一种基于AgBiS2的光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌的方法与流程

一种基于agbis2的光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域
1.本发明属于食源性致病菌检测领域，具体涉及一种基于agbis2的夹心型近红外光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌的方法。


背景技术：

2.食源性疾病是一个世界性的公共卫生问题，截至目前，有七种常见的致病菌被认为是造成食品污染的主要的食源性致病菌。其中，金黄色葡萄球菌(s.aureus)是一种典型且常见的食源性致病微生物，在自然界中广泛存在，在适当的条件下能够产生肠毒素引发食物中毒，对人类健康构成了极大威胁。目前关于金黄色葡萄球菌的检测技术有很多，传统的金标准检测方法，如平板计数法通常需要1到2天才能获得检测结果，不能满足实时检测的目的。为了快速检测，已经开发了各种方法，例如聚合酶链反应(pcr)、酶联免疫吸附测定(elisa)和流式细胞术。在这些方法中，pcr和流式细胞术需要专业技能和昂贵的操作成本，这限制了它们的广泛应用。作为商品化试剂盒的核心技术，elisa实现了细菌的简单自动检测，然而酶的固有缺陷和相对复杂的修饰过程使得其难以达到细菌检测所要求的性能。因此，构建一种简单快速，准确灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法尤为重要。
3.近年来，新兴且发展迅速的光电化学(pec)传感策略受到了广泛的关注。光电化学指分子、离子或半导体材料等因吸收光子而使电子受激发产生的电荷传递，从而实现光能向电能的转化过程。由于输入(光)信号和输出(电)信号的分离，与传统的电化学传感器相比，该传感器具有背景信号低、灵敏度高、简单快速等优点，可实现对金黄色葡萄球菌实时快速的监测。
4.目前国内外研究较热的是以金属半导体为光电材料(如氧化锌，二氧化钛等)，以氙灯作为激发光源而构建的紫外
‑
可见光响应型光电化学传感器。然而在太阳光谱中，约占50％的近红外光源(780
‑
2526nm范围内的电磁波)未得到利用。此外，一些研究表明，高能量的光子可能会损害生物分子和传感系统，并对实验结果造成干扰。与紫外光/可见光相比，近红外光源具有较强的穿透能力，良好的生物相容性，极低的光毒性等优点。然而，由于缺乏具有高稳定性和高近红外pec活性的半导体材料，目前关于近红外pec传感器的研究才刚刚起步，且未见以近红外作为光源对金黄色葡萄球菌检测的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种检测金黄色葡萄球菌的方法，通过合成禁带宽度低、近红外pec活性高的半导体材料agbis2，进而构建一个近红外响应型光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌。该方法操作简单快速、灵敏度高、检出限低、稳定性好。
6.本发明提供的一种基于agbis2的夹心型近红外光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌的方法包括如下步骤：
7.步骤s1：将氨基功能化agbis2(nh2‑
agbis2)溶于去离子水，得到悬浮液a；将羧基功
能化金黄色葡萄球菌适配体(cooh
‑
apt)溶于磷酸盐缓冲溶液，得到溶液b；
8.步骤s2：将1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液c；
9.步骤s3：将悬浮液a和溶液b、c混合，并进一步反应得到悬浮液d；
10.步骤s4：将牛血清白蛋白(bsa)溶于去离子水，得到溶液e，将步骤s3得到的悬浮液d和和溶液e混合、反应得到悬浮液f，将悬浮液f离心后分散于磷酸盐缓冲溶液中，得到目标产物nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa；
11.步骤s5：通过电沉积方法在fto导电玻璃(掺杂氟的sno2透明导电玻璃)表面电沉积金纳米粒子(aunps)，得到目标产物aunps/fto；
12.步骤s6：将巯基功能化金黄色葡萄球菌适配体(sh
‑
apt)溶于去离子水，得到溶液g，将溶液g滴在aunps/fto表面进行孵育，之后用含有吐温
‑
20(tween
‑
20)的磷酸盐缓冲液冲洗，得到目标产物sh
‑
apt/aunps/fto；
13.步骤s7：先后移取一定体积的含有tween
‑
20的牛血清白蛋白溶液和不同浓度的金黄色葡萄球菌悬液于sh
‑
apt/aunps/fto表面进行孵育，之后均用含有tween
‑
20的磷酸盐缓冲液冲洗，得到目标产物s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto；
14.步骤s8：将步骤s4得到的nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa滴在s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto表面孵育，之后用含有tween
‑
20的磷酸盐缓冲液冲洗，得到目标产物nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto；
15.步骤s9：利用计时电流法，用实验室自制的pec系统测试步骤s8得到的工作电极nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto的光电行为。
16.进一步地，步骤s1中悬浮液a的质量浓度为5mg/ml，溶液b的制备方法为将1.2nmol的羧基功能化金黄色葡萄球菌适配体(cooh
‑
apt)溶于50μl磷酸盐缓冲溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/l，ph值为7.4。
17.进一步地，步骤s1中氨基功能化agbis2(nh2‑
agbis2)的制备方法如下：
18.步骤s1：将0.97g五水和硝酸铋和0.34g硝酸银置于30ml乙二醇中搅拌至充分溶解，得到溶液a；
19.步骤s2：将0.46g硫脲加入到溶液a中，搅拌2h，得到溶液b；
20.步骤s3：将0.31g醋酸铵加入到溶液b中，搅拌至充分溶解，得到溶液c；
21.步骤s4：将溶液c转移至30ml反应釜中，于170℃下水热反应4h；
22.步骤s5：反应结束并冷却至室温后，将反应釜内衬底部的黑色产物离心并用去离子水和乙醇反复洗涤3
‑
5次，最后在60℃下真空干燥，即可得到目标产物nh2‑
agbis2。
23.进一步地，步骤s2中溶液c的制备方法为将10mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和5mg n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶于500μl磷酸盐缓冲溶液(10mmol/l，ph值为7.4)。
24.进一步地，步骤s3中悬浮液a和溶液b、c混合后在恒温培养摇床中(25℃)以180rpm的转速振荡反应6h。
25.进一步地，步骤s4中的牛血清白蛋白(bsa)的质量分数为1％，且悬浮液d和溶液e在恒温培养摇床中(25℃)以180rpm的转速振荡反应1h得到悬浮液f，将悬浮液f于7000rpm转速下离心5min后分散于1ml磷酸盐缓冲溶液中(10mmol/l，ph值为7.4)。
26.进一步地，步骤s5中以fto为工作电极，ag/agcl为参比电极，pt丝电极为对电极的三电极体系，通过在含有0.5mmol/l的氯金酸(haucl4)溶液中施加
‑
0.245v的电压100s，将aunps电沉积在fto导电面，之后用去离子水冲洗fto表面多余的haucl4溶液(缓慢冲洗3次)，最后置于100℃下干燥5min。
27.进一步地，步骤s6中sh
‑
apt的浓度为2μmol/l，取50μl 2μmol/l的sh
‑
apt溶液滴在aunps/fto表面于37℃下孵育2h，之后用含有0.05％的tween
‑
20的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.4)缓慢冲洗三次，得到目标产物sh
‑
apt/aunps/fto。
28.进一步地，步骤s7中先移取50μl含有0.05％的tween
‑
20的牛血清白蛋白溶液(质量分数为1％)滴在工作电极sh
‑
apt/aunps/fto表面于37℃下孵育1h，再移取50μl不同浓度的金黄色葡萄球菌悬液滴在工作电极bsa/sh
‑
apt/aunps/fto表面于37℃下孵育50min，之后用含有0.05％的tween
‑
20的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.4)缓慢冲洗三次，得到目标产物s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto。
29.进一步地，步骤s8中移取50μl步骤s4得到的nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa悬浮液滴在s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto工作电极表面，于37℃下孵育1h，之后用含有0.05％的tween
‑
20的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.4)缓慢冲洗三次，得到目标产物nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto。
30.进一步地，步骤s9中光电化学法检测金黄色葡萄球菌的具体方法如下：
31.步骤s1：以fto为工作电极，ag/agcl为参比电极，pt丝电极为对电极，将三电极浸在装有磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/l，ph＝7.4)的电解池中；
32.步骤s2：激发光源由980nm激发器提供，偏置电压设为0.2v，利用计时电流法进行测定，获得光电流信号；
33.步骤s3：首先测定所制备的工作电极bsa/sh
‑
apt/aunps/fto的光电流，然后依次测定孵育不同浓度金黄色葡萄球菌后的工作电极nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto的光电流；
34.步骤s4：将测得的一系列光电流数据载入到origin中作图。
35.本发明提出的基于agbis2的夹心型近红外光电化学传感器检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：首先通过简单的高温溶剂热法合成了氨基功能化的花状团簇agbis2，利用经典的酰胺化反应，将氨基功能化的agbis2与羧基功能化的金黄色葡萄球菌适配体(cooh
‑
apt)偶联，作为信号探针(nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt)。其次通过电沉积方法在fto导电玻璃(掺杂氟的sno2透明导电玻璃)表面电沉积金纳米粒子(aunps)，利用au
‑
s键将巯基功能化的金黄色葡萄球菌适配体(sh
‑
apt)固定在fto表面。在检测过程中，金黄色葡萄球菌首先被固定在fto表面的sh
‑
apt捕获，再与信号探针特异性结合，从而构建了一种夹心型(适配体
–
金黄色葡萄球菌
–
信号探针)近红外pec传感器，适配体修饰的信号探针agbis2在980nm近红外光源的激发下产生光电流，光电流的强度随着金黄色葡萄球菌浓度的增大而增强，因此可实现金黄色葡萄球菌的检测。
附图说明
36.包括附图以提供对实施例的进一步理解并且附图被并入本说明书中并且构成本说明书的一部分。附图图示了实施例并且与描述一起用于解释本发明的原理。将容易认识
到其它实施例和实施例的很多预期优点，因为通过引用以下详细描述，它们变得被更好地理解。附图的元件不一定是相互按照比例的。同样的附图标记指代对应的类似部件。
37.图1是根据本发明实施例的氨基功能化agbis2的x射线衍射图(xrd)图；
38.图2是根据本发明实施例的氨基功能化agbis2的扫描电镜(sem)图；
39.图3是根据本发明实施例的氨基功能化agbis2的紫外可见近红外(uv
‑
vis
‑
nir)吸收光谱图；
40.图4是根据本发明实施例的aunps的扫描电镜(sem)图；
41.图5是根据本发明实施例的nh2‑
agbis2和nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt的紫外
‑
可见(uv
‑
vis)吸收光谱图；
42.图6是根据本发明的实施例的检测不同浓度金黄色葡萄球菌的光电流示意图。
具体实施方式
43.参见附图所示，下面结合附图和实施例对本发明的实施方案作进一步说明。
44.首先，制备氨基功能化agbis2(nh2‑
agbis2)，将0.97g五水和硝酸铋和0.34g硝酸银置于30ml乙二醇中搅拌至充分溶解，得到溶液a；将0.46g硫脲加入到溶液a中，搅拌2h，得到溶液b；将0.31g醋酸铵加入到溶液b中，搅拌至充分溶解，得到溶液c；将溶液c转移至30ml反应釜中，于170℃下水热反应4h；反应结束并冷却至室温后，将反应釜内衬底部的黑色产物离心并用去离子水和乙醇反复洗涤3
‑
5次，最后在60℃下真空干燥，即可得到目标产物nh2‑
agbis2；
45.将氨基功能化agbis2(nh2‑
agbis2)溶于去离子水，得到悬浮液a(质量浓度为5mg/ml)，将1.2nmol的羧基功能化金黄色葡萄球菌适配体(cooh
‑
apt)溶于50μl磷酸盐缓冲溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/l，ph值为7.4，得到溶液b；
46.将10mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和5mg n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶于500μl磷酸盐缓冲溶液(10mmol/l，ph值为7.4)，得到溶液c；
47.将悬浮液a和溶液b、c混合后在恒温培养摇床中(25℃)以180rpm的转速振荡反应6h，进一步反应得到悬浮液d；
48.将牛血清白蛋白(bsa)溶于去离子水，得到溶液e(质量分数为1％)，将悬浮液d和溶液e在恒温培养摇床中(25℃)以180rpm的转速振荡反应1h得到悬浮液f，将悬浮液f于7000rpm转速下离心5min后分散于1ml磷酸盐缓冲溶液中(10mmol/l，ph值为7.4)，得到目标产物nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa；
49.通过电沉积方法在fto导电玻璃(掺杂氟的sno2透明导电玻璃)表面电沉积金纳米粒子(aunps)，选用以fto为工作电极，ag/agcl为参比电极，pt丝电极为对电极的三电极体系，在含有0.5mmol/l的氯金酸(haucl4)溶液中施加
‑
0.245v的电压100s，将aunps电沉积在fto的导电面，电沉积结束后，用去离子水缓慢冲洗fto表面多余的haucl4溶液(冲洗3次)，置于100℃下干燥5min即可得到目标产物aunps/fto；
50.将巯基功能化金黄色葡萄球菌适配体(sh
‑
apt)溶于去离子水，得到溶液g(浓度为2μmol/l)，取50μl 2μmol/l的溶液g滴在aunps/fto表面，于37℃下孵育2h，之后用含有0.05％的tween
‑
20的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.4)缓慢冲洗三次，得到目标产物sh
‑
apt/aunps/fto；
51.先移取50μl含有0.05％的tween
‑
20的牛血清白蛋白溶液(质量分数为1％)滴在工作电极sh
‑
apt/aunps/fto表面于37℃下孵育1h，再移取50μl不同浓度(2
×
10、2
×
102、2
×
103、2
×
104、2
×
105、2
×
106、2
×
107cfu/ml)的金黄色葡萄球菌悬液滴在工作电极bsa/sh
‑
apt/aunps/fto表面于37℃下孵育50min，之后用含有0.05％的tween
‑
20的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.4)缓慢冲洗三次，得到目标产物s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto；
52.取50μl nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa悬浮液滴在s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto工作电极表面，于37℃下孵育1h，之后用含有0.05％的tween
‑
20的磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.4)缓慢冲洗三次，得到目标产物nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto；
53.利用计时电流法，用pec系统测试工作电极nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto的光电行为，检测金黄色葡萄球菌：以fto为工作电极，ag/agcl为参比电极，pt丝电极为对电极，将三电极浸在装有磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/l，ph＝7.4)的电解池中；激发光源由980nm激发器提供，偏置电压设为0.2v，利用计时电流法进行测定，获得光电流信号；首先测定所制备的工作电极bsa/sh
‑
apt/aunps/fto的光电流，然后依次测定孵育不同浓度金黄色葡萄球菌后的工作电极nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt/bsa/s.aureus/bsa/sh
‑
apt/aunps/fto的光电流；将测得的一系列光电流数据载入到origin中作图。
54.图1为制备的氨基功能化agbis2的xrd图，如图1所示，所制备样品的衍射峰与立方相agbis2(jcpds：89
‑
2046)标准卡片上的衍射峰一一对应，且没有出现杂质峰，说明成功制备了纯净的立方相agbis2。
55.图2为制备的氨基功能化agbis2的sem图，如图2所示，可以看到agbis2由纳米片组成花状团簇，直径约为3.3μm。纳米花结构可以提供更大的比表面积，有利于将光能转换成电能。
56.图3为氨基功能化agbis2的uv
‑
vis
‑
nir吸收光谱图，如图3所示，agbis2在紫外可见近红外区域都有较强的光吸收，吸收边为1425nm，利用吸收光谱确定带隙值，发现agbis2的禁带宽度值eg约为0.87ev，由此证明所制备的agbis2可直接被980nm的近红外光源激发。
57.图4为在fto表面电沉积aunps的sem图，如图4所示，aunps分散均匀，尺寸均一，直径约为200nm。
58.图5为nh2‑
agbis2和cooh
‑
apt偶联之前和之后的紫外可见吸收光谱图，单独的nh2‑
agbis2悬浮液在260nm的波长处无吸收峰，而nh2‑
agbis2和cooh
‑
apt偶联后得到的复合物在260nm出现了明显的吸收峰，这是因为核酸分子所含的碱基可以使核酸在260nm的波长处有最大吸收，由此证明nh2‑
agbis2和cooh
‑
apt偶联成功。
59.图6为检测不同浓度金黄色葡萄球菌的光电流示意图，从图6可以清楚地看到，光电流强度随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增大。这是由于随着固定在fto表面的金黄色葡萄球菌数量的增加，特异性识别金黄色葡萄球菌的信号探针(nh2‑
agbis2/cooh
‑
apt)也会随之增加，从而导致光电流强度的增大。因此，金黄色葡萄球菌的浓度可以通过pec强度的变化来确定。
60.相比于其它近红外光电化学材料，agbis2具有合成步骤简单、耗时短以及光电性能良好的优点。相比于其它的金黄色葡萄球菌检测方法，本发明操作简单快速、灵敏度高、稳定性好。