一种针对异体CART细胞特异性抗体的检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种针对异体cart细胞特异性抗体的检测方法。

背景技术：

cart细胞，即嵌合抗原受体t细胞(cart，chimericantigenreceptortcell)，是把能识别肿瘤细胞特异靶点的受体(car，chimericantigenreceptor)，通过基因工程方法，嵌合表达到t细胞表面，使得经car改造后的t细胞能够识别并杀伤患者体内的肿瘤细胞，用于肿瘤的治疗。由于cd19特异性的自体cart细胞在治疗b细胞类型的恶性肿瘤取得了非常显著的疗效。该类治疗方法已经获得美国fda的批准，并已商品化。

根据制备cart细胞时所采用的t细胞来源的不同，cart细胞可分为自体和异体cart细胞。自体cart细胞是采用患者自身的t细胞，而异体cart细胞采用健康供者的t细胞。由于患者通常不会产生针对自体t细胞的免疫反应，因此患者自身的t细胞被认为是制备cart细胞的最佳载体细胞。但是，由于自体cart细胞存在诸多缺陷，比如个体化制备cart细胞价格昂贵、制备周期长、成功率低、容易被患者自身携带的肿瘤细胞污染等，因此，异体cart细胞在近年来得到了广泛的重视和研究，异体cart细胞治疗成功的案例也有不少报道。

异体cart细胞也被称为通用型cart细胞。由于用作car的载体t细胞来源于健康志愿者，异体t细胞表面可能存在接受cart治疗患者自身没有的异体抗原，如不同类型的人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)；另外，对异体t细胞进行的car改造本身也可能引入新的异体或异种抗原。这两类非自体来源的抗原可能成为致敏原，引起患者产生排斥cart细胞的免疫反应，最终导致治疗失败(cells2018，7，155；natrevclinoncol.2021feb25)。

研究发现，有些患者在接受异体cart细胞治疗前，体内就有预存的、针对异体t细胞表面抗原或针对嵌合抗原受体car的抗体；而另外一些患者在接受异体cart治疗后，会因为异体cart细胞所携带的异体抗原和car进入患者体内后，激发患者产生针对异体cart细胞的免疫反应。不管是预存的、还是因治疗而诱发的，针对异体cart细胞的免疫反应是导致异体cart细胞治疗失败、或无法再次进行重复治疗的主要原因。

基于以上原因，我们亟需建立一套完善的检测方法，来较为全面地分析和评估待测样本中是否存在针对异体cart细胞特异性抗体。

技术实现要素：

本发明提供了一种针对异体cart细胞特异性抗体的检测方法，可用于检测待测样本中针对异体t细胞表面抗原的特异性抗体，以及针对嵌合抗原受体car的特异性抗体，也可用于不加区分地同时检测上述针对异体cart细胞的两类抗体。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种针对异体cart细胞特异性抗体的检测方法，包括：

1)将靶细胞加入待测样本进行孵育，所述靶细胞包括异体t细胞，异体cart细胞；

2)通过补体依赖性细胞毒实验或流式细胞术进行检测，判定待测样本中是否有抗car和/或抗异体t细胞表面特异性抗原的抗体。

优选地，针对异体cart细胞的特异性抗体包括针对异体t细胞抗原特异性的抗体和针对car的特异性的抗体。

靶细胞之一可以是来源于健康供者的、用于制备异体cart细胞的异体t细胞。纯化的异体t细胞和待测样本发生孵育反应的目的是用于检测待测样本中是否有针对异体t细胞表面特异性抗原的抗体(如hla)。

靶细胞之二可以是经car改造后的异体t细胞，即异体cart细胞。异体cart细胞和待测样本发生孵育反应的目的是用于检测待测样本中是否有针对car、或者针对异体t细胞表面特异性抗原(如hla)抗体，或者两者兼有。

优选地，所述待测样本来自于待测者的血清样本或组织洗脱液样本。

优选地，步骤1)中，如果需要确认抗体类型或者亚型，则需要预先对待测样本中抗体作分类纯化分离，分别纯化出igm，igg，ige，iga，或其亚型。检测前对样本中抗体进行分类纯化分离的目的，是避免有些类型的抗体由于其在抗体总量中的占比较低，用未分离纯化的血清检测时，容易被其他含量较高的抗体类型抢占有限的抗原结合位点而被漏检。

优选地，还包括采用待测者自体t细胞作为阴性对照细胞。

在正常情况下，待测者通常不会产生针对自体t细胞的抗体。因此，纯化的自体t细胞和待测者的血清发生孵育反应后，不会有任何针对自体t细胞的抗体结合到细胞表面。这个检测在本系列实验中被当作阴性对照，用于设定阴性参考值。

优选地，步骤2)中，以待测样本和待测者自体t细胞的反应值为参考值，设定阴性对照的反应参考值。

优选地，步骤2)中，通过对比待测样本和异体t细胞的反应值以及待测样本和阴性对照的反应参考值，根据两者之间反应值的差异水平，确定待测样本中是否存在针对异体t细胞表面抗原的抗体。

优选地，步骤2)中，通过对比待测样本和异体cart细胞的反应值以及待测样本和异体t细胞的反应值，根据两者之间反应值的差异水平，确定待测样本中是否存在针对car的抗体。

优选地，步骤2)中，通过对比待测样本和异体cart细胞的反应值以及待测样本和阴性对照的反应参考值，根据两者之间反应值的差异水平，确定待测样本中是否存在针对异体cart细胞的抗体。

本发明的有益效果如下：

本发明通过比对待测样本和自体t细胞、异体t细胞、异体cart细胞的不同反应性，来判定待测样本中是否有抗car和抗异体t细胞表面特异性抗原的抗体。该检测方法不仅可以在确定最佳的异体细胞作为car的载体细胞时，筛选出最不容易引起患者产生针对异体t细胞特异性抗体的健康供者；又可用作对异体t细胞进行改造时，筛选免疫原性较低的car改造方案；还可以作为在异体cart细胞治疗过程中监测患者产生针对异体cart细胞的抗体介导排斥反应的手段，协助临床采取必要的抗排异治疗措施，使异体cart细胞发挥其最大的治疗效果。

附图说明

图1为本发明一种针对异体cart细胞特异性抗体的检测方法的整体流程图。

图2为本发明实施例流式细胞仪检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，本发明通过参考以下实施例对发明内容作进一步详细的描述。实施例仅用作举例说明性的目的，不应被解释为限于此实施例所描述的方法，而是应被解释为包括本文提供的实施方法、及由此而变得显而易见的任何和全部的变化。

针对异体cart细胞的抗体包括针对异体t细胞抗原特异性的抗体和针对car的特异性的抗体两种。这两种异体cart细胞特异性抗体的抗体类型可以包括igm、igg、ige、iga抗体或其亚型、或两种或以上抗体或其亚型的混合物。

1、检测样本：

患者接受异体cart治疗前、或治疗后的血液样本或组织洗脱液样本。

根据对检测的目标抗体类型的不同要求，检测样本即患者血清的不同处理方法：

1)如果只需检测患者是否产生抗car、抗异体t细胞表面抗原的抗体，不必区分抗体的类型时，样本可以不作处理。

2)如果需要确认抗体类型或者亚型，血清需要预先作抗体的分类纯化分离，分别纯化出igm、igg、ige、iga、甚至其亚型。检测前对样本中抗体进行分类纯化分离的目的，是避免有些类型的抗体由于其在抗体总量中的占比较低，用未分离纯化的血清检测时，容易被其他含量较高的抗体类型抢占有限的抗原结合位点而被漏检。

2、检测方法：

可以是观察靶细胞被抗体杀伤的补体依赖性细胞毒实验，也可以是观察抗体与靶细胞结合反应的流式细胞检测术。本图例中以流式细胞术为例，解释实验设计原理。具体检测方法如下(见图1)：

阴性对照细胞-患者自体t细胞(图1a)：在正常情况下，患者通常不会产生针对自体t细胞的抗体。因此，纯化的自体t细胞和患者的血清发生孵育反应后，不会有任何针对自体t细胞的抗体结合到细胞表面。这个检测在本系列实验中被当作阴性对照，用于设定阴性参考值。

靶细胞之一：来源于健康供者的、用于制备异体cart细胞的异体t细胞(图1b)：纯化的异体t细胞和患者的血清发生孵育反应的目的是用于检测患者血清样本中是否有针对异体t细胞表面特异性抗原的抗体(如hla)。

靶细胞之二：经car改造后的异体t细胞，即异体cart细胞(图1c)：异体cart细胞和患者的血清发生孵育反应的目的是用于检测患者血清样本中是否有针对car、或者针对异体t细胞表面特异性抗原(如hla)抗体，或者两者兼有。

3、结果分析方法：

1)阴性参考值：以图1a中异体cart细胞治疗患者的被检样本和患者自体t细胞的反应值为参考值，设定本系列后续实验的阴性反应参考值。

2)检测针对异体t细胞表面抗原的抗体：通过对比图1b中被检样本和异体t细胞的反应值以及图1a的中被检样本和阴性对照的阴性反应参考值，根据两者之间反应值的差异水平，确定被检样本中是否存在针对异体t细胞表面抗原的抗体。

3)检测针对car的抗体：通过对比图1c中被检样本和异体cart细胞的反应值，和图1b中被检样本和异体t细胞的反应值，根据两者之间反应值的差异水平，确定被检样本中是否存在针对car的抗体。

4)检测针对car、或针对异体t细胞表面特异性抗原的抗体：在采用商品化的通用型异体cart细胞治疗时，被用作制备异体cart细胞的健康供者的t细胞通常无法获得，在这种情况下，可以通过对比图1c中被检样本和异体cart细胞的反应值，和图1a中被检样本和阴性对照细胞的阴性反应参考值，根据两者之间反应值的差异水平，确定被检样本中是否存在针对异体cart细胞的抗体。在实验条件受限制的情况下，本检测技术可以确定被检样本中是否有抗异体cart细胞的抗体，但无法确认被检出的抗异体cart

细胞的抗体是针对car的、或者是针对异体t细胞表面异体抗原的。实施例异体cart细胞特异性抗体的流式细胞检测法

1.实验用细胞的准备：

a.取患者自身抗凝外周血3-5毫升，用磁珠分选法分离纯化不少于1万个

t细胞作为阴性对照。

b.取健康供者抗凝外周血3-5毫升，用磁珠分选法分离纯化不少于1万个

t细胞作为检测用靶细胞之一。

c.计数不少于1万个异体cart细胞，作为检测用靶细胞之二。

以上实验用细胞均已由患者及供者签署知情同意书，符合使用标准。

2.将以上三种实验用细胞分别用rpmi培养液清洗3遍，最后一遍清洗好的细胞悬浮于50微升rpmi细胞培养液中，将离心管置于冰上。

3.在上述三种细胞中分别加入等量的、不少于10微升的患者血清。

4.将血清和管中细胞充分混匀，将离心管置于冰上，孵育30分钟。

5.在离心管中加入不少于1毫升的rpmi培养液清洗细胞，离心后去上清。

6.重复清洗三遍，最后一遍清洗好的细胞悬浮于50微升rpmi细胞培养液中，将离心管置于冰上。

7.在各管细胞中分别加入10微升pe标记的鼠抗人免疫球球蛋白的抗体(浓度为100微克/毫升)，将抗体和管中细胞充分混匀，将离心管置于冰上，孵育30分钟。

8.在各离心管中分别加入不少于1毫升的rpmi培养液清洗细胞，离心后去上清。

9.重复清洗三遍，最后一遍清洗好的细胞分别悬浮于200微升的rpmi培养液中。

10.流式细胞术检测。

11.流式细胞仪检测结果(图2)：

a.患者血清和自体t细胞的反应结果见图2a，并以此设定为本次检测反应的阴性参考值。

b.患者血清和健康供者的异体t细胞的反应结果见图2b，通过和图2a设定的阴性参考值对比，本次检测中患者血清和异体t细胞结合反应后的荧光强度明显高于患者血清和阴性对照细胞的荧光强度，由此可判定患者血清中有针对异体t细胞的特异性抗体。

c.患者血清和异体cart细胞的反应结果见图2c，通过和图2b结果的比对，本次检测中患者血清和异体cart细胞结合反应后的荧光强度，和患者血清与未加载car的异体t细胞结合反应后的荧光强度没有明显增强。

d.患者样本分别和异体t细胞(图2b)、异体cart细胞(图2c)结合反应后的荧光强度对比结果，见图2d。异体t细胞在经过car改造前后，和患者样本发生结合反应的荧光强度分布情况基本重叠，没有明显变化，由此可判定对异体t细胞进行的car改造，并没有在原有基础上增加额外的抗体反应，因此患者被检样本中抗car的抗体为阴性。

本发明的方法可用于检测待测样本中针对异体t细胞表面抗原的特异性抗体，以及针对嵌合抗原受体car(chimericantigenreceptor)的特异性抗体，也可用于不加区分地同时检测上述针对异体cart细胞的两类抗体。

在用作制备异体cart细胞的健康供者t细胞可获取的条件下，采用患者自体t细胞作为阴性对照靶细胞、未经car改造的异体t细胞作为异体抗原靶细胞、和经car改造后的异体cart细胞作为异体抗原和car的靶细胞，通过检测和比较患者血清样本与三种不同靶细胞的反应结果，判定被检样本中针对异体t细胞特异性抗原、和针对car的抗体。

在用作制备异体cart细胞的健康供者t细胞不可获取的条件下，采用患者自体t细胞作为阴性对照靶细胞、经car改造后的异体cart细胞作为异体抗原和car的靶细胞，通过检测和比较患者血清样本与自体t细胞以及异体cart细胞的反应结果，判定被检样本中针对异体cart细胞的特异性抗体，该实验条件下检出的抗体可以是针对异体t细胞抗原的，也可以是针对car的抗体，或是两种抗体的混合。

在不需要确定检出的抗体是igg，igm，ige，iga或它们的亚型的情况下，可以采用荧光素标记的对上述不同抗体类型具有普遍反应性的抗人免疫球蛋白二抗；在需要确定被检出抗体的类型或其亚型时，被检血清样本需要先做各抗体类型或其亚型的分离纯化处理，再对分离纯化的抗体组分分别进行检测，以避免样本中含量较低的抗体类型或亚型被含量较高的抗体类型或亚型竞争性抑制结合靶抗原的能力而被漏检。

本发明不仅可以在有多种异体cart细胞可供选择的情况下，在确定最佳的异体细胞作为car的载体细胞时，有利于筛选出对于将要接受异体cart细胞治疗的患者具有相对较低致敏性的最佳异体t细胞和最佳的car的改造方法，使患者在接受治疗后不易发生由抗异体cart细胞的抗体而引发的排斥反应；本发明也可以作为异体cart细胞治疗失败的病因学验证检测手段之一。在患者体内有预存的、或因治疗而诱发的抗异体cart细胞抗体的情况下，本发明技术可以作为判断治疗或预防异体cart细胞排斥反应的疗效监测手段，来判断临床上采取的控制或清除抗异体cart细胞抗体治疗的有效性，在没有多种异体cart细胞可供选择的情况下，当检查结果发现患者对异体cart细胞有潜在排斥风险时，临床上可以在cart治疗前，先采取免疫抑制剂治疗的方法，最大程度的降低排斥反应发生的可能性，使异体cart细胞发挥其最大的治疗效果。