一种检测脂质加氧氧化产物的方法

1.本发明涉及脂质加氧氧化产物检测领域，更具体地说，涉及一种结合高分辨质谱检测低含量脂质加氧氧化中间产物的方法。


背景技术：

2.现有脂质氧化研究多采用硫氰酸铁法，总羰基化合物测定法，碘量法、硫代巴比妥酸法等方法检测脂质氧化进程，但这些监测方式只能评价脂质氧化总体状况，很难用于更精确的氧化研究，如不同结构、不同类别的脂质氧化机理研究。油脂标准品氧化是近年来常用的脂质氧化机理研究的方式，研究多利用气相色谱质谱联用技术监测脂质氧化下游挥发性产物变化，但对于直接参与脂质氧化链式反应的脂质氧化中间产物的研究较少。
3.由于脂质氧化中间产物种类繁多，普通的靶向监测方式很难全面监测脂质氧化产物，因此对脂质氧化中间产物的研究较少。非靶向检测的数据量庞大，一般q exactive hf
‑
x质谱仪每次检测可以获得5000
‑
6000个有二级质谱图的化合物，解释和鉴别这些化合物，现有方法一般采用谱库匹配，然而脂质加氧氧化产物的谱库现在几乎没有，因此现如今非靶向检测仍然很少运用于脂质加氧氧化产物检测。近年来，高分辨质谱的出现让脂质氧化中间产物的全面检测成为可能。高分辨质谱的非靶向检测可以全面检测脂质氧化产物。然而脂质氧化中间产物含量较低，纯品较少，没有丰富的脂质氧化中间产物谱库，因此，注释脂质氧化的非靶向数据十分困难。所以，为了发挥高分辨质谱非靶向检测的优势，有必要开发一种用于解释质谱数据和鉴别脂质氧化产物的方法。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的监测方式只能评价脂质氧化总体状况，很难用于更精确的例如不同结构、不同类别的脂质氧化机理研究的问题，实现对脂质加氧氧化产物全面的检测。
5.本发明提供了一种检测脂质加氧氧化产物的方法，具体步骤如下：
6.s1、制备内标样品：配制成终浓度为100μg/ml的混合内标工作液；
7.s2、制备脂质氧化样品：取待测的脂质标准品氧化样品，按9:1(v/v)的比例加入甲醇和所述混合内标工作液复溶，配制为0.5mg/ml样品，在4
‑
10℃、转速8000
‑
12000转条件下离心10min后，取上清得到脂质氧化样品；
8.s3、样品测定：将步骤s2制得的所述脂质氧化样品进行高分辨质谱非靶向检测，得到样品中各种化合物的质谱图和色谱图；
9.s4、推测存在的脂质加氧氧化产物，计算相应化合物的相对分子质量、每种脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比和特征碎片离子质荷比；
10.s5、根据计算的脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比，在非靶向检测数据中搜索对应化合物，核对是否含有特征碎片离子的质荷比，以此鉴别脂质加氧氧化产物。
11.其中，步骤s1中所述混合内标工作液的制备方法为：选用三酰甘油(tg；17:0/17:0/17:0)；磷脂酰胆碱(pc；17:0/17:0)；磷脂酰乙醇胺(pe；17:0/17:0)作为内标，分别配制
成终浓度为100μg/ml的混合内标工作液。
12.其中，步骤s3中的所述高分辨质谱非靶向检测方法为：采用acquity uplc beh c8(2.1x100mm 1.7μm)色谱柱,通过超高效液相色谱与混合四极杆
‑
轨道离子阱质谱测定。
13.其中，步骤s3中所述高分辨质谱非靶向检测的条件为：
14.进样量：1μl；采集模式：full ms+prm；
15.流动相：流动相a：乙腈/水(60:40，v/v)0.1％甲酸铵；
16.流动相b：异丙醇/乙腈(90:10，v/v)0.1％甲酸铵；
17.洗脱流速：0.6ml/min；
18.洗脱梯度：0
‑
2min，15
‑
30％b和2
‑
2.5min，30
‑
48％b；2.5
‑
11min，48
‑
82％b；
19.11
‑
11.5min，82
‑
99％b；11.5
‑
12min，99％b；12
‑
12.1min，99
‑
15％b；12.1
‑
15
20.min，15％b；
21.质谱采用电喷雾离子源(esi)；正离子模式和负离子模式进行检测；采集范围：120
‑
1200m/z；在正模式：鞘气流量为60％，辅助气流量为25％，吹扫气流量为2％；
22.喷雾电压为3.6kv，毛细管温度为380℃，辅助气体加热器温度为370℃；负模式与正模式类似，喷雾电压为3.0kv。
23.其中，步骤s5中所述根据特征碎片离子鉴别脂质加氧氧化产物的方式是：在msdial中勾选显示具有二级质谱图的化合物；根据推测的氧化产物准分子离子的质荷比，从这些化合物中找到相应物质，将该物质导出到msfinder中查看质谱图，核对是否存在特征碎片离子，所述存在特征碎片离子的物质被确定为正确的加氧氧化产物。
24.其中，步骤s4中脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比计算公式：
25.m
准分子离子
＝m
氧化产物
+m
加合离子(+h,+na,+nh4,
‑
h,+ci,+hcoo)
。
26.其中，步骤s4中所述特征碎片离子质荷比计算公式：
27.负离子模式m
特征离子
＝m
氧化后脂肪酸链
‑
m
氢原子质量
28.正离子模式m
特征离子
＝m
氧化产物
‑
m
氧化后脂肪酸链
+m
加合离子(+h,+na,+nh4)
。
29.本发明的有益效果在于：
30.1、本发明运用高分辨质谱进行非靶向检测脂质氧化产物，能够更全面地检测脂质氧化产物，使实验得出的氧化机理更准确。在full ms+dd
‑
ms独特的质谱信号采集模式下，四极杆质量过滤器仅将夹杂物列表中的已定义离子传输至中间c阱，为进样到更高效的高能碰撞解离(hcd)做准备，然后在orbitrap分析仪中进行高浓度分析分辨率。q exactive hf
‑
x质谱仪的c阱捕集部分代替了三重四极杆仪器的最终四极杆部分，可完成整个质量范围的离子产物的传输。q exactive hf
‑
x质谱仪可提供精确的质荷比扫描，精确到小数点后五位。高分辨质谱的高精度将大大提高质谱匹配的准确性。
31.2、本发明总结了现有脂质氧化机理和脂质氧化产物在质谱中的碎裂机制，并将其运用于对非靶向数据的解释，使得缺少氧化产物谱库的问题得到一定解决，较好地鉴定了脂质氧化产物，也使得非靶向检测的优势得以发挥。与现有靶向研究相比，非靶向更快捷，一次可以鉴定大量物质获得大量化合物信息，同时非靶向检测检测的氧化产物也更全面，并且非靶向检测要快捷的多，非常适合应用于大量脂质氧化产物的检测，因此本发明可以用于非靶向数据的解释，使得非靶向检测可以应用于脂质氧化领域。
附图说明
32.图1是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)二级质谱图；
33.图2是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(ke)二级质谱图；
34.图3是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(oh or ep)二级质谱图；
35.图4是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(2oh)二级质谱图；
36.图5是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图；
37.图6是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)二级质谱图；
38.图7是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ke)二级质谱图；
39.图8是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(oh or ep)二级质谱图；
40.图9是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(3ke)二级质谱图；
41.图10是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(3ke)二级质谱图；
42.图11是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ke+oh orke+ep)二级质谱图；
43.图12是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图；
44.图13是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(2oh)二级质谱图；
45.图14是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ke+ooh)二级质谱图；
46.图15是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ooh+oh or ooh+ep)二级质谱图；
47.图16是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)二级质谱图；
48.图17是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2ke)二级质谱图；
49.图18是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ke)二级质谱图；
50.图19是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图；
51.图20是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(oh orep)二级质谱图；
52.图21是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(oh orep)二级质谱图；
53.图22是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2h+oh or 2h+ep)二级质谱图；
54.图23是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2h+oh or 2h+ep)二级质谱图；
55.图24是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ke+ooh)二级质谱图；
56.图25是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:0)+(ke+oh orke+ep)二级质谱图；
57.图26是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2oh or 2ep)二级质谱图；
58.图27是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图；
59.图28是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2ke+oh or 2ke+ep)二级质谱图；
60.图29是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(3oh or 3ep)二级质谱图；
61.图30是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ke+ooh+oh or ke+ooh+ep)二级质谱图；
62.图31是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ooh+2oh or ooh+2ep)二级质谱图。
具体实施方式
63.准备待测脂质标准品氧化样品；液相色谱串联高分辨质谱非靶向检测氧化油脂样品，获取样品中化合物信息；依照脂质氧化机理推测可能的加氧氧化产物，根据加氧氧化产
物在质谱中的加合离子和碎裂规律计算其准分子离子和特征碎片离子的质荷比；在非靶向数据中搜索、核对并确定相应物质，从而确定氧化油脂标准品样品中的脂质加氧氧化产物及其含量。
64.具体包括以下步骤：
65.s1、制备内标样品：内标配制成终浓度为100μg/ml的混合内标工作液；
66.s2、制备脂质氧化样品：取待测的脂质标准品氧化样品(氧化方法按具体实验而定)，按9:1(v/v)的比例加入甲醇和混合内标工作液复溶，配制为0.5mg/ml样品；样品在10℃、转速为12000转条件下离心10min后，取上清200μl于液相进样小瓶中，立即放入液质检测装置；
67.s3、样品测定：将步骤s2制得的脂质氧化样品进行高分辨质谱非靶向检测，得到样品中各种化合物的质谱图和色谱图；
68.s4、根据脂质标准品的结构信息、质谱图和色谱图以及脂质氧化机理，推测可能存在的脂质加氧氧化产物，用相应公式计算相应化合物的相对分子质量，并根据脂质加氧氧化产物在质谱中的加合离子形式和碎裂机制，用相应公式计算每种脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比和特征碎片离子质荷比；
69.s5、根据计算的脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比，利用msdial软件在非靶向检测数据中搜索对应化合物，并用msfinder软件中打开该化合物质谱图，核对是否含有特征碎片离子的质荷比，以此鉴别脂质加氧氧化产物。
70.步骤s1中所述混合内标工作液的制备方法为：选用三酰甘油(tg；17:0/17:0/17:0)；磷脂酰胆碱(pc；17:0/17:0)；磷脂酰乙醇胺(pe；17:0/17:0)作为内标，分别配制成终浓度为100μg/ml的混合内标工作液。
71.步骤s3中的测定方法为：采用acquity uplc beh c8(2.1x 100mm 1.7μm)色谱柱,通过超高效液相色谱与混合四极杆
‑
轨道质谱联用仪测定。
72.步骤s3中具体检测条件为：
73.进样量：1μl；采集模式：full ms+prm；
74.流动相：流动相a：乙腈/水(60:40，v/v)0.1％甲酸铵；流动相b：异丙醇/乙腈(90:10，v/v)0.1％甲酸铵；
75.洗脱流速：0.6ml/min；
76.洗脱梯度：0
‑
2min，15
‑
30％b；和2
‑
2.5min，30
‑
48％b；2.5
‑
11min，48
‑
82％b；
77.11
‑
11.5min，82
‑
99％b；11.5
‑
12min，99％b；12
‑
12.1min，99
‑
15％b；12.1
‑
15
78.min，15％b.
79.步骤s4中所述脂质氧化机理为：以烯丙基单元为核心，加氧氧化主要包括加
‑
ooh，
‑
oh，＝o，和双键位置生成环氧化合物四种情况。此外，像这类保留原始链长的脂质氧化产物还有烯丙基单元发生加成反应和不变两种情况。因此，每个烯丙基位可能发生的氧化反应有6种。以下是加氧氧化产物的质量计算公式，照此公式可推测可能出现的氧化产物相对分子质量。氧化产物相对分子质量可用于脂质的准分子离子质荷比和特征碎片离子质荷比计算。
80.可能的加氧氧化产物质量计算公式：
81.m
氧化产物
＝m
原始脂质
+m
氧化加入的基团
‑
m
被取代的基团
82.注：m表示质量。可能的氧化产物中，ooh表示加入氢过氧化物基团，oh表示加入羟基，ke表示加入醛基，ep表示双键位置加入环氧，2h表示双键被氢加成，这些基团质量分别是32.9976，17.0027，15.9949，15.9949，2.0156，被取代的基团分别是h，h，2h，无，无，因此m
被取代的基团
分别是1.0078，1.0078，2.0156，0，0。
83.步骤s4中所述加氧氧化产物在质谱中的碎裂机制为：甘油脂类酯键位置断裂，主体部分断裂后加oh或者失去一个h后形成双键，而断裂的另一半则以脂肪酸链形式脱落。主体部分在正离子模式下会结合h+，na+，nh4+，脂肪酸链部分在负离子模式下主要是以[fa
‑
h]
‑
形式存在。以下公式是根据加氧氧化产物在质谱中加合离子形式和碎裂机制建立的，通过公式可计算每种可能的加氧氧化产物的准分子离子质量和特征碎片离子质量(即准分子离子质荷比和特征碎片离子质荷比，因为加合离子均为单电荷，因此其相对分子质量就是其质荷比)。
[0084]
脂质加氧氧化产物准分子离子质量(即脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比)计算公式：
[0085]
m
准分子离子
＝m
氧化产物
+m
加合离子(+h,+na,+nh4,
‑
h,+ci,+hcoo)
[0086]
注：+h,+na,+nh4,
‑
h,+ci,+hcoo分别对应的m
加合离子
是1.0078，22.9898，18.0344，
‑
1.0078，34.9688，44.9976。
[0087]
脂质加氧氧化产物特征碎片离子质量(即脂质加氧氧化产物的特征碎片离子质荷比)计算公式：
[0088]
负离子模式m
特征离子
＝m
氧化后脂肪酸链
‑
m
氢原子质量
[0089]
正离子模式m
特征离子
＝m
氧化产物
‑
m
氧化后脂肪酸链
+m
加合离子(+h,+na,+nh4)
[0090]
注：m
氢原子质量
是1.0078
[0091]
步骤s5中所述根据特征碎片离子鉴别脂质加氧氧化产物的方法是：在msdial中勾选显示有二级质谱图的物质。根据推测的氧化产物准分子离子的质荷比，从中找到相应物质，将该物质导出到msfinder中查看质谱图，核对是否存在主要的特征碎片离子，存在特征碎片离子的物质被确定为正确的氧化产物。
[0092]
实施例1：检测待测样品的脂质加氧氧化产物
[0093]
脂质氧化样品制备：选择磷脂酰胆碱(pc；18:1/18:1)；磷脂酰乙醇胺(pe；18:1/18:1)，三酰甘油(tg；18:1/18:1/18:1)进行脂质氧化实验。分别取3种脂质标准品(pc(18:1/18:1)；pe(18:1/18:1)；tg(18:1/18:1/18:1))各50mg，溶解于25ml氯仿，配成2mg/ml脂质标准品溶液。分别取100μl的2mg/ml的脂质标准品溶液于20ml棕色样品瓶中，氮吹吹干溶剂后，置于油浴锅加热，140℃氧化40min。氧化完成后，立即置于冰浴5min得到氧化样品。向氧化样品中加入360μl甲醇和40μl混合内标工作液(tg(17:0/17:0/17:0)，pc(17:0/17:0)，pe(17:0/17:0))复溶，震荡1min后，取出360μl于1.5ml离心管中，在10℃、转速12000转条件下离心10min，配平离心后，取上清200μl于液相进样小瓶中。立即放入液质检测。
[0094]
所述混合内标工作液的制备方法为：选用三酰甘油(tg；17:0/17:0/17:0)；磷脂酰胆碱(pc；17:0/17:0)；磷脂酰乙醇胺(pe；17:0/17:0)作为内标，分别配制成终浓度为100μg/ml的混合内标工作液。
[0095]
采用acquityuplc beh c8(2.1x100mm 1.7μm)色谱柱,通过超高效液相串联与混合四极杆
‑
轨道离子阱质谱(uhplc
‑
q
‑
exactive hf
‑
x)对标准品的氧化产物和生物样品的
脂质组成进行分析。(1)流动相a：乙腈/水(60:40，v/v)0.1％甲酸铵，流动相b：异丙醇/乙腈(90:10，v/v)0.1％甲酸铵；柱温：65℃；流速：0.6ml/min；进样量：1μl；洗脱梯度：0
‑
2min，15
‑
30％b；和2
‑
2.5min，30
‑
48％b；2.5
‑
11min，48
‑
82％b；11
‑
11.5min，82
‑
99％b；11.5
‑
12min，99％b；12
‑
12.1min，99
‑
15％b；12.1
‑
15min，15％b；(2)质谱采用电喷雾离子源(esi)；正离子模式和负离子模式进行检测；采集范围：120
‑
1200m/z；在正模式：鞘气流量为60％，辅助气流量为25％，吹扫气流量为2％。喷雾电压为3.6kv，毛细管温度为380℃，辅助气体加热器温度为370℃；负模式与正模式类似，喷雾电压为3.0kv。
[0096]
根据脂质氧化机理，推测了磷脂酰胆碱(pc；18:1/18:1)；磷脂酰乙醇胺(pe；18:1/18:1)，三酰甘油(tg；18:1/18:1/18:1)的加氧氧化产物，每个烯丙基单元都可能加ooh，oh，ke，ep，2h或不变，以(pc；18:1/18:1)为例，两条链各有1个烯丙基单元，每条链都有以上6种氧化情况，因此有36种可能存在的氧化产物。
[0097]
pc(18:1/18:1)+(ooh)表示(pc；18:1/18:1)一条链加入ooh。以氧化产物pc(18:1/18:1)+(ooh)为例，其准分子离子质荷比和特征碎片离子质荷比的计算如下：
[0098]
pc(18:1/18:1)加ooh基团后生成pc(18:1/18:1)+(ooh)，pc(18:1/18:1)+(ooh)是根据氧化机理推测的氧化产物之一，以下是鉴别这一物质的过程：
[0099]
加氧氧化产物质量计算：
[0100]
pc(18:1/18:1)+(ooh)的原始脂质是pc(18:1/18:1)，因此m
原始脂质
的质量是785.5935，m
氧化加入的基团
是ooh，质量为32.9976，m
被取代的基团
是h，质量为1.0078。
[0101]
根据m
氧化产物
＝m
原始脂质
+m
氧化加入的基团
‑
m
被取代的基团
，可以得出m
氧化产物
为817.5833。
[0102]
加氧氧化产物准分子离子质量(即脂质加氧氧化产物的准分子离子质荷比)计算：
[0103]
pc(18:1/18:1)+(ooh)的加合离子是+h,+na,+nh4，
‑
h,+ci,+hcoo，m
加合离子
分别是1.0078，22.9898，18.0344，
‑
1.0078，34.9688，44.9976，m
氧化产物
由前面公式计算可知，是817.5833。其中+h,+na,+nh4是正离子模式下的加合离子，
‑
h,+ci,+hcoo是负离子模式下的加合离子。
[0104]
根据m
准分子离子
＝m
氧化产物
+m
加合离子(+h,+na,+nh4,
‑
h,+ci,+hcoo)
，可知分别加入6种加合离子的pc(18:1/18:1)+(ooh)，其准分子离子质荷比分别为818.5911，840.5731，835.6177，816.5755，852.5521，862.5809。
[0105]
加氧氧化产物特征离子质量(即脂质加氧氧化产物的特征碎片离子质荷比)计算：
[0106]
pc(18:1/18:1)+(ooh)有两条脂肪酸链，加入的基团ooh在某一条链上，因此pc(18:1/18:1)+(ooh)含有的两条脂肪酸链分别是fa 18:1和fa 18:1+ooh，因此m
氧化后脂肪酸链
分别是282.2589，314.2487。m
氢原子质量
是1.0078。
[0107]
根据负离子模式m
特征离子
＝m
氧化后脂肪酸链
‑
m
氢原子质量
，可得出两个特征碎片离子，质荷比分别是281.2511，313.2409。
[0108]
正离子模式下，+h的情况较多。m
加合离子(+h)
是1.0078。
[0109]
根据正离子模式m
特征离子
＝m
氧化产物
‑
m
氧化后脂肪酸链
+m
加合离子(+h)
可得到2种特征碎片离子，质荷比分别是536.3322，504.3424。
[0110]
由此可以得出pc(18:1/18:1)的氧化产物pc(18:1/18:1)+(ooh)的正离子模式下准分子离子质荷比为818.5911，840.5731，835.6177，特征离子在536.3322，504.3424。负离子模式下准分子离子质荷比是816.5755，852.5521，862.5809，特征离子的281.2511，
313.2409。
[0111]
超高效液相串联混合四极杆
‑
轨道离子阱质谱检测得到样品中内标、脂质、脂质氧化产物的质谱图和色谱图峰面积后，利用ms
‑
dial打开数据，根据预测的氧化产物准分子离子质荷比，在ms
‑
dial中搜索相应物质，然后将该物质质谱图转入msfinder软件，核对该物质质谱图，对于能够找到特征碎片离子的物质，则被确定为正确的脂质氧化产物。进而为了了解该物质在不同样品中的含量，通过ms
‑
dial软件导出该物质在不同样品中的积分峰面积。分别搜索并鉴别了脂质氧化产物，三种脂质分别匹配到4个，9个，15个加氧氧化产物。
[0112][0113][0114]
注：ooh表示氢过氧化物基团，oh表示羟基，ke表示羰基，ep表示环氧，2h一般指双键加成。脂质氧化产物名称写法：“未氧化前脂质名称+氧化加入的基团”。
[0115]
表1脂质加氧氧化产物鉴定结果
[0116]
如表1所示，三种标准品共鉴别28种脂质加氧氧化产物，与靶向研究相比，鉴定的脂质氧化产物更加全面。
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图1是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是
281.2480，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图2是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(ke)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，295.2273，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图3是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(oh or ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，297.2429，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图4是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(2oh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是297.2429，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图5是实施例1中鉴定到的pe(18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，313.2379，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图6是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图7是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ke)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，295.2273，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图8是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(oh or ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，297.2429，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图9是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(3ke)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是295.2273，309.2066，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图10是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(3ke)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是295.2273，309.2066，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图11是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ke+oh or ke+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是295.2273，297.2429，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图12是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是281.2480，313.2379，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图13是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(2oh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是297.2429，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图14是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ke+ooh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是295.2273，313.2379，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图15是实施例1中鉴定到的pc(18:1/18:1)+(ooh+oh or ooh+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是297.2429，313.2379，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图16是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是603.5354，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图17是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2ke)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是617.5146，631.4939，617.5146，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图18是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ke)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是603.5354，617.5147，617.5147，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图19是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是603.5354，635.5252，635.5252，质谱图中可以找到相应
的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图20是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(oh or ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是603.5354，619.5303，619.5303，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图21是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(oh or ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是603.5354，619.5303，619.5303，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图22是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2h+oh or 2h+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是605.551，621.546，619.5303，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图23是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2h+oh or 2h+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是605.551，621.546，619.5303，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图24是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ke+ooh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是635.5252，617.5146，649.5045，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图25是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:0)+(ke+oh or ke+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是617.5147，633.5096，619.5303，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图26是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2oh or 2ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是619.5303，635.5252，619.5303，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图27是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ooh)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是603.5354，635.5252，635.5252，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图28是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(2ke+oh or 2ke+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是633.5096，631.4939，633.5096，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图29是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(3oh or 3ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是635.5252，635.5252，635.5252，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图30是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ke+ooh+oh orke+ooh+ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是673.5021，655.4915，671.4864，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物；图31是实施例1中鉴定到的tg(18:1/18:1/18:1)+(ooh+2oh or ooh+2ep)二级质谱图，该物质的特征碎片离子是657.5072，673.5021，673.5021，质谱图中可以找到相应的碎片离子峰(质量偏差<0.005)，借此可鉴别该化合物。
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以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。