CD11b阳性外泌体在肿瘤预后评估中的应用

cd11b阳性外泌体在肿瘤预后评估中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及cd11b阳性外泌体在肿瘤预后评估中的应用。


背景技术：

2.结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，死亡率很高。目前虽然在结直肠癌诊断方面有较多标志物，但却缺少涉及提示术后复发转移方面的检测方法与生物标志物。血清s100a9在结直肠癌的诊断中具有较高的敏感性和特异性，但在判断结直肠癌转移方面，其特异性和敏感性则大幅减低，只有50%左右。
3.外泌体（exosomes）是直径为30
‑
150 nm的膜性囊泡，其包含来源细胞的蛋白质和核酸。exosomes的内容物可以从来源细胞转移到靶细胞，在细胞间信息传递中发挥着重要作用。髓源性抑制细胞（mdsc）来源的exosomes除了包含大量的促炎性s100蛋白、组蛋白等，膜表面还包含多种糖蛋白，利于其与靶组织或细胞相互作用。此外，mdsc表达rage，被配体s100a9蛋白活化后有助于炎症基因和免疫抑制基因的活化。目前尚未发现有关于外泌体中s100a9蛋白与结肠癌复发转移关系的报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，为了弥补现有技术中的一些不足，本发明的目的在于提供一种在结直肠癌复发和预后评估中具有较高的敏感性和特异性的标志物及方法，即cd11b阳性外泌体在肿瘤预后评估中的新应用。发明人经过广泛而深入的研究，首次发现通过检测cd11b阳性外泌体中的s100a9蛋白在肿瘤组织中的表达量可以用于指导结直肠癌症患者的预后判断。
5.为了实现上述目的，本发明提供了cd11b阳性外泌体在肿瘤预后评估中的应用，所述的应用为cd11b阳性外泌体中的s100a9在肿瘤组织中高表达，所述肿瘤患者具有不良预后。
6.进一步地，所述的肿瘤为结直肠癌，所述的应用为通过检测cd11b阳性外泌体中的s100a9的表达水平，根据表达信息帮助结肠癌转移风险预警及预后评估。
7.本发明还提供了一种结直肠癌转移风险预警及预后评估方法，所述的方法为通过对结直肠癌患者血浆cd11b阳性外泌体中的s100a9的表达水平检测进行转移风险预警及预后评估，辅助评估结直肠癌是否复发转移。
8.进一步地，所述的方法为判断血浆cd11b阳性外泌体中的s100a9蛋白在术后结直肠癌患者中高表达或低表达。
9.本发明还提供了一种检测肿瘤标志物的试剂在制备肿瘤预后产品中的用途，所述的标志物是cd11b阳性外泌体，其所包含的s100a9蛋白在肿瘤组织中高表达，所述肿瘤患者具有不良预后。所述的肿瘤为结直肠癌。
10.本发明还提供了一种结直肠癌预后评估试剂盒，所述试剂盒包含了检测生物样品中血浆cd11b阳性外泌体中的s100a9蛋白相对表达量的试剂。
11.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对健康人、结直肠癌患者及其手术前后外周血标本进行收集，采用流式细胞术分选人血浆cd11b
+ exosomes与cd11b
‑
exosomes，利用elisa检测cd11b
+ exosomes中s100a9含量。测定出血浆cd11b
+ exosomes中s100a9蛋白具有显著的高表达量，具备判断结直肠癌复发转移的敏感性和特异性；同时操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点。本发明确认cd11b
+ exosomes中s100a9蛋白的表达水平与手术后结直肠癌患者预后存在相关性，能用于判断结直肠癌患者的预后，对降低结直肠癌死亡率改善预后具有重要的指导意义。
附图说明
12.图1 是结直肠癌患者血浆中cd11b
+ exosomes百分比测定结果图；图中，a是百分比流式点状图；b是cd11b的表达丰度图检测图；图2是结直肠癌患者血浆中cd11b
+ exosomes与cd11b
‑
exosomes中s100a9含量的测定对比图；图3是结直肠癌患者及健康对照血浆中的cd11b
+ exosomal s100a9水平的检测对比图。
具体实施方式
13.下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围；实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，实施例中所使用的试剂盒试剂的量仅是示例性的，本领域技术人员可以根据实际情况作相应调整；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
14.在本发明中所用血液样本为72例结直肠癌患者外周血样本，其中，未手术结直肠癌患者46例，术后无复发结直肠癌患者22例，术后复发结直肠癌患者4例以及40例健康对照外周血样本。所有血液标本均来自镇江市第一人民医院，均为edta
‑
k2抗凝的全血标本。
15.实施例1：结直肠癌患者血浆中cd11b
+
exosomes含量测定(1)血浆exosomes制备：将分别收集到的健康自愿者（40例）和结直肠癌患者（72）外周血样本，室温放置30min后，于4℃，1200g离心10min，分离血浆。血浆于4℃，1800 g离心10 min后用棉花包裹置于
‑
80 ℃保存备用。
16.②
取出保存的血浆样本置于冰上融化，4℃、1500 g离心10 min。收集上清后，4℃，10000 g离心20 min，收集上清。
17.250μl上清中加入2.5μl的凝血酶，室温孵育5 min。4℃、10000 g离心5 min，收集上清；上清中加入sbi exoquick
‑
tctm试剂盒（货号：exoq5a
‑
1）中的exoquick
‑
tctm exosomes试剂（5 : 1），4℃孵育1 h。
18.4℃、1500 g离心30 min，收集上清；4℃、1500 g离心30 min；沉淀溶解在200μl的pbs中，并经过0.22μm滤器过滤。
[0019] 流式细胞术分选血浆中cd11b
+ exosomes：
分别将步骤（1）中制备的健康自愿者血浆exosomes及结直肠癌患者血浆exosomes与货号为a37304 的invitrogen胶体颗粒温孵育1 h，加入5 ml pbs洗涤，4℃、500 g离心10 min，重复1次。
[0020]
将负载exosomes的胶体颗粒重悬于100μl pbs中，加入2μg 抗人cd11b单克隆抗体，加入5 ml pbs洗涤，4℃孵育30 min，4℃、500 g离心10 min，重复1次。
[0021]
流式细胞仪分选负载cd11b
+ exosomes的胶体颗粒，4℃、500 g离心10 min。
[0022]
利用胶体颗粒作为exosomes载体，用pe
‑
cy5.5标记的抗人cd11b抗体染色后通过流式细胞术观察健康自愿者及结直肠癌患者血浆中cd11b
+ exosomes的百分比。图1 是结直肠癌患者血浆中cd11b
+
exosomes百分比测定结果图；图中，a是cd11b
+ exosomes的百分比流式点状图；b是血浆exosomes中cd11b的表达丰度图检测。如图1可见，在结直肠癌患者中约有10%胶体颗粒为cd11b阳性，而在健康自愿者（健康对照）中cd11b
+
的胶体颗粒则含量很少。
[0023]
实施例2：结直肠癌患者血浆中cd11b
+ exosomes与cd11b
‑
exosomes中s100a9含量的测定样品准备：采用与实施例1相同的方法制备cd11b
‑
exosomes负载的胶体颗粒，分别将cd11b
+ exosomes负载的胶体颗粒和cd11b
‑
exosomes负载的胶体颗粒与等体积裂解液（ripa : pmsf = 250:1）混匀后，冰上放置1 h，每10 min震荡1次；4℃、12000 g离心15 min，收集上清。
[0024]
使用bca protein assay kit（目录号：cw0014s）通过bca微量蛋白定量测定exosomes裂解液中的蛋白浓度。
[0025]
从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
[0026]
设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；样本孔加待测样本50μl。
[0027]
样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液 40μl；空白孔不加。
[0028]
除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。
[0029]
弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
[0030]
向每孔中加入bca protein assay kit中的底物 a、b 各50μl，37 ℃避光孵育15 min。
[0031]
每孔加入终止液 50μl，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的od值。
[0032]
根据标准孔制备标准曲线，并求出各样本中的s100a9含量。
[0033]
图2是结直肠癌患者血浆中cd11b
+ exosomes与cd11b
‑
exosomes中s100a9含量的测
定对比图；如图2所示，结直肠癌患者cd11b
+ exosomes中s100a9水平显著高于cd11b
‑
exosomes中的s100a9水平。可见，转移性结直肠癌细胞分泌的cd11b
+ exosomes富含较高含量的s100a9，与检测血浆中cd11b
‑ exosomes或者所有血浆中 s100a9的表达量相比较，通过检测结直肠癌患者血浆cd11b
+ exosomes获得其s100a9的表达量具有更高的敏感性以及指导性意义。
[0034]
实施例3：手术前后结直肠癌患者及健康对照血浆cd11b
+
exosomal s100a9水平的测定在本实施例中分别对收集到的72例结直肠癌患者外周血样本；其中，未手术结直肠癌患者（coca）46例，术后无复发结直肠癌患者（sufr）22例，术后复发结直肠癌患者（sure）4例和40例健康对照（ctrl）的外周血样本进行血浆中cd11b
+ exosomal s100a9含量检测。
[0035]
样品准备：分别裂解结直肠癌患者及健康对照中的cd11b
+
exosomes，使用bca protein assay kit通过bca微量蛋白定量测定蛋白浓度。
[0036] 根据rd catalog s100a9检测试剂盒（目录号：ds8900）说明书，制备标准曲线，并测出各样本中s100a9含量。
[0037]
图3是结直肠癌患者及健康对照血浆中的cd11b
+ exosomal s100a9水平的检测对比图。如图3所示，结直肠癌患者血浆cd11b
+ exosomal s100a9的水平显著高于健康对照组，达到健康对照组的2倍，具有统计学意义（p＜0.001）；手术后无复发患者血浆cd11b
+ exosomal s100a9的水平与健康对照组相比没有统计学差异，显著低于未手术的结直肠癌患者（p＜0.01）；而手术后复发患者血浆cd11b
+ exosomal s100a9的含量与未手术结直肠患者相比没有统计学差异，显著高于术后未复发者，可以达到术后未复发患者的两倍以上（p＜0.01）。
[0038]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。