一种建筑工地水环境中病原菌检测电极的制备方法与流程

1.本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种建筑工地水环境中病原菌检测电极的制备方法。


背景技术：

2.细菌检测对人类健康有重要意义，目前检测致病菌的方法主要是使用抗体或dna。标准方法为酶联免疫吸附试验(elisa)和聚合酶链反应(pcr)。这些方法具有较高的灵敏度和特异性。然而，他们需要训练有素的人员和较长的分析时间。这些限制阻碍了它们作为实时、宽范围检测平台的使用，而这在尤其在偏远户外建筑工地作业时，需要对当地水源进行检测和处理，有效地检测技术的简洁性和快速性是当下的目标。
3.电化学方法通过电化学得到的电阻数据，得到不同细菌的图谱数据，从而达到鉴定不同种类的细菌目的，具有快速、稳定、简单、成本低廉的优点，然而水环境中病原菌检测用电极的制备工艺不够完善造成电极使用寿命短、检测效率低无法准确鉴定不同种类的细菌的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中水环境中病原菌检测用电极的制备工艺不够完善造成电极使用寿命短、检测效率低无法准确鉴定不同种类的细菌的问题，而提出的一种建筑工地水环境中病原菌检测电极的制备方法。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种建筑工地水环境中病原菌检测电极的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、制备金电极：在si/sio2基底上光刻金叉指电极；
8.s2、电极表面处理：s1中所得电极分别在丙酮超声处理10分钟、通氮气超声处理30分钟、氧等离子体气浴10分钟，和紫外臭氧30 分钟，用1
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)处理表面；
9.s3、电极表面修饰单壁碳纳米管(swnts)：碳纳米管孵育以实现碳纳米管在电极表面的均匀组装，在去离子水的作用下冲洗掉多余的单壁碳纳米管，并在林德伯格蓝m管炉中退火；
10.s4、连接分子的孵育：由s3所得装置在浓度为3mg/ml的1
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芘丁酸琥珀酰亚酯(pbase)二甲基甲酰胺(dmf)溶液中孵育1小时，然后用二甲基甲酰胺和10mm的磷酸盐缓冲液(pb)冲洗；
11.s5、阻断反应：乙醇胺(0.1％)用于阻断未反应的pbase位点，0.1％吐温20用于阻断开放的swnt区域，最大限度地减少非特异性结合，孵育时间为10分钟，然后用pb冲洗。
12.s1步骤中优选方案：
13.s101、在si/sio2上的光刻的叉指金电极，其形状结构为20个 200μm长，5μm宽以及叉指间间隔3μm。
14.s2步骤中优选方案：
15.s301、碳纳米管孵育以实现碳纳米管在电极表面的均匀组装，在去离子水的作用下冲洗掉多余的单壁碳纳米管，并在林德伯格蓝m管炉中在250℃退火1小时。
16.s4步骤中优选方案：
17.连接分子的孵育由s3所得装置在浓度为3mg/ml的1
‑
芘丁酸琥珀酰亚酯(pbase)二甲基甲酰胺(dmf)溶液中孵育1小时。然后用二甲基甲酰胺和10mm的磷酸盐缓冲液(pb)冲洗，为了监测每个后续功能化的有效性和大小，在每个孵化步之前和之后，使用chi 1202a 电化学工作站进行i
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v测量，并根据斜坡计算出电阻。
18.本发明工艺简单、操作方便、产率高；具有稳定性好、比表面积大、电子传递速率快等优点，此法修饰的电极可应用于细菌种类的电化学鉴定。
附图说明
19.图1是碳纳米管功能化交指电极的sem图。
20.图2是在si/sio2上的叉指金电极，20个200μm长，5μm宽，间隔3μm。
21.图3是实验中主成分分析结果结果：6种受体(3种糖类和3种凝集素)和4种受体(3种糖类和cona凝集素)对细菌类型的聚类具有较好的分辨，有效区分四种细菌。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
23.一种建筑工地水环境中病原菌检测电极的制备方法，包括以下步骤：
24.s1、制备金电极：在si/sio2基底上光刻金叉指电极；，其形状结构为20个200μm长，5μm宽以及叉指间间隔3μm。
25.s2、电极表面处理：s1中所得电极分别在丙酮超声处理10分钟、通氮气超声处理30分钟、氧等离子体气浴10分钟，和紫外臭氧30 分钟，用1
‑
氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)处理表面；
26.s3、电极表面修饰单壁碳纳米管(swnts)：碳纳米管孵育以实现碳纳米管在电极表面的均匀组装，在去离子水的作用下冲洗掉多余的单壁碳纳米管，并在林德伯格蓝m管炉中在250℃退火1小时。
27.s4、连接分子的孵育：由s3所得装置在浓度为3mg/ml的1
‑
芘丁酸琥珀酰亚酯(pbase)二甲基甲酰胺(dmf)溶液中孵育1小时，然后用二甲基甲酰胺和10mm的磷酸盐缓冲液(pb)冲洗；为了监测每个后续功能化的有效性和大小，在每个孵化步之前和之后，使用 chi 1202a电化学工作站进行i
‑
v测量，并根据斜坡计算出电阻。
28.s5、阻断反应：乙醇胺(0.1％)用于阻断未反应的pbase位点，0.1％吐温20用于阻断开放的swnt区域，最大限度地减少非特异性结合，孵育时间为10分钟，然后用pb冲洗。
29.参照图1
‑
3，通过实验用上述方法制备的电极在初始电阻、性能和稳定性方面具有很好的重现性。
30.芯片内电阻(55个电极)之间的比例在19％以内。平均25个电极在一个月的时间内保持其初始电阻的12％。除了显示了功能化对器件电阻的影响(i
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v曲线的斜率)外，还显示
了传感器在浓度为1x103和 1x107 cfu/ml时对大肠杆菌的响应，信号随着细菌细胞浓度的增加而增加。最初测试了这些研究中使用的对氨基苯基糖具有高特异性或无特异性的凝集素，以证明设备能够通过其自然产生的表面凝集素与细菌结合。文献报道cona对葡萄糖和甘露糖有高亲和性，花生对半乳糖和wga对n
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乙酰氨基葡萄糖有高亲和性。每组试验新鲜配制16、 17个凝集素原液，配制为1mm富集pb 3mg/ml ca2+和mn2+离子。这些离子被用于特定的凝集素，称为c
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凝集素，c
‑
凝集素具有金属结合位点，需要它们被占据才能达到正确的构象来结合碳水化合物。通过连续稀释达到低浓度。各浓度孵育1h，用pb冲洗并测定其电阻。
31.用各自的糖检测游离凝集素，验证实验方案和孵育方法，与文献报道具有良好的相关性。对于测试的每个凝集素的选择性，虽然每个凝集素都有与其结合最强的一种糖类，但其结合强度不同，亲和结合常数证明了这一点。对于与n
‑
乙酰氨基葡萄糖有亲和力的wga的检测，通过与n
‑
乙酰氨基葡萄糖有较低亲和力的糖苷捕获，产生小信号。由于这些原因，通过它们各自的糖类来检测凝集素的信号都不是很大。
32.如上所述，pbase可以与胺修饰的糖类反应。它的目标是捕捉细菌表面的凝集素。将氨基苯基糖功能化的器件分别与本工作中使用的四种不同细菌中的一种在不同浓度下孵育1h，然后用pb冲洗并进行电阻测量，以进行定量检测、灵敏度、动态范围和检测限。标准化的生物传感器的响应(r r0)/r0，其中r0设备的阻力与渐变功能化和阻塞的空置的网站后20r是阻力与细菌培养后，从v曲线的斜率的倒数+0.2至0.2v策划作为细菌浓度的函数。在检测范围内响应是线性的，不同的生物受体使用不同。在2x103～2x108 cfu/ml的浓度范围内，大肠杆菌对半乳糖苷的回归方程为y＝0.92x0.90(r2＝ 0.95)，对甘露糖苷的回归方程为y＝0.61x2.2(r2＝0.92)，对葡萄糖苷的回归方程为y＝0.31x
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1.1(r2＝0.62)分别得到，其中y为抗性的相对变化((r r0)/r0)，x为细菌浓度的对数。另外， pbase可以与凝集素上的胺反应。这反过来又以细菌表面的糖类为目标进行结合。在这种情况下，凝集素的原液在富集的pb中制备，在 pbase设备上孵育2小时，然后孵育细菌。用同样的3种凝集素和3 种糖类在磷酸盐缓冲液中检测4种细菌、1种噬菌体和1种病毒。结果表明噬菌体对6种受体中的任何一种都没有亲和力，而h1n1病毒对每一种受体都有轻微的亲和力，最明显的是对凝集素。这被先前的研究证实，该研究报道了通过凝集素凝集从基质中分离病毒。然而，这6种受体对细菌的检测导致了更大的反应和每个细菌的独特特征。因为革兰氏阴性菌有lps层，其结构和组成变化很大，这些细菌产生的反应模式差异最大，很容易区分。另一方面，革兰氏阳性菌的外部结构相似，主要由肽聚糖组成。由于二者相似，本研究中检测的两种革兰氏阳性细菌产生了相似的反应模式。有必要指出的是，糖功能化装置的响应比凝集素产生更高的响应，这提供了更高的灵敏度。另外，因为不是所有的细菌表面都有凝集素，使用糖类作为生物受体可以获得更高的特异性。从这些结果中，一个阵列可以用于区分细菌和病毒感染，并具有区分革兰氏型的潜力，在革兰氏阳性细菌的情况下，进一步鉴定物种。当在相关的人工基质中检测细菌时，面临着几个挑战。对人工尿中的大肠杆菌的检测，尿素的存在抑制了10倍。众所周知，尿素在足够高的浓度下可以展开蛋白质。对于这里采用的检测方案，展开蛋白质意味着失去结合位点，从而失去检测性。就变形链球菌而言，人工唾液中的黏液蛋白提供了一些背景信号。为了尽量减少粘蛋白在设备上的粘附，在其他功能化步骤之前，cnt设备用0.1％的巯基己醇(mch)处理。mch治疗后黏液蛋白的贡献被确定为信号的20％，这一结果与先前报道的工作相似。
33.为了从统计学上确定每个细菌的反应是唯一的或可区分的，进行了主成分分析(pca)。pca是一种用于分析多变量数据的化学计量工具。通常绘制结果的pca得分产生集群。这些集群的接近程度可以解释为数据的相关性或相似性，即可区分性或不可区分性，这是执行该分析的目标。从主成分分析和随后的图中，我们可以提取出哪些变量对分析物的独特性贡献最大或最多，在这种情况下是细菌。这对于设计一个由最强或最重要的受体组成的阵列来鉴别细菌是有用的。因此，一种具有最小元件的优化阵列可以设计为具有高选择性。将6个受体的个体δr/r0数据排成18个单元行。每一行对应一个完整的数组。四种细菌各生成三行。数组中95％的总方差被前两个主成分分析因子捕获。绘制这两个因素的pca得分，显示了4个单独的集群，每个细菌一个，这表明无论类型如何，每个集群都是可区分的。使用6 个受体的不同组合重复这个分析，以确定哪个受体对反应谱的独特性贡献最大。3种糖类和cona的数据是所有组合中聚类最紧密的。这意味着糖和cona凝集素是反应谱的独特性的四个主要因素，4个受体足以保持簇分离(即细菌鉴定)。这种方法有助于将阵列优化到最小数量，从而提高设备的成本效益和整体效率。通过凝集素与碳水化合物的相互作用，为捕获细菌提供了一个有效的平台。结果证明了使用这种传感器来区分病毒和细菌感染的可能性，可以用于临床相关的细菌浓度。
34.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。