一种农业使用的聚谷氨酸的含量分析方法与流程

本发明涉及化学检测分析技术领域，具体涉及一种农业使用的聚谷氨酸的含量分析方法。

背景技术：

聚谷氨酸(γ-pga)，又称纳豆菌胶、多聚谷氨酸，它是一种使用微生物发酵法制得的生物高分子，具有水溶性、可生物降解、不含毒性。其作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。

聚谷氨酸的研究主要包括对它性质研究、产生菌的改良和基因研究、发酵过程研究和提取提取纯化过程研究以及衍生物的生产和性质的研究。目前针对聚谷氨酸的检测方法，一般采用氨基酸分析仪法和凝胶色谱法和柱前衍生高效液相色谱法，但是前两种仪器价格昂贵、普及应用性较低；现有的柱前衍生高效液相色谱法所用色谱条件测定聚谷氨酸含量的方法精度不高。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种农业使用的聚谷氨酸的含量分析方法，采用高效液相色谱法，所检测聚谷氨酸的含量一般在20-30％，以谷氨酸为标样，甘氨酸为内标物，通过优化色谱条件检测农业使用的聚谷氨酸含量，该方法价格低廉，容易得到高含量的纯品，精密度好。

一种农业使用的聚谷氨酸的含量的分析方法，采用高效液相色谱分析方法，试样(聚谷氨酸)用盐酸在高温下分解，蒸发除去盐酸，以谷氨酸为标准物质，甘氨酸为内标物，在三乙胺的乙腈溶液催化作用下，以异硫氰酸苯酯的乙腈溶液进行衍生，经正己烷萃取、蒸馏水稀释后分别得到标准溶液和试样溶液，乙腈和甲酸铵水为流动相，在235-270nm下得到理想的色谱峰形，通过与标准物质的比对，分别计算被测样品中的谷氨酸的总量和游离谷氨酸含量，总谷氨酸含量减去游离谷氨酸的含量即为样品中聚谷氨酸含量。

一种农业使用的聚谷氨酸的含量分析方法，采用高效液相色谱，具体方法如下：

(1)试样用盐酸溶解后蒸发除去盐酸，以谷氨酸为标准物质，以甘氨酸为内标物，在三乙胺的乙腈溶液催化下，以异硫氰酸苯酯的乙腈溶液进行衍生，然后经正己烷萃取、蒸馏水稀释后分别得到试样及标样；

(2)将高效液相色谱的检测波长设定在235-270nm，待仪器基线稳定后按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，分别对标样和试样的峰面积进行平均，得标样和试样的峰面积平均值；

(3)按照下式对谷氨酸衍生物的质量分数进行计算：

式中：

as——标样中，谷氨酸或游离谷氨酸衍生物峰面积的平均值；

ar——标样中，内标物甘氨酸衍生物峰面积的平均值；

mr——标样中称取内标物甘氨酸的质量；

ms——标样中称取谷氨酸的质量；

f——标样中谷氨酸或游离谷氨酸衍生物与甘氨酸衍生物的校正因子；

xi——试样中谷氨酸的质量分数；

ai——试样中，谷氨酸或游离谷氨酸衍生物峰面积的平均值；

mi——试样称取的质量；

m1——试样中称取内标物甘氨酸的质量；

a1——试样中，内标物甘氨酸衍生物峰面积的平均值；

f1——试样中谷氨酸或游离谷氨酸衍生物与甘氨酸衍生物的校正因子；

聚谷氨酸含量＝谷氨酸总含量-游离谷氨酸含量；

其中，高效液相色谱条件包括：流动相为乙腈与甲酸铵水溶液的混合体系，乙腈与甲酸铵水溶液体积比为3:97-15:85，甲酸铵水溶液的浓度为10-100mmol/l。

优选的，步骤(1)中盐酸浓度为0.5mol/l，溶解时间24-36h，溶解温度为100-100℃。

优选的，步骤(1)中衍生时间为0.5-2.5h，衍生温度为20-60℃；更优选的，衍生时间为1h，衍生温度为40℃。采用柱前衍生高效液相色谱检测聚谷氨酸含量的方法，重复性好，可信度高。

优选的，步骤(2)中乙腈与甲酸铵水溶液的体积比为5:95，甲酸铵水溶液的浓度为80mmol/l。不同的流动相极性不同，通过更改流动相比例可以改变其流动相的极性大小，从而影响样品在流动相之间的分配比例，进而达到分离结果，该比例可以获得更好的分离效果。

优选的，步骤(2)中高效液相色谱所用色谱柱为硅胶键合c18的色谱柱，更优选为大连依利特hypersilods2150*4.6mm，柱温为40℃。

优选的，步骤(2)中进样体积为20μl，流动相的流速为0.8ml/min。

优选的，步骤(2)中检测波长为254nm。该检测波长下，得到的色谱峰型比较好。

本发明的有益效果在于，

(1)采用高效液相法对农业使用的聚谷氨酸的含量进行分析，专属性强，精密度好；色谱柱为大连依利特hypersilods2150*4.6mm，峰型改善明显，理论塔板数更高；流动相为乙腈与甲酸铵水溶液的混合体系，乙腈与甲酸铵水溶液体积比为3:97-15:85，甲酸铵水溶液的浓度为10-100mmol/l，分离效果更好；检测波长设定在235-270nm，在该波长范围内，谷氨酸有较好的紫外吸收，且吸收稳定，提高了检测的精度和稳定性；

(2)本发明提供了一种全新的检测农业使用的聚谷氨酸的质量分数的方法，色谱峰形良好，积分计算结果准确、重复性好，所得的结果可信度高，特别适用于农业使用的聚谷氨酸的质量控制，对保证最终产品的质量具有重要作用和现实意义，所得结果更加准确及时。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中的标样色谱图；图中3.076min为谷氨酸衍生物的色谱峰，5.193min为内标物(甘氨酸)的衍生物的色谱峰；

图2为实施例1中的样品色谱图；

图3为试验例2中的线性关系图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

采购聚谷氨酸液体肥料50公斤，取样。

色谱柱条件：采用大连依利特hypersilods2150*4.6mm，柱长150毫米，柱温为40℃，理论塔板数5000；

流动相为乙腈与甲酸铵水溶液的混合体系，乙腈与甲酸铵水溶液的体积比为5:95，甲酸铵水溶液的浓度为80mmol/l，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，进样体积为20μl。

三乙胺的乙腈溶液配制

准确量取1.4ml三乙胺溶液置于10ml容量瓶中，再量取8.6ml乙腈置于该容量瓶中，摇匀备用。

异硫氰酸苯酯的乙腈溶液配制

移液枪准确移取25μl异硫氰酸苯酯置于5ml离心管中，加入2ml乙腈溶液，混合均匀，备用。

标样储备液配制

准确称取谷氨酸标样0.0504g(精确至0.0002g)，内标物(甘氨酸)0.0532g(精确至0.0002g)置于100ml容量瓶中，加0.5mol/ml盐酸溶解后(约2ml)，用蒸馏水稀释至刻度，得到标样储备液。

试样水解处理及水解储备液配制(总谷氨酸含量)

准确称取聚谷氨酸试样0.2518g(精确至0.0002g)试样，置于10ml容量瓶中，加入0.5mol/lhcl(1+1)约10ml溶解后，封口膜密封，置于100-110℃烘箱中水解36h，然后将溶液转移至200ml烧杯中，用蒸馏水洗涤3次容量瓶，并将洗涤液转移至烧杯中，置于水浴锅上方，利用蒸汽将盐酸水蒸发至蒸干。再准确称取0.0521g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到试样储备液1。

试样储备液配制(游离谷氨酸含量)

准确称取聚谷氨酸试样0.2502g(精确至0.0002g)试样，0.0505g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到试样储备液2。

标样及试样衍生处理

准确量取标样及试样储备液(试样储备液1或试样储备液2)200μl置于1.5ml离心管中，加入三乙胺的乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl，混合均匀，40℃放置1h。再分别加入400μl正己烷置于离心管中，振摇后放置10min，取下层溶液，过滤，再分别取滤液200μl，加入二次蒸馏水800μl后进样，进样体积20μl。

测试与数据处理

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％之后，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在254nm波长下检测，标样色谱图如图1所示，样品色谱图如图2所示，获得总谷氨酸数据如表1所示：

表1实施例1总谷氨酸相关测试数据

将表1数据带入公式：

计算可得样品中总谷氨酸的质量分数为20.40％。

获得游离谷氨酸数据如表2所示：

表1实施例1游离谷氨酸相关测试数据

将表2中数据带入公式：

计算可得样品中游离谷氨酸的质量分数为0.10％。

由聚谷氨酸含量＝谷氨酸总含量-游离谷氨酸含量，计算可得样品中聚谷氨酸的质量分数为20.30％。

实施例2

采购聚谷氨酸肥料100公斤，取样。

色谱柱条件：采用大连依利特hypersilods2150*4.6mm，柱长150毫米，柱温为40℃，理论塔板数5000；

以乙腈：80mmol/l甲酸铵水体积比＝5:95为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，进样体积为20μl。

三乙胺的乙腈溶液配制

准确量取1.4ml三乙胺溶液置于10ml容量瓶中，再量取8.6ml乙腈置于该容量瓶中，摇匀备用。

异硫氰酸苯酯的乙腈溶液配制

移液枪准确移取25μl异硫氰酸苯酯置于5ml离心管中，加入2ml乙腈溶液，混合均匀，备用。

标样储备液配制

准确称取谷氨酸标样0.0518g(精确至0.0002g)，内标物(谷氨酸)0.0531g(精确至0.0002g)置于100ml容量瓶中，加入2ml0.5mol/lhcl溶解后，用蒸馏水稀释至刻度，得到标样储备液

试样水解处理及储备液配制(总谷氨酸含量)

准确称取聚谷氨酸试样0.2503g(精确至0.0002g)试样，置于10ml容量瓶中，加入hcl(1+1)约10ml溶解后，封口膜密封，置于100-110℃烘箱中水解36h，然后将溶液转移至200ml烧杯中，用蒸馏水洗涤3次容量瓶，并将洗涤液转移至烧杯中，置于水浴锅上方，利用蒸汽将盐酸水蒸发至蒸干。再准确称取0.0509g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到试样储备液3。

试样储备液配制(游离谷氨酸含量)

准确称取聚谷氨酸试样0.2506g(精确至0.0002g)试样，0.0508g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到试样储备液4。

标样及试样衍生处理

准确量取标样及试样储备液试样储备液(试样储备液3或试样储备液4)200μl置于1.5ml离心管中，加入三乙胺的乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl，混合均匀，40℃放置1h。再分别加入400μl正己烷置于离心管中，振摇后放置10min，取下层溶液，过滤，再分别取滤液200μl，加入二次蒸馏水800μl后进样，进样体积20μl。

测试与数据处理

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％之后，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在254nm波长下检测，获得总谷氨酸数据如表3所示：

表3实施例2总谷氨酸相关数据

将表3中数据带入公式：

计算可得样品中总谷氨酸的质量分数为20.43％。

游离谷氨酸数据如表4所示：

表4游离谷氨酸相关数据

将表4数据带入公式：

计算可得样品中游离谷氨酸的质量分数为0.11％。

由聚谷氨酸含量＝谷氨酸总含量-游离谷氨酸含量，计算可得样品中聚谷氨酸的质量分数为20.32％。

试验例1重复性试验

采购聚谷氨酸肥料180公斤，取样。

色谱柱条件：采用粒径为4.6微米的，硅胶键合c18的填充柱，柱长150毫米，柱温为40℃，理论塔板数5000；

以乙腈：80mmol/l甲酸铵水体积比＝5:95为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，进样体积为20μl。

三乙胺的乙腈溶液配制

准确量取1.4ml三乙胺溶液置于10ml容量瓶中，再量取8.6ml乙腈置于该容量瓶中，摇匀备用。

异硫氰酸苯酯的乙腈溶液配制

移液枪准确移取25μl异硫氰酸苯酯置于5ml离心管中，加入2ml乙腈溶液，混合均匀，备用。

标样储备液配制

准确称取谷氨酸标样0.0509g(精确至0.0002g)，内标物(甘氨酸)0.0515g(精确至0.0002g)置于100ml容量瓶中，加入2ml0.5mol/lhcl溶解后，用蒸馏水稀释至刻度，得到标样储备液

试样水解处理及储备液配制(总谷氨酸含量)

准确折百称取含谷氨酸试样0.05g(精确至0.0002g)试样6份，分别置于10ml容量瓶中，加入hcl(1+1)约10ml溶解后，封口膜密封，置于100-110℃烘箱中水解36h，然后将溶液转移至200ml烧杯中，用蒸馏水洗涤3次容量瓶，并将洗涤液转移至烧杯中，置于水浴锅上方，利用蒸汽将盐酸水蒸发至蒸干。再准确称取0.05g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到6份试样储备溶液。

试样储备液配制(游离谷氨酸含量)

准确称取含谷氨酸试样0.05g(精确至0.0002g)试样6份，分别称取0.05g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到试样储备液。

标样及试样衍生处理

准确量取标样及各试样储备液200μl置于1.5ml离心管中，加入三乙胺的乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl，混合均匀，40℃放置1h。再分别加入400μl正己烷置于离心管中，振摇后放置10min，取下层溶液，过滤，再分别取滤液200μl，加入二次蒸馏水800μl后进样，进样体积20μl。

测试与数据处理

开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5％后，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在254nm进行扫描，杂质分离完全，峰形良好，按公式计算试样的有效成分谷氨酸含量，按上述过程对六份试样进行分别检测，结果列于表5，由表中数据可见，该方法实验结果重复性良好。

表5试样中总谷氨酸含量

计算试样中游离谷氨酸含量，按上述过程对六份试样进行分别检测，结果列于表6，由表中数据可见，该方法实验结果重复性良好。

表6试样中游离谷氨酸含量

聚谷氨酸含量＝谷氨酸总含量-游离谷氨酸含量，计算可得样品中聚谷氨酸的平均含量为20.37％，相对标准偏差0.1232％，此可见，该方法实验结果重复性良好。

试验例2线性试验

色谱柱条件：采用粒径为4.6微米的，硅胶键合c18的填充柱，柱长150毫米，柱温为40℃，理论塔板数5000；

以乙腈：80mmol/l甲酸铵水体积比＝5:95为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，进样体积为20μl。

三乙胺的乙腈溶液配制

准确量取1.4ml三乙胺溶液置于10ml容量瓶中，再量取8.6ml乙腈置于该容量瓶中，摇匀备用。

异硫氰酸苯酯的乙腈溶液配制

移液枪准确移取25μl异硫氰酸苯酯置于5ml离心管中，加入2ml乙腈溶液，混合均匀，备用。

标样储备液配制

准确称取标样谷氨酸0.0251g(内标0.0502g)，0.0362g(内标0.0505g)，0.0423g(内标0.0503g)，0.0562g(内标0.0504g)，0.0680g(内标0.0502g)，0.0799g(内标0.0501g)(精确至0.0002g)试样6份，分别置于10ml容量瓶加入hcl(1+1)约10ml溶解后，封口膜密封，置于100-110℃烘箱中水解36h，然后将溶液转移至200ml烧杯中，用蒸馏水洗涤3次容量瓶，并将洗涤液转移至烧杯中，置于水浴锅上方，利用蒸汽将盐酸水蒸发至蒸干，加入100ml蒸馏水溶解，得到6份试样储备溶液，其中谷氨酸浓度分别为251ug/ml，362ug/ml，423ug/ml，562ug/ml，680ug/ml，799ug/ml。

标样衍生处理

准确量取标样及各试样储备液200μl置于1.5ml离心管中，加入三乙胺的乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl，混合均匀，40℃放置1h。再分别加入400μl正己烷置于离心管中，振摇后放置10min，取下层溶液，过滤，再分别取滤液200μl，加入二次蒸馏水800μl后进样，进样体积20μl。

测试与数据处理

依次在254nm进行测定，以谷氨酸与内标物质量比对谷氨酸与内标物的峰面积比值，作线性回归，得到的回归方程为

y＝0.9567x-0.0002

r²＝1

可见聚谷氨酸在200～700ug/ml范围内线性关系良好。

试验例3稳定性试验

色谱柱条件：采用粒径为4.6微米的，硅胶键合c18的填充柱，柱长150毫米，柱温为40℃，理论塔板数5000；

以乙腈：80mmol/l甲酸铵水体积比＝5:95为流动相，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm，进样体积为20μl。

三乙胺的乙腈溶液配制

准确量取1.4ml三乙胺溶液置于10ml容量瓶中，再量取8.6ml乙腈置于该容量瓶中，摇匀备用。

异硫氰酸苯酯的乙腈溶液配制

移液枪准确移取25μl异硫氰酸苯酯置于5ml离心管中，加入2ml乙腈溶液，混合均匀，备用。

标样储备液配制

准确称取谷氨酸标样0.0503g(精确至0.0002g)，内标物(甘氨酸)0.0512g(精确至0.0002g)置于100ml容量瓶中，加入2ml0.5mol/lhcl溶解后，用蒸馏水稀释至刻度，得到标样储备液

试样水解处理及储备液配制

准确称取聚谷氨酸肥料试样0.2423g(精确至0.0002g)试样，置于10ml容量瓶中，加入hcl(1+1)约10ml溶解后，封口膜密封，置于100-110℃烘箱中水解36h，然后将溶液转移至200ml烧杯中，用蒸馏水洗涤3次容量瓶，并将洗涤液转移至烧杯中，置于水浴锅上方，利用蒸汽将盐酸水蒸发至蒸干。再准确称取0.0521g甘氨酸(内标物)于烧杯中，加入100ml蒸馏水溶解，得到试样储备溶液。

试样衍生处理

准确量取试样储备液200μl置于1.5ml离心管中，加入三乙胺的乙腈溶液100μl，异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μl，混合均匀，40℃放置1h。再分别加入400μl正己烷置于离心管中，振摇后放置10min，取下层溶液，过滤，再分别取滤液200μl，加入二次蒸馏水800μl后进样，进样体积20μl。

测试与数据处理

制备后在0.1.2.4.8.24小时分别进行检测，不同时间依法在254nm进行扫描测定，杂质分离完全，峰形良好，计算试样的有效成分含量，结果列于表7。由表7中数据如下，该方法实验结果时间稳定性良好。

表7稳定性试验测试结果

由上述试验例可知，本发明所提供的农业使用的聚谷氨酸含量的分析方法准确性高，可操作性好，可以广泛的应用到聚谷氨酸肥料含量的分析检测中。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。