种组分(例如蛋白质)在复合物混合物中的溶解度。在一些情况下，防腐剂是血液样品防腐剂。在一些情况下，缓冲剂是牛血清白蛋白(bsa)缓冲剂。
[0100]
分析样品中一种或多种额外组分的量可以是不同的量。例如，按质量计，分析混合物中每种组分的量可以是按质量计0.1％或更多，例如0.5％或更多，1％或更多，2％或更多，5％或更多，10％或更多，25％或更多，50％或更多，75％或更多，90％或更多，或95％或更多。
[0101]
在一些情况下，分析混合物包括血液样品以及缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。在一些情况下，分析混合物包括血浆(例如10％或更多的血浆)、bsa缓冲剂和0.1％或更多的聚山梨醇酯20表面活性剂。在一些情况下，分析混合物包括血清(例如10％或更多的血清)、bsa缓冲剂和0.1％或更多的聚山梨醇酯20表面活性剂。在一些情况下，分析混合物包括10％或更多的血浆或血清以及bsa缓冲剂。在一些情况下，血液样品包括血浆和血清两者。在一些情况下，分析混合物包括血液样品、缓冲剂、表面活性剂和防腐剂。在一些情况下，分析混合物包括血液样品、缓冲剂和防腐剂。在一些情况下，分析混合物包括血液样品和防腐剂但缺乏缓冲剂。在一些情况下，分析混合物包括按质量计50％或更多的血液样品，例如75％或更多、80％或更多、90％或更多、或95％或更多。
[0102]
在一些情况下，复合物溶液包括全血的一部分，例如血清或血浆，并且分析混合物还包括表面活性剂。在一些情况下，分析混合物还包括缓冲剂，例如bsa。在一些情况下，分析混合物包括全血的一部分以及防腐剂。在一些情况下，分析混合物包括全血的一部分、缓冲剂、表面活性剂和可选的防腐剂。
[0103]
在一些情况下，表面活性剂是聚山梨醇酯20，也称为吐温20和聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇月桂酸酯。在一些情况下，表面活性剂是非离子表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂是triton x-100，也称为聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚。在一些情况下，额外组分是haps、doc、np-40、辛基硫代葡萄糖苷、辛基葡萄糖苷或十二烷基麦芽糖苷。在一些情况下，表面活性剂是两性离子表面活性剂。
[0104]
从磁性传感器获得实时信号
[0105]
在产生包括与分析混合物(包括所关注结合相互作用的结合成员和磁性标签，例如，如上所述)接触的磁性传感器的装置之后，方法的方面包括从磁性传感器获得实时信号。因此，某些实施例包括从装置获得实时信号。因此，可以观察到与所关注结合相互作用的发生相关联的信号的实时演变。实时信号由在给定关注时间段内获得的两个或更多个数据点组成，其中在某些实施例中，获得的信号是在给定关注时间段内连续获得的连续数据点集合(例如，呈轨迹的形式)。关注时间段可能不同，在一些情况下，范围从1秒至10小时，例如10秒至1小时，包括1分钟至15分钟。信号中数据点的数量也可能不同，在一些情况下，数据点的数量足以在实时信号的时间进程中提供连续的数据拉伸。
[0106]
在一些实施例中，当分析系统处于“湿”条件时，即在含有分析组分(例如，结合成员和磁性标签)的溶液仍与传感器表面接触时，观察信号。因此，不需要洗掉所有未结合的
或不相关的分子。这种“湿”检测是可能的，因为磁性标签纳米颗粒(例如，直径为150nm或更小，如其它地方所描述)产生的磁场随着与纳米颗粒的距离增大而快速减小。因此，结合到捕获的结合成员的标签的传感器处的磁场超过溶液中未结合的磁性标签的磁场，这两者不仅与检测器的距离更大而且都处于布朗运动中。本文使用的术语“近距离检测”是指结合的纳米颗粒在传感器处的这种显性。在“近距离检测”方案下，传感器表面特异性结合的磁性标记共轭物可以量化，而无需洗掉溶液中的非特异性磁性纳米标记。
[0107]
对于给定的所关注结合相互作用，分析可包括获得单个结合对成员浓度或多个结合对浓度(例如2个或更多个、3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、100个或更多个、甚至1,000个或更多个不同浓度)的实时信号。给定的分析可根据需要将具有相同捕获探针浓度的同一传感器与多个不同的结合对成员浓度接触，或反之亦然，或将不同浓度的捕获探针和结合对成员的组合接触。
[0108]
如图3所示，磁性纳米颗粒(mnp)可以被猎物蛋白质包裹，并且磁性传感器可以被诱饵蛋白质包裹。猎物蛋白质与诱饵蛋白质之间的相互作用可以是测定结合动力学参数的相互作用。
[0109]
为了获得可用于精确测定此类参数的实时数据，可以改变猎物蛋白质和诱饵蛋白质的绝对浓度。在一些情况下，可以将猎物和诱饵的绝对浓度调整到足够小的程度，使得实时信号的缔合和解离部分可以拟合单速率动力学方程。因此，调整猎物蛋白质和诱饵蛋白质的绝对浓度有助于精确测定结合动力学参数。另外，在一些情况下，猎物蛋白质与诱饵蛋白质的相对量可以变化，以便于拟合单速率动力学方程以及精确测定结合动力学参数。图4和6所示的实时信号是通过促进拟合单速率动力学方程的浓度获得的。根据实时信号定量测定结合动力学参数
[0110]
如上所述，在获得实时信号之后，方法可包括根据实时信号定量测定分子结合相互作用的结合动力学参数。换句话说，采用实时信号来定量测定所关注结合动力学参数，使得从实时信号中获得所关注结合动力学参数。
[0111]
在一些情况下，通过使用拟合算法处理实时信号来定量测定所关注结合动力学参数。拟合算法是指通过将方程拟合到从给定分析中获得的实时信号来测定所关注结合动力学参数的一组规则，如上文所述。可以使用任何方便的拟合算法。
[0112]
可以根据实时信号以任何合适的方式测定结合动力学参数。在一些情况下，测定参数，根据以下方程计算kon、koff和kd的值：
[0113]
缔合曲线：s
t
＝s0·
[1-exp{-(c
·kon
+k
off
)
·
t})(1)
[0114]
解离曲线：s
t
＝a
·
exp{-k
off
·
t)(2)
[0115]
kd＝k
off
/k
on
(3)
[0116]
使用目前描述的方法，即使在分析混合物包括复合物样品溶液时，也可以对结合动力学参数进行精确测量。例如，即使当分析混合物包括按质量计1％或更多的复合物样品溶液(例如血液样品)时，也可以对结合动力学参数进行精确测量。
[0117]
在一些情况下，特定相互作用的动力学结合参数已经测量，或者可以用另一种方式测量。例如，可能已经使用具有简单溶液(即非复合物溶液)的表面等离子体共振(spr)测量特定相互作用的kon。然而，本发明的方法允许使用含有复合物样品溶液的分析混合物和磁性传感器(例如gmr传感器)测量相同的参数，从而获得先前值与当前值之间的良好一致
性。因此，复合物样品溶液的存在不会对测量的精确性产生明显负面影响。
[0118]
在一些情况下，从本发明的方法和对照方法(例如，使用简单溶液的spr)获得的kon值的差为50倍或更少倍。例如，本发明的方法可产生104m-1
的估算kon值，而使用简单溶液测量的spr可产生2
×
103m-1
的值，即比本发明方法的值小5倍。在一些情况下，根据本发明方法的实时信号测定的结合动力学参数与根据对照方法测定的结合动力学参数之间的差为20倍或更少倍，例如15倍或更少倍、10倍或更少倍、5倍或更少倍、2倍或更少倍、1倍或更少倍、50％或更少倍、或25％或更少倍。在一些情况下，即使分析混合物包括按质量计1％或更多的复合物溶液，例如5％或更多、10％或更多、25％或更多、75％或更多、或95％或更多，也可以获得此类参数差。
[0119]
在一些情况下，本发明的方法不包括执行其它此类方法，例如使用简单溶液测量spr。在这些情况下，通过本发明方法获得的参数值与在另一时间、通过另一方法或其组合获得的值有关。
[0120]
在一些情况下，使用复合物样品溶液来使用所述方法会产生与使用简单溶液获得的参数相对一致的测量参数。例如，使用简单溶液测量获得的参数可以在使用复合物样品溶液获得的参数的50倍或更少倍，例如20倍或更少倍，例如15倍或更少倍，10倍或更少倍，5倍或更少倍，2倍或更少倍，1倍或更少倍，50％或更少，或25％或更少的范围内。在一些情况下，即使一种分析混合物包括按质量计不到1％，例如按质量计0％的复合物样品，而另一种分析混合物包括按质量计2％或更多，例如5％或更多、10％或更多、25％或更多、75％或更多、或95％或更多的复合物样品，也可以获得此类参数差。
[0121]
在一些情况下，通过生成适合于估算动力学参数的实时数据来例证本发明的方法的精确性和实用性。因此，通过获得精确反映潜在相互作用的数据，可以提高估算的精确性。在一些情况下，当测量的gmr值在一段时间内增加，反映出缔合性，然后测量的gmr值在一段时间内减少，反映出解离时，就例证了这种精确性。例如，如实例部分中所讨论的，图4示出gmr值中的这种变化。在此类情况下，实时数据的导数有单次正负号变化，例如，导数在缔合阶段为正，在解离阶段为负。
[0122]
此外，实时数据可能会导致测量值的临时增加或减少，这可归因于例如统计误差。因此，在评估例如导数正负号变化时，不考虑此类误差。事实上，在数据处理期间，实时数据可以以平滑等方式进行处理，以减少统计噪声，从而提高所获得参数的精确度。
[0123]
因此，可以通过只有例如与缔合和解离阶段相对应的单次正负号变化的平滑实时数据来例证本发明的方法的精确性。
[0124]
同样，也可以通过数据中不存在不连续性来例证本发明的方法的精确性。尽管实时数据中可能存在各种类型的不连续性，但某些类型的不连续性与复合物样品溶液对获得精确结合动力学参数的精确性的影响有关。例如，如以下实例3所讨论以及图5a和5b所示，在一定浓度下，缓冲剂bsa的存在导致测量的spr信号急剧升高然后下降。对于10％的bsa样品，这种升高和下降表现为急剧升高和下降，其中从右侧和左侧接近急剧升高和下降的曲线不趋向于相同的值。
[0125]
尽管可以以各种方式对此类不连续性和误差进行分类，但在一些情况下，不连续性位于平滑实时信号的导数的绝对值是平滑实时信号的导数的平均绝对值的2倍或更多倍，例如5倍或更多倍、10倍或更多倍，25倍或更多倍，50倍或更多倍，或100倍或更多倍处。
例如，在图5a中，与其它地方曲线的逐渐升高和逐渐下降(即小导数)相比，急剧升高/急剧下降附近10％bsa样品的导数绝对值显著增加，即如急剧升高/急剧下降的陡峭斜率所示。实际上，如图5b所示，即使在bsa浓度较低的情况下，实时数据也显示出导数的相对突变，这表示不连续性对从数据中精确获得动力学参数的能力产生了负面影响。
[0126]
因此，本发明的方法通过减少或消除分析混合物中非研究组分(即含有复合物样品溶液的组分)的组分对实时数据造成的负面影响，提供了对结合动力学参数的精确测量。例如，本发明的方法允许甚至使用1％或更多的缓冲剂或10％或更多的血液样品来精确测量结合动力学参数。相比之下，尝试用含有复合物样品的分析混合物(即spr)测量此类参数的其它方式会导致错误和不连续的数据，这会提供不精确的参数估算。
[0127]
在一些情况下，在测定结合参数之前对原始实时数据进行平滑处理。在其它情况下，使用原始实时数据来测定结合参数，而无需对其进行平滑处理。在一些情况下，所述方法还包括在执行测定步骤之前对原始实时数据进行平滑处理。本领域中已知对原始数据进行平滑处理的方式，并且在本发明的方法中可以采用任何合适的方式。
[0128]
在一些情况下，可以使用拟合算法分析实时数据并测定结合动力学参数，例如美国专利10,101,299b2中所描述的那些算法，所述美国专利的公开内容以引用的方式并入。
[0129]
需要时，可以借助配置成执行上述方案的软件和/或硬件来执行上述定量测定方案。
[0130]
数据处理
[0131]
本发明的方法提供了结合动力学参数的精确定量测定，即使分析混合物包括复合物样品。可以通过各种方式例证此类优势。
[0132]
为了说明此类优势，可以使用本领域已知的数学方法、统计方法或其组合来处理实时信号。在一些情况下，此类数据处理可涉及一个或多个操作：求绝对值、求导数并对信号进行平滑处理。当数据处理包括此类步骤中的不止一个步骤时，应理解，可以以任何合适的顺序执行此类步骤。
[0133]
在一些情况下，使用实时信号生成实时数据的导数。
[0134]
在一些情况下，使用实时信号通过执行平滑操作和求导数来生成实时信号的平滑导数。可以先执行平滑操作，然后执行求导数操作，或者先执行求导数操作，然后执行平滑操作。
[0135]
在一些情况下，使用实时信号生成实时信号的平滑导数的绝对值。因此，此类程序涉及求绝对值、求导数和进行平滑处理。可以以任何合适的顺序执行此类操作。例如，可以使用实时信号生成实时信号的平滑导数，然后可以执行绝对值操作。在另一实例中，可以先求绝对值，然后以任何合适的顺序执行导数和平滑操作。
[0136]
在一些情况下，方法包括此类数据处理步骤。在其它情况下，方法不包括此类数据处理步骤，而是磁性传感器装置配置成使得如果执行了此类数据处理步骤，则所产生的处理数据将举例说明，本发明的方法、系统和试剂盒提供了结合动力学参数的精确定量测定，即使分析混合物包括复合物样品也是如此。
[0137]
例如，在一些情况下，磁性传感器装置配置成使得如果根据实时信号产生了实时信号的平滑导数，则实时信号的平滑导数将仅包含单次正负号变化。
[0138]
在其它情况下，磁性传感器配置成使得如果根据实时信号产生了实时信号的平滑
导数的绝对值，则平滑实时信号将包含不连续性，其中实时信号的平滑导数的绝对值是实时信号的平滑导数的平均绝对值的5倍或更多倍。
[0139]
在一些情况下，方法包括根据例如表面等离子体共振(spr)等对照物来测定结合动力学参数。在这种情况下，根据实时信号测定的结合动力学参数与根据对照物测定的结合动力学参数之间的差为5倍或更少倍。在其它情况下，方法不包括使用对照物进行此类测定，而是磁性传感器装置配置成使得根据实时信号测定的结合动力学参数与根据对照物测定的结合动力学参数之间的差(例如，其中对照参数的值之前已在科学文献中报告或在另一时间测定)为5倍或更少倍。
[0140]
多重分析
[0141]
本发明的方面包括对与同一传感器的两个或更多个相异结合相互作用进行多重分析。“多重分析”是指定量分析不同结合分子集合之间例如通过不同序列产生的两个或更多个相异结合相互作用，其中结合分子和/或磁性标记分子彼此不同。在一些情况下，集合的数量是2个或更多个，例如4个或更多个、6个或更多个、8个或更多个等，多达20个或更多个，例如50个或更多个，包括100个或更多个、或1000个或更多个相异集合。因此，在一些情况下，磁性传感器装置可包含各自具体检测相异结合相互作用的两个或更多个相异磁性传感器，例如2个或更多个、4个或更多个、6个或更多个、8个或更多个等，高达20个或更多个、例如50个或更多个，包括100个或更多个、或1000个或更多个相异磁性传感器。在某些实施例中，所关注的是对2到1000个相异结合相互作用的多重分析，例如2到50个或2到20个相异结合相互作用。因此，在这些实施例中，磁性传感器装置可包括各自具体分析相异结合相互作用的2到1000个相异磁性传感器，例如4到1000个相异磁性传感器。在其它情况下，磁性传感器装置可包括各自具体分析相异结合相互作用的20个或更少相异磁性传感器，例如10个或更少，包括4个或更少相异磁性传感器。
[0142]
装置和系统
[0143]
本发明的方面还包括配置成定量测定所关注分子结合相互作用的一个或多个结合动力学参数的磁性传感器装置和系统。所述装置和系统通常包括磁性传感器；以及定量分析模块(例如，处理器)，其配置成从磁性传感器接收实时信号，并根据实时信号定量测定分子结合相互作用的结合动力学参数。这两个组件可以作为单个装置集成到同一制品中，或者分布在两个或更多个不同装置(例如，作为系统)之间，其中所述两个或更多个不同装置例如经由有线或无线通信协议彼此通信。
[0144]
因此，本发明的方面还包括配置成如上所述定量评估结合相互作用的系统，例如，基于计算机的系统。“基于计算机的系统”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。基于计算机的系统的实施例的最小硬件包括中央处理单元(cpu)(例如，处理器)、输入装置、输出装置和数据存储装置。当前可用的基于计算机的系统中的任何一个都可以适合于在本文公开的实施例中使用。数据存储装置可包括任何制品，包括如上文所描述的本发明信息的记录，或可存取此类制品的存储器存取装置。
[0145]
在计算机可读介质上“记录”数据、编程或其它信息是指使用本领域已知的任何此类方法存储信息的过程。基于用于存取所存储信息的方式，可以选择任何方便的数据存储结构。可以使用多种数据处理器程序和格式进行存储，例如文字处理文本文件、数据库格式等。
[0146]“处理器”是指将执行其所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文中的任何处理器都可以是例如以电子控制器、主机、服务器或个人计算机(例如，台式计算机或便携式计算机)的形式提供的可编程数字微处理器。在处理器可编程的情况下，可以将合适的编程从远程位置传送到处理器，或者可以将合适的编程预先保存在计算机程序产品中(例如便携式或固定式计算机可读存储介质，无论是磁性的、光学的还是基于固态装置的)。例如，磁性介质或光盘可以承载编程，并且可以由在其对应站与每个处理器通信的适当读取器读取。
[0147]
本发明主题系统的实施例可包括以下组件：(a)通信模块，用于促进系统与一个或多个用户之间例如经由用户计算机或工作站进行信息传送；以及(b)处理模块，用于执行所公开的定量分析方法中涉及的一个或多个任务。
[0148]
在某些实施例中，描述了计算机程序产品，其包含具有存储在其中的控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。控制逻辑当由计算机处理器执行时使处理器执行本文描述的功能。在其它实施例中，主要使用例如硬件状态机在硬件中实现一些功能。可以使用任何方便的方法和技术来实现硬件状态机以执行本文描述的功能。
[0149]
除了传感器装置和定量分析模块之外，本发明的系统和装置还可包括多个额外组件，例如数据输出装置，例如监视器、打印机和/或扬声器；数据输入装置，例如界面端口、键盘等；流体处理组件；电源等。
[0150]
实用性
[0151]
本发明主题的方法、系统和试剂盒可用于需要定量测定所关注结合相互作用的结合动力学参数的各种不同应用。在某些实施例中，结合相互作用是例如但不限于以下项的结合相互作用：核酸杂交、蛋白质-蛋白质相互作用(例如，如下文实验部分更详细地描述)、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用、蛋白质-核酸相互作用等。
[0152]
在一些情况下，本发明主题的方法、系统和试剂盒可用于可能需要实时观察分子结合相互作用的药物开发方案。例如，药物开发方案可以使用本发明主题的方法、系统和试剂盒来实时地监测抗体与抗原之间的分子结合相互作用，或核酸之间的杂交相互作用，或蛋白质之间的结合相互作用，或受体与配体之间的结合相互作用，或酶与底物之间的结合相互作用，或蛋白质与核酸之间的结合相互作用等。例如，cea和vegf是肿瘤标记物，而抗vegf抗体药物，例如贝伐单抗(阿瓦斯汀；基因泰克/罗氏公司)，是有效的抗癌药物。另一实例是抗epcam抗体，其已被配制成化疗药物，即依决洛单抗(edrecolomab)。监测这种结合相互作用可有助于开发其它基于抗体的药物。
[0153]
本发明主题的方法、系统和试剂盒也可用于分析复合物样品中包括的结合对之间的分子结合相互作用。在一些情况下，可以直接分析复合物样品，而无需将所关注结合分子与样品中可能存在的其它蛋白质或并非所关注的分子分离。在某些情况下，在本发明主题的方法、系统和试剂盒中，蛋白质或并非所关注的分子的非特异性结合以及未结合磁性纳米颗粒基本不会产生可检测的信号。因此，本发明主题的方法、系统和试剂盒可用于其中可使用复合物样品且可实时监测所关注结合相互作用而无需清洗检测所关注结合相互作用所需的传感器的分析方案。
[0154]
本文公开的实时结合分析和动力学模型可用于例如表位作图的应用。例如，gmr传感器阵列能够以高度并行的方式进行表位作图。利用捕获抗体，抗原可以选择性地固定在
传感器表面的特异性分子内配置中。可探测所捕获抗原上暴露的表位的动力学相互作用，以探测其与各种受体或抗体的亲和力。例如，表皮生长因子受体(egfr)能够结合egf本身以及含有egf样重复序列的蛋白质，例如epcam。通过使用不同的单克隆抗体捕获具有egf样重复序列的蛋白质，并检查egfr与这些定向蛋白质的结合，可以测定表位图以评估egfr与含有egf样重复序列的各种配体的亲和力。使用gmr传感器探测暴露的表位的应用范围从与特定靶的药物相互作用的大规模筛选到蛋白质组中特定所关注域的并行筛选。
[0155]
本发明主题的方法、系统和试剂盒也可用于在空间和时间两者上监测分子结合相互作用。例如，本发明主题的方法、系统和试剂盒可用于经由细胞蛋白分泌组分析监测局部细胞间通讯。通过在空间和时间上监测细胞蛋白分泌物的扩散，可以测定细胞间通讯的机制。
[0156]
本发明主题的方法、系统和试剂盒还可用于基础科学研究，以了解细胞生物学中信号转导所涉及的受体-配体结合相互作用，或针对整个蛋白质组剖析所关注特定化合物。另外，在临床医学中的应用也非常广泛，从定向蛋白质进化研究中的大规模筛选，到研究药物靶向和非靶向交叉反应结合动力学。
[0157]
本发明主题的方法、系统和试剂盒因在分析混合物包括复合物样品时允许测定结合动力学参数而可用于此类应用。
[0158]
计算机相关实施例
[0159]
某些实施例的方面还包括各种计算机相关实施例。具体而言，可以使用计算机执行前面章节中描述的数据分析方法。因此，实施例提供了基于计算机的系统，用于分析使用上述方法产生的数据，以便定量测定所关注结合相互作用的结合动力学参数。
[0160]
在某些实施例中，这些方法以“编程”的形式编码到计算机可读介质上，其中本文使用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和/或数据以供执行和/或处理的任何存储或传输介质。存储介质的实例包括软盘、磁带、cd-rom、dvd、蓝光、硬盘驱动器、rom或集成电路、磁光盘，或例如pcmcia卡或闪存卡的计算机可读卡等，无论此类装置是在计算机内部还是外部。包含信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”是指记录信息，以便计算机在以后可以存取和检索信息。所关注的介质是非暂时性介质，即编程与物理结构相关联的物理介质，例如记录在物理结构上的物理介质。非暂时性介质不包括经由无线协议传输的电子信号。
[0161]
关于计算机可读介质，“永久存储器”是指永久的存储器。永久存储器不会因计算机或处理器的电源中断而被擦除。计算机硬盘、cd-rom、蓝光、软盘和dvd都是永久存储器的实例。随机存取存储器(ram)是非永久存储器的实例。永久存储器中的文件可以是可编辑和可重写的。
[0162]
试剂盒
[0163]
还提供了用于实践上述方法的一个或多个实施例的试剂盒。本发明主题的试剂盒可能不同，并且可能包括各种装置和试剂。所关注的试剂和装置包括本文中关于磁性传感器装置或其组件(例如磁性传感器阵列或芯片)、磁性纳米颗粒、结合剂、缓冲剂等提及的试剂和装置。
[0164]
在一些情况下，试剂盒至少包括在方法中使用的试剂(例如，如上文所描述)；以及计算机可读介质，其具有存储在其上的计算机程序，其中计算机程序当加载到计算机中时
操作所述计算机，以根据从磁性传感器获得的实时信号定量测定第一和第二分子之间的结合相互作用的结合动力学参数；以及物理基板，其具有从中获得计算机程序的地址。
[0165]
除上述组件外，本发明主题的试剂盒还可包括用于实践本发明主题方法的说明。这些说明可能以多种形式存在于本发明主题的试剂盒中，其中一种或多种可能存在于试剂盒中。可以呈现这些说明的一种形式为适合介质或基板(例如，上面印刷有信息的纸片)上的印刷信息，其处于试剂盒的包装中，处于药品说明书中等。其它方式可以是其上记录了信息的计算机可读介质，例如软盘、cd、dvd、蓝光等。其它可能存在的方式是网站地址，可以通过互联网访问被删除网站上的信息。试剂盒中可能有任何方便的方式。
[0166]
以下实例仅为说明而非限制。
[0167]
实验
[0168]
一般方法
[0169]
在以下一般方案中采用了如osterfield等人，《美国国家科学院院刊(proc.nat'lacad.sci usa)》(2008)150：20637-206340和xu等人，《生物传感器与生物电子学(biosens.bioelectron)》(2008)24：99-103中描述的巨磁阻(gmr)传感器阵列：
[0170]
表面功能化：对传感器表面进行功能化，以使结合对成员(例如，捕获抗体、第一生物分子等)稳定缔合到传感器表面。可以使用例如聚乙烯亚胺(pei)的阳离子聚合物经由物理吸附将带电抗体非特异性结合到传感器表面。替代地，可以使用共价化学物质，利用抗体上的游离胺或游离硫醇基。xu等人，《生物传感器与生物电子学(biosens.bioelectron)》(2008)24：99-103中提供了关于寡核苷酸稳定附着的表面功能化的更多细节，而osterfield等人，《美国国家科学院院刊(proc.nat'l acad.sci usa)》(2008)150：20637-206340中提供了有关抗体的更多细节。然后将所关注结合对成员与传感器表面接触，以将结合成员稳定缔合到传感器表面。
[0171]
表面阻断：在表面功能化和结合对缔合后，阻断传感器表面以防止在分析过程中出现非特异性结合。为了阻断表面，将pbs中含有1％bsa的阻断缓冲剂加入反应井中1小时。xu等人，《生物传感器与生物电子学(biosens.bioelectron)》(2008)24：99-103和osterfield等人，《美国国家科学院院刊(proc.nat'l acad.sci usa)》(2008)150：20637-206340中描述了可能会用到的其它阻断方案。
[0172]
第一生物分子：阻断后，将传感器表面与所关注第一生物分子的溶液(例如，第一生物分子的纯化溶液或包括第一生物分子的复合物样品)接触。对于此步骤，使用含有约1nl至100μl溶液的反应井，培育时间从5分钟到2小时不等，具体取决于应用。
[0173]
第二生物分子：在培育之后，将含有预先用所关注标记进行标记的第二生物分子(例如，磁性纳米颗粒)的溶液与传感器表面接触。
[0174]
监测结合：接下来，监测第二生物分子与第一生物分子的结合动力学，并使用所述结合动力学根据结合轨迹计算结合速率常数。
[0175]
gmr传感器
[0176]
实验中使用的巨磁阻(gmr)传感器具有以下类型的底部自旋阀结构：si/ta(5)/种子层/irmn(8)/cofe(2)/ru/(0.8)/cofe(2)/cu(2.3)/cofe(1.5)/ta(3)，括号中的所有数字均以纳米为单位。每个芯片都包含gmr传感器阵列，所述阵列通过300nm厚的ta/au/ta导线连接到外围结合垫。为了保护传感器和导线免受腐蚀，通过离子束溅射沉积了两层钝化
层：首先，在所有传感器和导线上方沉积了sio2(10nm)/si3n4(20nm)/sio2(10nm)的薄钝化层，仅露出结合垫区域；其次，在参考传感器和导线顶部沉积了sio2(100nm)/si3n4(150nm)/sio2(100nm)的厚钝化层，暴露有源传感器和结合垫区域。图案化后的磁阻比大致为12％。自旋阀的钉扎方向为平面内且垂直于传感器条。自由层的易轴通过形状各向异性设置为与传感器条平行。这种配置允许gmr传感器在其mr传输曲线的最敏感区域工作。
[0177]
由于gmr效应，传感器的电阻随两个磁性层的磁化定向而变化，这两个磁性层由铜间隔层分离：
[0178][0179]
这里，r0是零磁场下的电阻，δr
max
是最大电阻变化，并且θ是两个磁性层的磁化之间的角度。在底部自旋阀结构中，底部磁性层(钉扎层)的磁化被钉扎到固定的方向，而顶部磁性层(自由层)的磁定向能够随外部磁场自由旋转。因此，来自磁性标签的杂散场会改变自由层的磁化且因此改变传感器的电阻。
[0180]
提供了用于测量结合动力学的方法，所述方法具有可单独寻址的磁响应纳米传感器阵列，以同时监测结合到固定在传感器表面上的其对应靶的许多相异蛋白质的动力学。这些磁纳米传感器已成功扩展到每1mm2芯片面积1,000多个传感器。展示了分析物表位作图，并显现了蛋白质在溶液中扩散的空间动力学。结合这些实验，推导出了分析动力学模型，所述模型精确描述标记蛋白质与表面固定蛋白质的实时结合。分析模型与使用表面等离子体共振和文献数据进行的类似实验非常吻合。此模型可用于灵敏度为20zeptomole(20
×
10-21
)或更低的溶质的抗体-抗原结合。
[0181]
用磁性纳米颗粒(mnp)预先标记可溶性配体，以监测配体复合物与固定在传感器表面的抗原的实时结合动力学。随着实时捕获复合物，来自抗体-mnp复合物的磁场导致底层gmr传感器中的电阻发生变化。由于gmr传感器阵列的快速实时读出，监测并量化了结合的动力学，从而测定相关联动力学速率常数。
[0182]
标记所关注蛋白质或抗体的mnp是包埋于葡聚糖聚合物中的十二个10nm氧化铁核，如通过tem分析测定。整个纳米颗粒的平均直径为46
±
13nm(来自数字加权动态光散射)。基于斯托克斯-爱因斯坦关系，这些颗粒的平移扩散系数大致为8.56
×
10-12
m2s-1
。mnp的电动电势为-11mv。这些颗粒具有超顺磁性且胶体稳定，因此在反应过程中不会聚集或沉淀。此外，gmr传感器作为磁性标记偶极场的近距离检测器工作；因此，仅检测到传感器表面150nm范围内的标记。因此，在没有结合的情况下，未结合的mnp标记产生的信号可以忽略不计。底层gmr传感器只能检测到结合的磁性标记抗体，这使得此mnp-gmr纳米传感器系统可用于实时动力学分析。
[0183]
gmr传感器阵列由1mm2芯片面积上1,008个传感器制成。计算出的特征密度为每cm2超过100,000个gmr传感器。传感器阵列设计成子阵列集合，其中每个子阵列占据90μm
×
90μm的面积。传感器阵列与机器人测位仪兼容。子阵列中的每个传感器都可以经由使用vlsi技术制造的共享6位控制总线通过行和列解码器单独寻址。gmr传感器阵列允许并行多重监测蛋白质结合动力学。
[0184]
磁性标签
[0185]
磁性标签是从miltenyi biotech inc.公司获得的，被称为“macs”颗粒。每个macs
颗粒是由10nmfe2o3纳米颗粒组成的簇，由葡聚糖基质连接在一起。由于fe2o3纳米颗粒的尺寸较小，因此macs颗粒具有超顺磁性，总直径为50nm且含有10％的磁性材料(wt/wt)。用所研究的对应分析物对macs颗粒进行了功能化。
[0186]
传感器表面
[0187]
首先用丙酮、甲醇和异丙醇清洗了传感器表面。随后，将传感器暴露于氧等离子体，保持三分钟。将去离子水中的2％(w/v)聚烯丙胺溶液施用于传感器，保持5分钟。可根据需要使用其它溶液，例如但不限于包括硬石膏、聚烯丙基羧酸盐等的溶液。然后用去离子水冲洗芯片，并在150℃下烘焙45分钟。对于羧化表面，然后在室温下将10％(w/v)edc溶液和10％(w/v)nhs溶液添加到传感器表面，保持1小时。
[0188]
动力学分析
[0189]
在用适当的捕获蛋白质对传感器表面功能化后，将gmr传感器阵列放置在测试站中并实时监测。洗掉bsa阻断缓冲剂，并将50μl磁性标记检测抗体溶液(如上所述制备)添加到反应井。随着磁性标记检测抗体与对应蛋白质结合，随着时间的推移而监测gmr传感器阵列。然后可以绘制每种蛋白质特有的结合曲线，并测定结合速率常数。分析持续5分钟。
[0190]
建模与拟合
[0191]
对实时信号采用传统的伪朗缪尔(pseudo-langmuir)曲线拟合。因此，根据以下方程计算得出k
on
、k
off
和kd的值：
[0192]
缔合曲线：s
t
＝s0·
[1-exp{-(c
·kon
+k
off
)
·
t})(1)
[0193]
解离曲线：s
t
＝a
·
exp{-k
off
·
t)(2)
[0194]
kd＝k
off
/k
on
(3)
[0195]
拟合误差定义如下：如果从一个芯片上测量n个信号曲线，并且曲线j有nj个数据点，如果d
i,j
表示为曲线j中的第i个数据点，并且s
i,j
表示为模拟曲线j中的第i个数据点，则信号曲线j的拟合误差为
[0196][0197]
其中d
max,j
是信号曲线的最大信号。以此方式，将传感器阵列中的每个实验结合曲线与根据模型预测的结合曲线进行比较。然后将此误差最小化，以获得最佳拟合并计算k
on
。绝对误差由信号曲线的最大信号表示，因此拟合误差是信号电平的百分比。因此，大信号曲线基于百分比的相对拟合误差与小信号曲线相似。总拟合误差为：
[0198][0199]
在拟合本文给出的动力学数据时，所述总拟合误差得到最小化。
[0200]
实例1：使用gmr传感器测量复合物样品的结合动力学参数
[0201]
使用gmr传感器测量结合动力学参数。通过以不同浓度施用天然人类tsh蛋白质来制备传感器表面，从不同浓度中选择最佳条件(浓度)进行动力学分析。
[0202]
将市售tsh抗体单独地共轭到磁性纳米颗粒(mnp)。根据常规方法阻断传感器表面和经修改mnp两者以防止非特异性相互作用。
[0203]
通过将经修改mnp直接施用到传感器来实现结合信号的实时读取。由于仅检测到近距离信号，因此其仅反映mpn与表面蛋白质的特异性结合。相互作用的机制如图1和图2所示。
[0204]
研究tsh蛋白质和抗体相互作用，其中分析混合物包括：(i)具有缓冲剂但没有血液样品的简单溶液；(ii)含有血浆的复合物溶液，以及(iii)具有不同量表面活性剂吐温20(也称为聚山梨醇酯20)的缓冲剂。使用高达80％的血浆和高达2％的吐温20。采用5405和5409两种tsh抗体。
[0205]
使用简单缓冲剂、25％血浆、50％血浆和80％血浆进行结合研究。图4示出简单、50％和80％样品的结果。在各图中，显示了原始数据和使用方程(2)至(4)的动力学最佳拟合曲线。基于最佳拟合曲线计算了k
on
、k
off
和kd的值，在所有情况下，产生的值的变化都小于10倍，如下表1所示，即使信号随着血浆的增加而下降。通常，不同样品的值(例如80％血浆对比简单缓冲剂)相差不到1倍，即相差不到100％。
[0206][0207]
如图4所示，平滑实时数据的值升高一段时间，即大致3分钟直到大致35分钟，之后所述值下降。因此，平滑实时数据的导数，即斜率，只有单次正负号变化。具体地，导数在大致3分钟到35分钟之间为正，且导数在约35分钟后为负。约3分钟到35分钟的间隔对应于缔合过程，即k
on
，而35分钟后的时间对应于解离过程，即k
off
。图4所示的最佳拟合线对应于使用上述方程(2)和(3)获得的拟合。
[0208]
另外，如图4的50％和80％样品数据中最清楚地展示，实时数据包含正方向或负方向上的微小和临时波动，这些波动与信号从约3分钟到约35分钟之间的总体值升高然后下降的总体进程无关。这种微小和暂时的波动可被视为统计噪声，并且可以通过消除这种微小和暂时的波动将原始实时数据转换为平滑实时数据。本领域已知对原始数据进行平滑处理的这些方式，并且可以采用对原始数据进行平滑处理的任何合适方式。
[0209]
实例2：将使用复合物样品和gmr传感器获得的参数与文献值进行比较
[0210]
在实施例1中计算得出的结合动力学参数之前已使用简单溶液和表面等离子体共振(spr)测量，即“文献值”。从下表2可见，根据实施例1的测量计算得出的参数始终在文献值的1倍差内，并且通常明显更接近。因此，实施例1的计算所得参数与文献值吻合。
[0211][0212]
实例3：使用spr传感器测量复合物样品的结合动力学参数
[0213]
接下来，使用biacore x100仪器测量了与实施例1相同的结合动力学参数，所述仪器采用表面等离子体共振(spr)代替gmr传感器。使用与实施例1相同的tsh蛋白质和抗体。缓冲剂是浓度为0％、0.01％、0.1％、1％和10％的bsa。
[0214]
然而，如图5a和5b所示，基于bsa的浓度，使用biacore x100仪器进行的测量显示出显著差异。因此，此类显著差异使用表示：当使用spr仪器时，bsa缓冲剂的存在干扰了结合动力学参数的精确测量。
[0215]
可以通过几种方式评估来自所关注组件以外组件的此类负干扰。在一些情况下，负干扰会导致平滑实时数据的导数有不止一次正负号变化。事实上，如图5b所示，即图5a截面的展开图，虽然四个最低浓度样品的信号一直升高直到急剧升高/急剧下降，但10％的样品最初短时间内升高，然后下降。在急剧升高/急剧下降后，10％样品的信号再次升高。
[0216]
因此，即使在10％的样品中没有出现急剧升高/急剧下降，信号也会升高、下降，然后再次升高，从而导致导数的正负号发生两次变化。相比之下，图4中使用本发明方法的磁性传感器的数据的导数只有一次正负号变化。
[0217]
此外，来自biacrore x100仪器的每个样品如图5a和5b所示显示出测量信号的瞬时快速变化波动，例如，10％样品的急剧升高/急剧下降，以及同时其它样品的快速变化。因此，此类变化导致实时数据的导数发生额外两次正负号变化。
[0218]
另外，如图5b的10％样品中清楚显示的，在恢复更为缓慢的值变化之前，信号先快速升高，然后下降。因此，平滑的10％样品实时数据的导数的绝对值明显高于导数的平均绝对值，即导数的绝对值比导数的平均绝对值高5倍。本文中考虑到，这种值的快速变化是不连续性的实例，所述不连续性例证了在测试条件下使用biacore x100仪器获得的实时数据产生的数据对结合动力学参数的精确估算能力较低。
[0219]
实例4：使用gmr传感器测量含有表面活性剂的复合物样品的结合动力学参数
[0220]
研究了聚山梨醇酯20(一种表面活性剂，也称吐温20和聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇月桂酸酯)对测量的结合动力学参数的影响。产生含有0.05％、0.5％、1％和2％的聚山梨醇酯20的分析混合物，并使用与tsh蛋白质结合的5405抗体进行测量。图6示出所得的原始数据和最佳拟合线，而下表3示出计算得出的结合动力学参数。如图6所示，每个样品的实时数据的导数包含单次正负号变化。此外，图6的实时数据不包含会抑制精确计算结合参数的能力的任何快速值变化。
[0221][0222]
因此，研究发现，即使聚山梨醇酯20的浓度达到至少2％，也可以获得一致的参数值。
[0223]
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但是本领域的技术人员根据本发明的教示很容易明白的是，可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
[0224]
因此，前述内容仅说明本发明的原理。应了解，本领域技术人员将能够设计不同的布置，所述不同的布置虽然没有在本文中明确地描述或显示，但体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围之内。此外，本文中叙述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和由发明人为本领域技术发展所贡献的概念，并且应解释为但不限于这种具体叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施例以及其具体
实例的所有陈述旨在涵盖其结构等效物和其功能等效物两者。另外，这种等效物旨在包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者，即，所开发的执行相同功能的任何要素，而不考虑结构。因此，本发明的范围不旨在受限于本文中所示出和描述的示例性实施例。而是，本发明的范围和精神通过所附权利要求来具体化。