一种基于石墨炔量子点荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法

本发明属于生物荧光检测技术领域，具体涉及一种基于石墨炔量子点(gdqds)荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法。

背景技术：

阿莫西林是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强，是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一。阿莫西林对肺炎链球菌、溶血性链球菌等链球菌属、不产青霉素酶葡萄球菌、大肠埃希菌、奇异变形菌、沙门菌属、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌等具有良好的抗菌活性。

阿莫西林是一种有效的广谱抗菌药物，但是过度使用会导致耐药菌的传播，同时会对人类健康和生态系统产生不利影响。目前存在一些检测阿莫西林的技术，例如高效液相色谱法，原子吸收法，质谱法，毛细管电泳法、微生物法等，这些方法存在一些不足的地方，例如检测仪器价格昂贵，耗时长，操作复杂、误差较大等缺点。已有文献“氮掺杂碳点的制备及其对阿莫西林高灵敏度检测”，文献中其检测的线性范围为2.6～30μmol/l；检测限为0.15μmol/l，其检测范围小，灵敏度低。因此，非常有必要开发一种操作简便，检测成本低和灵敏度高的检测方法。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于石墨炔量子点(gdqds)荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法，本方法将gdqds应用于阿莫西林的检测，建立一种基于量子点荧光淬灭作用的阿莫西林检测的新方法，所述方法能够快速、高效的检测阿莫西林，而且灵敏度高、操作简单、成本低廉。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种基于石墨炔量子点(gdqds)荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制量子点溶液：将石墨炔量子点gdqds分散在缓冲液中得到量子点溶液；

(2)配制阿莫西林溶液：将阿莫西林溶解在缓冲液中得到阿莫西林溶液；

(3)配制标准溶液：取一定量的步骤(1)和步骤(2)所配制的溶液，混合后加入缓冲液稀释，配制一组包括空白标样在内的不同已知阿莫西林浓度的标准溶液；

(4)建立gdqds检测阿莫西林浓度的工作曲线：通过荧光光谱仪检测步骤(3)所配制的标准溶液的荧光光谱，记录荧光响应信号；空白标样的响应信号为f0，含有阿莫西林的标样的响应信号为fi，响应信号的差值δf定义为空白标样的响应信号f0减去含有阿莫西林的标样的响应信号fi；将所述的δf与阿莫西林的浓度c绘制成δf-c工作曲线，或采用线性回归法得到δf-c线性回归方程，建立基于阿莫西林对gdqds的荧光淬灭作用的阿莫西林检测工作曲线；

(5)检测待测样品中阿莫西林的浓度：将适量的待测样品与步骤(1)中配制的量子点溶液混合，加入缓冲液稀释，稀释后混合液中gdqds浓度与步骤(3)中相同，按照与步骤(4)相同的方法检测其荧光光谱，根据荧光淬灭程度δf(即响应信号的差值δf)，由步骤(4)中得到的标准曲线，计算出待测样品中阿莫西林的含量。

其中，步骤(1)所述gdqds其粒径大小为2～5nm，粒径比较小，比较均一。

其中，步骤(1)所述量子点溶液中gdqds的浓度为2～4mg/ml。

其中，步骤(2)所述配制的阿莫西林溶液中，阿莫西林的摩尔浓度为10-15mmol/l。

其中，所述检测方法中所述缓冲液均为磷酸盐缓冲液，其ph值为5-6。

其中，步骤(3)所述标准溶液中gdqds浓度为20-25μg/ml，阿莫西林浓度为0.1～1500μmol/l。本发明中当gdqds浓度为20-25μg/ml时，gdqds的荧光强度较好。

其中，步骤(4)中荧光光谱仪的激发波长为347nm，发射波长为430nm。

本发明阿莫西林的检测方法中，其线性范围为0.1～1500μmol/l；检测限为0.021μmol/l。

本发明所述石墨炔量子点在制备阿莫西林检测传感器中的应用。

本发明首先通过水热的方法合成gdqds；通过评价所制备的gdqds的荧光性能，并将其与阿莫西林作用，发现阿莫西林对gdqds的荧光淬灭作用，进而提出一种采用荧光光谱法进行阿莫西林的定量检测的方法，通过gdqds的荧光信号强度的变化，进而计算得到检测样品阿莫西林的浓度，既可以实现阿莫西林快速、灵敏的定性检测，也能够进行定量测定。

本发明中使用的gdqds是准零维的纳米材料，是一种新发现的荧光纳米材料，具有独特的光学性质，良好的生物相容性，较低的毒性，极高的水稳定性等优点。目前应用于很多领域，包括催化，生物成像和载送药物等。gdqds组成主要为c,h,o三种元素，对生物体毒性极低。同时表面含有丰富的-oh、-cooh、-coo等含氧官能团，使得gdqds具有良好的水溶性。本发明方法采用gdqds为荧光探针，发现当加入阿莫西林后，会对量子点的荧光信号产生淬灭，而这种淬灭程度与加入阿莫西林的含量有关，从而以所述的gdqds为荧光探针，可以采用荧光光谱法实现高灵敏的阿莫西林定量检测。

已有文献“氮掺杂碳点的制备及其对阿莫西林高灵敏度检测”，文献中其线性范围为2.6～30μmol/l；检测限为0.15μmol/l，这可能是因为碳点的晶格结构不是很规整，荧光量子产率不高。本发明其线性范围为0.1～1500μmol/l；检测限为0.021μmol/l，与这篇文献相比，本发明的检测限明显较低，同时检测范围也提高了一个多数量级。另一方面本发明可以标准曲线检测牛肉馅中阿莫西林的含量是否符合标准，这篇文献的检测限不满足，不能进行相关检测，不如本发明光学抗干扰能力强。

本发明中由于gdqds表面含有大量的oh基团，而阿莫西林结构中也存在oh、cooh和nh2，当两者混合后可能通过氢键结合，当阿莫西林靠近gdqds表面时会影响其表面电子的重新排列，从而猝灭了gdqds的荧光。基于阿莫西林对gdqds荧光进行了明显的淬灭，gdqds可以高灵敏度的检测阿莫西林的浓度，因此，可以通过gdqds的荧光强度变化构建一种高灵敏度检测阿莫西林的传感器。本发明的检测限低，检测范围广，可以检测实际样品中的阿莫西林浓度，同时具有操作简便，检测成本低和灵敏度高的特点。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明方法所采用的gdqds与有机相量子点相比，这种量子点是水溶性的，且与阿莫西林具有更好的生物相容性和亲和性，更适用于生化检测。

2、本发明的检测方法中，采用的gdqds无需进行额外修饰，不需要使用价格比较昂贵、连接步骤繁琐的有机或生化材料进行前处理，因此操作简单。

3、gdqds由苯环和碳-碳三键组成，与sp和sp2形成较大的π共轭结构的杂化碳原子，片层状结构的gdqds与球形的碳点相比厚度更薄，具有更加规整的晶状结构，因而会有更高的荧光量子产率。此外，gdqds由于其活性乙酰基单元和更多的表面缺陷，表现出更高的生物活性，表面丰富的cooh，oh等水溶性基团，使得gdqds具有稳定光致发光的性质。

4、本发明基于阿莫西林对gdqds的荧光淬灭作用，将该量子点首次应用于阿莫西林测定中，通过荧光分析方法实现了阿莫西林快速、高效的检测，并具具有响应速度快、灵敏度高、操作简单、成本低廉、光稳定性好。

附图说明

图1是本发明制备的gdqds的透射电镜图。

图2是本发明制备的gdqds的荧光光谱图。

图3是本发明制备的gdqds的荧光强度随阿莫西林浓度变化的荧光光谱图。

图4是本发明中阿莫西林浓度检测的工作曲线。

图5是ph对gdqds的荧光强度的影响。

图6是gdqds在不同激发波长下的荧光性能图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中gdy按文献(architectureofgraphdiynenanoscalefilms.guoxingli,yuliangli,huibiaoliu,yanbingguo,yongjunli,daobenzhu.chem.commun.,2010,46,3256-3258)合成，所合成的石墨炔为石墨二炔。

实施例1

gdqds制备和溶液配制

1、gdqds的制备

将20ml的1mg/ml的石墨炔水溶液(gdy)400w超声处理2h，得到小尺寸的gdy。取上述所得gdy溶液5ml移至反应釜中160℃，水热5h，冷却至室温后将所得溶液于500da截留分子量透析袋中透析1天，每隔8h换一次水，取透析液冷冻干燥处理，即可得到蓝色荧光gdqds。

2、配制gdqds溶液：将上述合成gdqds分散在磷酸盐缓冲液中(浓度为0.1mol/l，ph值为5)，得到量子点溶液，其中gdqds浓度为3mg/ml。如图1所示，是gdqds的透射电镜图，其粒径大小为2～5nm。

3、配制阿莫西林溶液：将阿莫西林溶解在磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/l，ph值为5)中得到阿莫西林溶液，浓度为10mmol/l。

实施例2

gdqds荧光性能评价

通过荧光光谱仪检测gdqds溶液研究其荧光性能；其中激发波长为347nm，发射波长为430nm。

将实施例1配制的量子点溶液以磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/l，ph值为5)稀释至其中gdqds浓度为20μg/ml，检测该溶液的荧光光谱；

取一定量的实施例1配制的量子点溶液和阿莫西林溶液混合，加入磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/l，ph值为5)稀释得到混合溶液；其中gdqds浓度为20μg/ml，阿莫西林浓度为500μmol/l。通过荧光光谱仪检测该混合溶液的荧光光谱。

如图2所示，图中曲线a是不含有阿莫西林的gdqds空白样的荧光信号，b是加入500μmol/l阿莫西林后检测到的gdqds荧光信号。可以发现，在加入500μmol/l的阿莫西林后，gdqds的荧光信号明显减弱，说明阿莫西林对gdqds具有良好的荧光淬灭作用。

实施例3

建立gdqds检测阿莫西林浓度的工作曲线

取一定量的实施例1所配制的量子点溶液和阿莫西林溶液，混合后加入磷酸盐缓冲液(浓度为0.1mol/l，ph值为5)稀释，配制一组包括空白标样在内的不同阿莫西林浓度的标准溶液；其中gdqds浓度为20μg/ml，空白标样阿莫西林浓度为0μmol/l，其它标准溶液阿莫西林浓度为0.1～1500μmol/l；通过实施例2的荧光光谱仪检测一系列不同浓度的阿莫西林和gdqds(20μg/ml)标准溶液的荧光信号，如图3所示，其中a-o阿莫西林浓度依次为0μmol/l、0.1μmol/l、1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、200μmol/l、300μmol/l、400μmol/l、600μmol/l、800μmol/l、1000μmol/l、1200μmol/l、1400μmol/l、1500μmol/l。

将空白标样的响应信号f0与含有阿莫西林的标样的响应信号fi的差值δf与标准溶液中阿莫西林的浓度c绘制成δf-c工作曲线(如图4所示)，并进行线性拟合，得到其线性方程为δf＝35.14c+235.72。据此建立荧光淬灭强度与阿莫西林浓度的工作曲线，其线性范围为0.1～1500μmol/l，检测限为0.021μmol/l。

实施例4

按照实施例2的方法评价gdqds荧光性能，将磷酸盐缓冲液的ph分别改为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他操作均与实施例2相同。如图5所示，结果表明在磷酸盐缓冲液的ph在5.0-6.0范围内，检测效果最好。

实施例5

按照实施例2的方法评价gdqds荧光性能，将荧光的激发波长分别改为327nm、337nm、347nm、357nm、367nm，377nm，其他操作均与实施例2相同。如图6所示，结果表明，激发波长的红移导致gdqds的荧光信号强度和位置发生变化。激发波长在327nm-347nm时，gdqds的荧光信号强度逐渐增强；激发波长在347-377nm时，gdqds的荧光信号强度逐渐减弱，荧光强度在347nm处达到最大值；如图6所示，因此，在激发波长为347nm时可达到最佳检测效果。同时根据荧光光谱进行反扫得到发射波长在430nm可达到最佳检测效果。

实施例6

取20g剁碎的牛肉馅，加入各30ml的三氯乙酸，无水乙醇，乙腈，超声15min，然后在转速8000r/min条件下，离心分离20min，取上清液备用。取50μl的离心上清液和50μl的实施例1所配制的量子点溶液混合，加磷酸缓冲液至gdqds浓度为20μg/ml。按实施例3的方法测定上清液，通过实施例3的稳态光谱仪测量荧光光谱，根据实施例3建立的标准曲线，计算得到牛肉样中阿莫西林的浓度为0.023μmol/l，计算得牛肉样中的阿莫西林残留为0.0083mg/l，通常阿莫西林在牛的可食用组织中最高残留限量值为0.01mg/l，因此，本发明可以用于检测牛肉类中阿莫西林的残留量是否符合法规规定，具有广泛的应用性。