一种多重数字化ELISA检测方法及微流控芯片与流程

本发明涉及快速检测医疗器械领域，特别涉及一种多重数字化elisa检测方法及微流控芯片。

背景技术：

现场快速检验亦称为即时检测，是在病人床旁或采样现场进行的即刻检测与分析，不依赖于临床检验师和复杂的实验室流程，能够满足医疗条件较差的偏远区域、突发应急公共卫生事件或疾病筛查等对现场快速检测的需求。

疾病的诊断以及疗效的判断都需要对多个靶点(包括基因或蛋白等)进行联合检测与分析，这对传统检验领域的快速性和全面性提出了新的挑战。

单一的靶标检测消耗样品多，耗时长，人工和试剂成本高昂，无法满足临床疾病的大规模筛查和诊断需求，而目前已有的多重检测方法其检测通量也仅在几种或十几种，因此，如果能够大大提高检测通量进行平行多路检测，就能够显著提高检测效率进而实现疾病的实时快速监测，此外，在进行多重检测时也存在着检测限低、靶标分子相互串扰的问题，导致检测的灵敏度和特异性较差。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种多重数字化elisa检测方法，以达到高通量靶标平行检测、样品消耗少、时间和劳力花费低、高灵敏度和特异性的目的；还提供一种微流控芯片。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的一种多重数字化elisa检测方法，其应用在微流控芯片上，包括如下步骤：

步骤s1、将不同半径尺寸和颜色设定的双重分类编码微球分别结合上相应的检测抗体；

步骤s2、将步骤s1的微球灌入至微流控芯片的微球分区排布芯片内，使得微球在自身流体作用下按照尺寸排列在微球分区排布芯片内相应的区域；

步骤s3、向微流控芯片内灌入带有靶标分子的样品和与检测抗体相对应、含有荧光分子的结合抗体，首先样品中靶标分子与微球上检测抗体结合，其次结合抗体与样品中靶标分子结合，使得微球上携带有与靶标分子含量对应的荧光分子；

步骤s4、将微流控芯片进行荧光信号的采集，根据微球在微球分区排布芯片内所在区域和微球的自身荧光区分靶标分子的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中该靶标分子的浓度。

进一步地，在步骤s2内，微球分区排布芯片设置有微球排布区域，微球排布区域含有多个微球捕获阵列，多个微球捕获阵列具有不同间隔的微球放置位。

进一步地，每个微球捕获阵列由间隔大小相同的多个微柱组成；微流控芯片设有不同大小开口且平行排布的微柱屏障，用于筛选不同尺寸的微球。

进一步地，在步骤s1内，微球上设定两种不同比例混合的颜色，与微球的不同半径尺寸一起组成三维编码方式。

进一步地，微流控芯片通过微纳技术或3d打印技术制备而成。

进一步地，从微流控芯片的入口到出口，在微球捕获阵列内微柱的间隔尺寸由大到小依次减小。

进一步地，微柱包括正方形柱子、圆形柱子、三角形柱子、菱形柱子、八边形柱子、花瓣形柱子、星形柱子。

一种微流控芯片，包括底层芯片、设置在底层芯片上的微球分区排布芯片及不同半径尺寸且不同颜色双重编码的微球，微球分区排布芯片设置有微球排布区域，微球排布区域含有多个微球捕获阵列，多个微球捕获阵列具有不同间隔的微球放置位，每个微球捕获阵列由间隔大小相同的多个微柱组成；微流控芯片设有不同大小开口且平行排布的微柱屏障，用于筛选不同尺寸的微球。

进一步地，微柱包括正方形柱子、圆形柱子、三角形柱子、菱形柱子、八边形柱子、花瓣形柱子、星形柱子。

进一步地，底层芯片包括相连接的上壳和下壳，底层芯片的前后两端设置有出口和入口；从微流控芯片的入口到出口，在微球捕获阵列内微柱的间隔尺寸由大到小依次减小。

在本发明内，先将不同半径尺寸和颜色依赖的微球分别结合上相应的检测抗体；再将微球灌入至微流控芯片的微球分区排布芯片内，使得微球按照尺寸排列在微球分区排布芯片内相应的区域；向微流控芯片内灌入带有靶标分子的样品和相对应的结合抗体，结合抗体与样品中靶标分子结合，样品中靶标分子与微球中检测抗体结合，使得微球上携带有与靶标分子含量对应的荧光分子；最后将微流控芯片进行荧光信号的采集，根据微球在微球分区排布芯片内所在区域和不同分类颜色的荧光区分靶标的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中靶标分子的浓度；以达到高通量靶标平行检测、样品消耗少、时间和劳力花费低、高灵敏度和特异性的目的。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明的多重数字化elisa检测方法的步骤框图；

图2为本发明的微球芯片的平面示意图；

图3为本发明的微球芯片的立体结构示意图；

图4为本发明的微球示意图；

图5为本发明的微球分区排布芯片的检测示意图；

其中附图标记为：1-底层芯片，2-微柱捕获阵列，3-微球分区排布芯片，4-入口，5-出口。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

如图1至图5所示，本发明的一种多重数字化elisa检测方法，其应用在微流控芯片上，包括如下步骤：

步骤s1、将不同半径尺寸和颜色设定的双重分类编码微球分别结合上相应的检测抗体；

步骤s2、将步骤s1的微球灌入至微流控芯片的微球分区排布芯片内，使得微球在自身流体作用下按照尺寸排列在微球分区排布芯片内相应的区域；

步骤s3、向微流控芯片内灌入带有靶标分子的样品和与检测抗体相对应、含有荧光分子的结合抗体，首先样品中靶标分子与微球上检测抗体结合，其次结合抗体与样品中靶标分子结合，使得微球上携带有与靶标分子含量对应的荧光分子；

步骤s4、将微流控芯片进行荧光信号的采集，根据微球在微球分区排布芯片内所在区域和微球的自身荧光区分靶标分子的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中该靶标分子的浓度。

在本发明内，先将不同半径尺寸和颜色依赖的微球分别结合上相应的检测抗体；再将微球灌入至微流控芯片的微球分区排布芯片内，使得微球按照尺寸排列在微球分区排布芯片内相应的区域；向微流控芯片内灌入带有靶标分子的样品和相对应的结合抗体，结合抗体与样品中靶标分子结合，样品中靶标分子与微球中检测抗体结合，使得微球上携带有与靶标分子含量对应的荧光分子；最后将微流控芯片进行荧光信号的采集，根据微球在微球分区排布芯片内所在区域和不同分类颜色的荧光区分靶标的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中靶标分子的浓度；以达到高通量靶标平行检测、样品消耗少、时间和劳力花费低、高灵敏度和特异性的目的。

具体地，该方法应用在多靶标同时检测上，包括如下步骤：

步骤s1、不同半径尺寸不同半径尺寸和颜色设定的双重分类编码微球分别结合上相应的检测抗体；

步骤s2、将步骤s1的微球灌入至含有不同尺寸微柱屏障的微流控芯片内，使得微球在流体作用下按照微柱屏障开口大小排列在芯片内相应的屏障区域；

步骤s3、向微流控芯片内灌入带有靶标分子的样品和与检测抗体相对应且携带有荧光分子的结合抗体，首先样品中靶标分子与微球上检测抗体结合，然后结合抗体与样品中靶标分子结合，使得微球上携带有与靶标分子含量对应的荧光分子；

步骤s4、将微流控芯片进行荧光信号的采集，根据微球在微流控芯片内所在屏障区域和微球的自身荧光区分靶标分子的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中该靶标分子的浓度。

其中，在步骤s2内，微流控芯片设有不同大小开口且平行排布的微柱屏障，用于筛选不同尺寸的微球。

其中，每个微柱屏障由一系列连续重复且间隔相同的立柱组成，每个微柱屏障开口大小与微球的尺寸相对应。

其中，微柱包括立方柱、圆柱、三角柱、菱柱、八边柱。

其中，从微流控芯片的入口到出口，微柱屏障的开口由大到小依次减小。

其中，在步骤s1中，微球上设定不同比例混合的颜色，与微球的不同半径尺寸一起组成双重分类编码方式。

其中，微球的颜色特征是通过不同种颜色不同比例混合获得。

其中，微球不同种颜色的混合方法包括有添加荧光染料、量子点与微球复合、微球掺杂多色发光的上转换纳米粒子、荧光寿命编码微球、表面增强拉曼散射光谱编码微球以及结构颜色编码微球。

在本发明内，先将不同半径尺寸和颜色依赖的微球分别结合上相应的检测抗体；再将微球灌入至微流控芯片的不同尺寸微柱屏障，使得微球按照尺寸排列在芯片内相应的屏障区域；向微流控芯片内灌入带有靶标分子的样品和相应种类的结合抗体，结合抗体与样品中靶标分子结合，样品中靶标分子与微球中检测抗体结合，使得微球上携带荧光分子；最后将微流控芯片进行荧光信号的采集，根据微球在微流控芯片内所在的屏障区域和不同分类颜色的荧光区分靶标的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中靶标分子的浓度；以达到高通量靶标平行检测、样品消耗少、时间和劳力花费低、高灵敏度和特异性的目的。

其中，在步骤s1内，微球上设定不同颜色或尺寸，不同半径尺寸的微球可设定的颜色是通过不同种颜色不同比例混合获得。具体地讲，如选择红色和蓝色两种染料，添加一份蓝九份红得到的微球颜色与添加一份红九份蓝的微球颜色不同，由此类推，假设有a种染料，每种染料有b份，可获得的微球颜色类型就有b^a/2种。再假设微球的尺寸有c种，采用不同半径尺寸、颜色双重编码的微球则有b^a/2×c种。尺寸和颜色双重编码的微球作为检测的固相表面，装载有b^a/2×c种检测抗体，进行b^a/2×c种靶标的检测，即一种种类的微球对应一种检测抗体，其中一种种类指代直径尺寸及颜色种类和比例均相同，任一要素(直径尺寸、颜色种类、颜色比例)不同即表示不同种类的微球。

微球的类型除了尺寸不同之外，还主要包括颜色的不同。颜色的特征是通过不同种颜色不同比例混合获得。如选择红色和蓝色两种染料，添加一份蓝九份红得到的微球颜色与添加一份红九份蓝的微球颜色不同，由此类推，假设有a种染料，每种染料有b份，可获得的微球颜色类型就有b^a/2种。

在步骤s2内，微流控芯片设有不同大小开口且平行排布的微柱屏障，用于筛选不同尺寸的微球。每个微柱屏障由一系列连续重复且间隔相同的立柱组成，微柱包括立方柱、圆柱、三角柱、菱柱、八边柱，每个微柱屏障开口大小与微球的尺寸相对应。从微流控芯片的入口到出口，微柱屏障的开口由大到小依次减小，半径尺寸介于两种微柱屏障开口尺寸的微球则排列在这两种微柱屏障之间。

在本发明中，微球不同种颜色的混合方法包括有添加荧光染料、量子点与微球复合、微球掺杂多色发光的上转换纳米粒子、荧光寿命编码微球、表面增强拉曼散射光谱编码微球以及结构颜色编码微球。

在步骤s2内，微球分区排布芯片设置微球排布区域，微球排布区域含有不同间隔排布的微球捕获阵列，微球捕获阵列由不同间隔大小的微柱组成，从微流控芯片的入口到出口，在微球捕获阵列内微柱的间隔尺寸由大到小依次减小，微柱包括正方形柱子、圆形柱子、三角形柱子、菱形柱子、八边形柱子、花瓣形柱子、星形柱子；具体地讲，底层芯片1设有不同半径尺寸间隔的微柱捕获阵列2、微球分区排布芯片3以及入口4、出口5，如图1所示，微球分区排布芯片3设有平行排布的不同半径尺寸间隔的微柱捕获阵列2，从入口4到出口5微柱的间隔尺寸由大到小依次减小，直径介于两种微柱间隔尺寸之间的微球则分布在这两种微柱阵列中间。

本发明设计的一种含有不同尺寸间隔微柱阵列的微流控芯片，从而使得不同尺寸的微球分区排布在芯片内的相应位置上。微球无需外在手段使之固定在芯片内，通过尺寸的限定就可以将不同尺寸的微球分隔开来。

在本发明内，微球分区排布芯片的微柱可由微纳加工技术或3d打印获得。本发明设计的微流控芯片通过微纳技术或3d打印技术制备而成，微球被微柱屏障的开口大小限制后固定在芯片界面上，无需外在复杂的设备手段。芯片表面可以通过不同的修饰使得微球与之更好地附着。并且，芯片具有集成的功能，能够实现微球固定、抗体孵育、信号检测等多个功能为一体。另一方面，该微流控芯片不是开放式的，为检测提供了相对封闭的空间，减少样品消耗和外在污染，同时较小体积的反应也能够提高检测灵敏度。

在本发明内，先将不同半径尺寸和颜色依赖的微球分别结合上相应的检测抗体，在微球分区排布芯片灌入微球，使得微球按照尺寸排列在相应的区域，再灌入样品和相对应的结合抗体，样品和结合抗体流经不同的微球排布区域时，样品中的靶标分子通过微球上的检测抗体与微球结合，结合抗体再与靶标分子结合使之携带有与靶标分子含量对应的荧光分子，最后再将微流控芯片置于荧光显微镜或荧光扫描仪进行检测，根据微球所在区域和不同分类颜色的荧光区分靶标的类型，根据微球上的结合抗体荧光强度分析样品中该靶标的浓度。

在本发明内，在微球的表面可带有羧基/氨基/苯磺酰基基团，与带有氨基/羧基基团的结合抗体或抗原结合，通过双抗夹心法或竞争法检测样品中的靶标分子，检测抗体(抗原)中带有荧光分子，与待测样品结合后使待测样品分子携带荧光，实现检测结果的可视化，其荧光信号强度与样品中的靶标分子含量呈正相关或负相关。

在本发明内，在微球表面修饰有检测抗体，能够与样品中的靶标分子快速结合，整个免疫反应(双抗夹心法或竞争法)在均匀的液相体系中进行，速度快，反应均一性好，此外，微球可进行彩色编码，不同的色彩可以对应不同检测项目，这样进一步增加了检测通量。

在本发明内，结合靶标分子的检测抗体携带的荧光分子使靶标分子带有荧光，通过测定荧光强度推断出样品浓度。

本发明在微球的颜色分类编码的基础上增加了尺寸分类编码，提高了检测通量，同时，仅获取和分析荧光信号就能得出检测靶标的全部信息，能够满足多靶标检测的快速反应需求。

在本发明内，微球的表面上修饰有不同的检测抗体，样品流经微球时，样品中的靶标分子就与微球上的检测抗体结合，未结合的靶标分子则随着流体排出微流控芯片外,再加入含有荧光分子的结合抗体，流经微流控芯片的试剂通道时，结合抗体与微球上的靶标分子再结合，使靶标分子携带上荧光信号，微球上靶标分子的荧光强度与样品中的靶标分子浓度相关，因此可根据靶标分子的标准曲线推出待测样品中对应的靶标分子浓度，从而达到快速检测的目的。

除此之外，该微流控芯片在芯片的通道表面和微球表面非检测区域均采用封闭剂进行封闭，阻止样品中的靶标分子发生非特异性吸附，提高微流控芯片检测的特异性，该微流控芯片利用往复电机促进样品和微球充分接触和完全反应，进而提高检测的准确性和灵敏度。

在本发明内，微球与样品、结合抗体的混合方式可以多种，比如，其混合方式包括分开混合方式和同步混合方式；分开混合方式为：含有检测抗体的微球预先与样品充分混合，再进行孵育后清洗，再加入结合抗体，使微球上检测抗体先与样品的靶标分子结合，再孵育后清洗；同步混合方式为：将样品、微球以及结合抗体先进行混合，孵育后清洗。

在分开混合方式内，分为两种情况，其一为：将微球预先灌入微流控芯片内捕获后，在微流控芯片内加入样品，充分混合孵育后清洗，再在微流控芯片内加入结合抗体，孵育后清洗，将微流控芯片进行荧光信号的采集，其二为：将微球与样品在微流控芯片之外充分混合后孵育和清洗，再将混合后的混合物加入微流控芯片内进行微球的捕获，最后向微流控芯片内加入结合抗体进行充分混合、孵育后清洗，将微流控芯片进行荧光信号的采集和分析。

在同步混合方式内，也分为两种情况，其一：将样品、微球以及结合抗体在微流控芯片之外先进行混合，再孵育和清洗，再灌入微流控芯片内进行微球的捕获，将微流控芯片进行荧光信号的采集；其二：将样品、微球以及结合检测抗体一起加入微流控芯片内，进行充分混合，再孵育后清洗，将微流控芯片进行荧光信号的采集。

其具体可以包括以下4种情况：

1)将微球预先灌入微流控芯片内捕获后，在微流控芯片内加入样品，充分混合孵育后清洗，再在微流控芯片内加入结合抗体，孵育后清洗，最后将微流控芯片进行荧光信号的检测。

2)将微球与样品在微流控芯片外充分混合后孵育，清洗，再将上述混合物加入微流控芯片内进行微球的捕获，最后加入结合抗体进行充分混合、孵育后清洗，检测荧光信号。

3)将样品、微球以及结合抗体在微流控芯片外先进行混合，孵育后清洗，再灌入微流控芯片内进行微球的捕获，最后进行荧光信号的检测。

4)将样品、微球以及结合抗体一起加入微流控芯片内，进行充分混合，孵育后清洗，最后进行荧光信号的检测。

比如，将多种尺寸的聚苯乙烯微球混合后从微流控芯片入口灌入，竖立微流控芯片并置于往复电机上进行循环震荡数分钟，由于重力作用和不同微柱屏障的开口对微球尺寸的限制作用，不同半径尺寸的微球根据各个微柱屏障的开口差异区分开来进而排列在相应的屏障区域；携带有靶标分子的待测样品通过微流控芯片的入口5进入后置于上述往复电机上进行充分震荡反应后用缓冲盐溶液清洗芯片3次，再加入结合抗体进行充分接触和反应后同样用缓冲盐溶液清洗芯片3次，最后对微流控芯片进行荧光信号的采集与分析。

在本发明内，微流控芯片包括相连接的上层和下层，下层通过胶水或热压或等离子焊接或超声波焊接与上层进行封接；微流控芯片的上层和下层对应的材质可以为聚甲基丙烯酸甲酯或聚二甲基硅氧烷或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物或环烯烃共聚物，上层与下层之间可以用胶水或双面胶粘合，或者热压、超声波焊接、键合工艺等实现，这种设计增加芯片气密性，防止反应过程发生污染，减少样品损耗，且不影响荧光信号的检测。

在本发明内，微流控芯片的前后两端设置有出口5和入口4。底层芯片1内的各个通道上均涂有封闭剂，出口5和入口4采用螺纹设计，增加芯片气密性，操作简便，能进行快速加样和排出废液；芯片内通道修饰有防止蛋白发生非特异性吸附的封闭剂，避免假阳性信号的产生，增强检测的特异性。

微柱屏障包括2个或2个以上不同开口尺寸的微柱屏障，分别捕获2种或2种以上不同粒径的微球，微球粒径为纳米级、微米级或毫米级；微流控芯片内的微球包括聚苯乙烯微球、聚苯乙烯马来酸酐微球、二氧化硅微球、水凝胶微球、光子晶体、磁性氧化铁微球或贵金属纳米颗粒；微球表面的偶联基团包括氨基、羧基、羟基、甲苯磺酰基、巯基、氯甲基、醛基、巯基、酰肼、环氧基、硅羟基、琥珀酰亚胺酯的至少一种；微球表面偶联的生物活性分子包括有抗体、抗原、核酸、半抗原、激素受体、核酸、寡核苷酸、酶、适配体；微球表面形成的免疫复合物，免疫复合物可以用化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附测定法、酶促免疫分析法、生物素-亲和素系统测定法、放射免疫测定法、免疫荧光分析法进行分析。

微流控芯片内用于封闭通道和微球上非检测区域的封闭剂包括：小牛血清蛋白、酪蛋白、tween20等。

本发明提供三个实施例：

实施例1：

实施例1提供的基于微流控芯片进行多种过敏原抗体检测的流程和检测结果如下：

(一)微流控芯片组装

利用建模软件创建微流控芯片模型，用聚甲基丙烯酸甲酯材料制作出上述微流控芯片，用亚克力胶水封接，微流控芯片内立方柱屏障的开口大小分别为500μm、450μm、400μm、350μm、300μm，对应步骤s1中的不同直径尺寸，取前述五种尺寸的聚苯乙烯微球，分别修饰上花生凝集素、β-乳球蛋白、苹果rmald4、榛仁rcora1和风铃草花粉过敏原，分别用于检测人血清(带有靶标分子的样品)中的相应ige抗体，将微球灌入微流控芯片前，微流控芯片通道预先用0.5％tween-20以及1％的bsa封闭，阻止非特异性吸附的产生，将聚苯乙烯微球灌入微流控芯片中，启动往复电机使微球混合均匀并排列在与其尺寸对应的区域。

(二)样本检测

通过微流控芯片的入口注入样本血清和荧光标记的抗花生凝集素ige抗体、抗β-乳球蛋白ige抗体、抗苹果rmald4ige抗体、抗榛仁rcora1ige抗体和抗风铃草花粉ige抗体，37℃下孵育，再利用缓冲盐溶液清洗20分钟，排出多余的样品和二抗，通过双抗原夹心法检测样品血清中的特异性过敏原ige，反应结束后将微流控芯片置于荧光显微镜上收集荧光信号强度，其荧光信号强度与样品中的靶标分子含量呈正相关，总检测时间为10分钟，每个样本分别用3个上述微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线，样本中ige含量越高，则发光信号越强，依据标准曲线获得样本中花生凝集素ige、β-乳球蛋白ige、苹果rmald4ige、榛仁rcora1ige和风铃草花粉ige的各自浓度分别为：3.2nm、1.7nm、4.1nm、1.5nm、2.6nm，结果表明，相关系数r≥0.99，重复性较好，可为过敏性疾病诊断提供参考。

实施例2：

实施例2提供了基于上述多重检测微流控芯片进行多个肿瘤标志物检测。

(一)微流控芯片组装

利用建模软件创建微流控芯片模型，用聚甲基丙烯酸甲酯材料制作出上述微流控芯片，用亚克力胶水封接，微流控芯片内微柱屏障的开口分别为60、40、20μm，取上述三种尺寸的光子晶体微球分别修饰上甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、糖链抗原199(ca125)抗体，将微球灌入微流控芯片前，微流控芯片的通道预先用封闭剂封闭，阻止非特异性吸附的产生，将微球灌入微流控芯片中，使微球混合均匀并排列在与其尺寸对应的区域。

(二)样本检测

通过芯片入口注入病人样本血清、荧光标记的二抗在37℃下孵育，再利用缓冲盐溶液清洗20分钟，排出多余的样品和抗原二抗，，反应结束后将芯片置于荧光显微镜上收集荧光信号强度，总检测时间为20分钟，每个样本分别用3个上述微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线，依据标准曲线获得样本中afp、cea、ca125的各自浓度分别为：72ng/ml、3.42ng/ml、9.72ng/ml。结果表明，相关系数r≥0.99，重复性较好，可为癌症诊断提供参考。

实施例3：

实施例3提供的基于微流控芯片进行乙型肝炎病毒血清标志物检测

(一)微流控芯片组装

利用su8胶光刻技术创建微流控芯片模型，用聚二甲基硅氧烷材料制作出上述微流控芯片，与有机玻璃用等离子体封接，微流控芯片内微柱屏障的开口分别为4.9,3.0,and1.0μm，取上述三种尺寸且带两种颜色的六种微球分别修饰上乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)、乙型肝炎病毒表面抗体(hbsab)、乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)、乙型肝炎病毒核心抗体(hbcab)、乙型肝炎病毒e抗原(hbeag)、乙型肝炎病毒e抗体(hbeab)。将微球灌入微流控芯片前，微流控芯片通道预先用封闭剂封闭，阻止非特异性吸附的产生，将微球灌入微流控芯片中，使微球混合均匀并排列在与其尺寸对应的区域。

(二)样本检测

通过微流控芯片入口注入病人样本血清、荧光标记的igg和荧光标记的hbsag、hbcag、hbeag，37度下孵育，再利用缓冲盐溶液清洗20分钟，排出多余的样品和抗原抗体，反应结束后将芯片置于荧光显微镜上收集荧光信号强度，总检测时间为20分钟，每个样本分别用3个上述微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线；依据标准曲线获得样本中乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)、乙型肝炎病毒表面抗体(hbsab)、乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)、乙型肝炎病毒核心抗体(hbcab)、乙型肝炎病毒e抗原(hbeag)、乙型肝炎病毒e抗体(hbeab)的各自浓度分别为：457iu/ml、0.15iu/ml、0.06iu/ml、0.01iu/ml、0.02iu/ml、0.01iu/ml，结果表明，相关系数r≥0.99，重复性较好，可为乙型肝炎病毒感染诊断提供参考。

由上述检测试验的结果可得出：

(1)本发明的微流控芯片多重免疫检测方法适用于多种不同靶标的检测。

(2)该检测试验在进行不同种抗原检测时均检测出了所有的待测抗原，且线性相关实验、重复性、最低检测限和准确性都能达到单一检测的检测效果。

(3)本发明的微流控芯片的多重免疫检测方法证明能够快速、简便地进行大规模高通量的检测。

本发明提供的尺寸和颜色双编码微流控芯片是通过微纳技术加工的，高通量的生物芯片，能够进行大规模的基因或蛋白的检测，本发明与现有技术相比具有以下的优势：

1、通过基于尺寸和颜色双重编码的微球，大大提高了检测通量；

2、将微球在芯片按照尺寸差异限制在相应的微柱屏障区域进行连续检测，仅获取荧光信息就能快速分析检测结果；

3、样品中的靶标分子与多种检测抗体充分混合后检测，减少样品消耗，节省试剂成本；

4、将传统固相反应转化为微球悬浮阵列，扩大反应面积，提高反应效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。