一种用光谱和荧光探针筛选嫁接亲和性砧木的方法

1.本发明属于砧木筛选技术领域，尤其涉及一种嫁接亲和性砧木筛选方法。


背景技术：

2.甜瓜作为世界十大水果之一，是国内外重要的园艺作物和经济作物，其在促进农民增收和满足人们日益增长的瓜果需求方面发挥着巨大作用。农户往往固定地点栽培，由于土传病害的影响无法连作，严重影响到甜瓜的正常生长，导致产量和品质下降，阻碍了甜瓜产业的发展。嫁接换根可以解决连作障碍，提高产量和果实品质。
3.由于缺乏优质的亲和性甜瓜砧木资源，我国甜瓜嫁接比例仍旧较低，嫁接亲和性差。以往筛选亲和性甜瓜砧木材料，都是通过将不同砧木嫁接后的甜瓜苗定植到大田，通过人工判别嫁接苗的后期生长情况、果实产量和品质等，传统方法至少需要28d，在嫁接后7d接穗株高和干重不会表现出显著差异，无法判断是否亲和，直到28d才表现显著差异，进而判断亲和性好坏。整个过程耗时长，耗费大量的人力物力，成本高。
4.现有的甜瓜嫁接亲和性筛选砧木过程耗时长，依赖植株生长参数进行亲和性评价，耗费大量的人力和物力，成本高。现有技术缺乏判断砧木是否适合甜瓜嫁接，是否具有足够的亲和性的简易标准方法。


技术实现要素：

5.本发明依据甜瓜嫁接不亲和与砧穗粘连和韧皮部运输功能障碍有关，嫁接不亲和砧木导致接穗和砧木之间韧皮部不能有效连通，利用荧光探针标记营养物质再甜瓜中的运输，当荧光探针在接穗嫁接愈合部运输受阻，不能到达接穗部分时，从而判断甜瓜砧木的嫁接亲和性，因此得以解决以上问题。
6.为实现上述目的，本发明提出一种用光谱方法和荧光探针筛选嫁接亲和性砧木的方法，包括以下步骤：
7.步骤一，砧木与接穗切面紧密贴合后夹上嫁接夹，进行嫁接愈合期管理；
8.步骤二，在嫁接愈合期管理时，测量前将嫁接苗穴孔盘底部浸入荧光素二钠盐溶液中，浸渍后取出，然后将穴孔盘底部冲洗干净，对嫁接后的嫁接苗进行荧光染色，嫁接苗穴孔盘置于暗室中由光源照射到嫁接苗砧木和接穗结合部位表面；
9.步骤三，使用微型光纤光谱仪分别在砧木和接穗区域接收荧光反射光谱，测量每个位置的反射光谱，分别计算位于砧木和接穗区域的不同部位在各波长点数处的光谱平均值，并对砧木和接穗区域的各波长点数处的平均光谱数据进行预处理；
10.砧木区域为砧木上靠近砧木和接穗结合部位的下方的多个部位；接穗区域为接穗上靠近砧木和接穗结合部位的上方的多个部位；
11.平均光谱数据的预处理包括采用多元散射校正msc和标准正态变量交换snv来对光谱数据进行散射校正，采用一阶导数处理和二阶导数处理来对光谱数据进行基线校正，采用savitzky-golay卷积平滑对光谱数据进行平滑处理；
12.步骤四，结果判断：若接穗区域的各部位的光谱图，在500-600nm范围内的525nm位置出现较高强度的峰，接穗上方的真叶叶脉中也发出525nm的绿色荧光，说明甜瓜嫁接苗木质部已经连通，该砧木为亲和性砧木；
13.或计算接穗区域的接穗愈合部在525nm波长处的相对荧光强度：
[0014][0015]
接穗愈合部相对荧光强度大于70％，说明甜瓜嫁接苗木质部已经完全连通，该砧木为亲和性砧木。
[0016]
进一步地，所述荧光素二钠盐溶液的浓度为5mg/ml。
[0017]
进一步地，所述砧木与接穗采用单子叶贴接的方式进行嫁接，包括步骤：砧木第1片真叶完全展平且接穗第1片真叶微露时，先去除砧木的所有真叶，再用刀片在砧木子叶基部斜向45
°
向下切除一片子叶，切面约0.5cm；嫁接刀片在距接穗子叶基部0.5cm-1.0cm处向上成45
°
左右斜切，切面约0.5cm，将砧木与接穗切面紧密贴合，夹上嫁接夹。
[0018]
进一步地，所述紫外灯为15w的光源。
[0019]
本发明与现有技术相比，具有如下突出性质和显著优点：
[0020]
本发明提供了一种用光谱法和荧光探针筛选甜瓜嫁接亲和性砧木的方法，能够实时监测嫁接苗的愈合情况，在嫁接后7d完成亲和性砧木材料的筛选，接穗愈合部的相对荧光强度表现出显著差异，准确性高，快速便捷，省时省力，成本低。
[0021]
本发明利用嫁接不亲和砧木导致接穗和砧木之间韧皮部、木质部不能有效连通，根系的荧光探针在接穗嫁接愈合部运输受阻，无法达到接穗部位，从而通过微型光纤光谱仪测量荧光染料在365nm紫外光的照射下的525nm波长的发光强度，来判断判断接穗和砧木之间是否有效连通，从而判定甜瓜砧木的嫁接亲和性。
[0022]
通过本办法，能够实时监测嫁接苗的愈合情况，可以在嫁接后7d就判断砧木与甜瓜的嫁接亲和性，快速、准确性高、省时省力、成本低。对于甜瓜砧木的选育和嫁接栽培具有重要意义，促进嫁接甜瓜在生产上的大面积应用，减少生产上由于嫁接不亲和导致的生产损失。
附图说明
[0023]
图1为嫁接苗砧木接穗光谱采样示意图；
[0024]
图2为嫁接苗7日内光谱图。
具体实施方式：
[0025]
为了更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。
[0026]
实施例1：
[0027]
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
[0028]
甜瓜嫁接亲和性砧木筛选方法包括以下步骤:
[0029]
步骤一，对甜瓜砧木种子、甜瓜接穗种子使用0.1％高锰酸钾溶液消毒15min；分别反复清洗至去除种子外杂质后，室温浸种10h，再次用蒸馏水冲洗；
[0030]
步骤二，对浸种后甜瓜砧木种子于30℃恒温黑暗条件催芽24h-48h，胚根露白时播
种于消毒后的50孔穴盘，1穴1粒；对浸种后的甜瓜接穗种子于30℃恒温催芽24h，胚根露白时撒播于平盘中；嫁接之前需用75％医用酒精对刀片、嫁接夹消毒、自然晾干；并于嫁接前1天将基质浇透水。
[0031]
并于砧木第1片真叶完全展平且接穗第1片真叶微露时采用单子叶贴接的方式进行嫁接：
[0032]
砧木处理：先去除砧木的所有真叶，再用刀片在砧木子叶基部斜向45
°
向下切除一片子叶，切面约0.5cm；
[0033]
接穗处理：嫁接刀片在距子叶基部0.5cm-1.0cm处向上成45
°
左右斜切，切面约0.5cm；
[0034]
将砧木与接穗切面紧密贴合，夹上嫁接夹。
[0035]
步骤三，进行嫁接愈合期的管理：包括温度管理、湿度管理及光照管理，即白天28℃-25℃，晚上22c-18℃；嫁接后前3d湿度保持在95％以上；嫁接后4d-6d，通风，通风时间以接穗子叶不萎蔫为宜；7d后掀开薄膜，进入正常管理；嫁接后第1d保持黑暗，1d后保持弱光，光强约85umol/m2s-1
，7d后进入正常，光强约170umol/m m2s-1
。
[0036]
称取适量荧光素二钠盐，配置为5mg/ml的溶液，对嫁接后1-7天的甜瓜嫁接苗进行荧光染色实验。
[0037]
步骤四，将嫁接苗穴孔盘底部浸入荧光素二钠盐溶液中，浸渍60min后取出，将穴孔盘底部冲洗干净，置于暗室中光源为15w的365nm紫外灯下，将紫外灯呈45
°
照射到嫁接苗砧木和接穗结合部位表面。
[0038]
以上步骤中砧木与接穗的嫁接方法及嫁接愈合期管理方法属于本领域的常规手段，使用任何本领域的常规手段进行砧木与接穗的嫁接后，再使用本发明的方法检测砧木的亲和性，都能得到接穗愈合部相对荧光强度。荧光素二钠盐是常见的照影剂，被光照射后可激发荧光，只是紫外光的波长更短，激发后荧光强度更显著，使用其他的光源也能激发荧光素二钠盐产生荧光，不影响本发明的实施。
[0039]
步骤五，如图2所示，使用微型光纤光谱仪分别在砧木和接穗区域接收荧光反射光谱，砧木区域为砧木上靠近砧木和接穗结合部位的下方的多个部位；接穗区域为接穗上靠近砧木和接穗结合部位的上方的多个部位，采集时分别在砧木和接穗区域选取3个不同位置，测量每个位置的反射光谱，计算砧木和接穗区域3个不同位置在各波长点数处的光谱平均值，并对砧木和接穗区域的各波长点数处的平均光谱数据进行预处理。
[0040]
平均光谱数据的预处理包括采用多元散射校正(msc)和标准正态变量交换(snv)来对光谱数据进行散射校正，采用一阶导数处理和二阶导数处理来对光谱数据进行基线校正，采用savitzky-golay卷积平滑对光谱数据进行平滑处理。根据预处理的目的,光谱预处理方法可以分为基线校正、散射校正、平滑处理和尺度缩放四类。
[0041]
散射校正用来消除由于颗粒分布不均匀及颗粒大小不同、表面散射以及光程变化产生的散射对光谱的影响,包括msc和snv。msc首先计算校正集的平均光谱,然后将平均光谱作为标准光谱，每个样品的光谱与标准光谱进行一元线性回归运算，求得各光谱相对于标准光谱的线性平移量(回归常数)和倾斜偏移量(回归系数)，在每个样品原始光谱中减去线性平移量同时除以回归系数修正光谱的基线相对倾斜，这样每个光谱的基线平移和偏移都在标准光谱的参考下予以修正，而和样品成分含量所对应的光谱吸收信息在数据处理的
全过程中没有任何影响，所以提高了光谱的信噪比。以下为具体的算法过程：
[0042]
(1)计算平均光谱：
[0043]
(2)一元线性回归：
[0044]
(3)多元散射校正：
[0045]
公式中x
ij
表示n
×
p维定标光谱数据矩阵，n为定标样品数，p为光谱采集所用的波长点数，表示所有样品的原始光谱在各个波长点处求平均值所得到的平均光谱矢量，xi是1
×
p维矩阵，表示单个样品光谱矢量，mi和bi分别表示各样品光谱xi与平均光谱x进行一元线性回归后得到的相对偏移系数和平移量。
[0046]
snv从原始光谱中减去光谱平均值后,再除以校正集光谱的标准偏差。
[0047][0048][0049]
k＝1,2,
…
p；公式中的x是上一步计算得到的x
i(msc)
；
[0050]
基线校正是为了扣除仪器背景或漂移对信号的影响,包括一阶导、二阶导及cwt等处理。一阶导和二阶导处理分别可以扣除斜线和曲线背景,提高光谱分辨率,基本公式如下：
[0051][0052][0053]
式中,xi为第i个样品的光谱,即上一步计算得到的x
snc
,g为窗口宽度。
[0054]
平滑处理为了消除光谱信号中的随机噪声,提高样本信号的信噪比。savitzky-golay(sg)平滑法是利用多项式对原始光谱的移动窗口内的数据进行多项式分解并用最小二乘进行数据拟合,其实质是一种加权平均法。处理过程如http://www.doc88.com/p-7788316275187.html叙述的。
[0055]
若接穗部位光谱图(如图2)，在500-600nm范围内的525nm位置出现较高强度的峰，接穗上方的真叶叶脉中也发出525nm的绿色荧光，说明甜瓜嫁接苗木质部已经连通。
[0056]
进一步，判断甜瓜嫁接苗木质部的连通程度：
[0057]
计算接穗愈合部在525nm波长处的相对荧光强度：
[0058][0059]
上述接穗愈合部相对荧光强度大于70％，说明说明甜瓜嫁接苗木质部已经完全连
通，该砧木为亲和性砧木。
[0060]
如图2是平均光谱数据的预处理结果，嫁接苗在第嫁接7天后接穗愈合部相对荧光强度大于70％。
[0061]
表1
[0062][0063]
表1是用本发明筛选砧木的方法和传统筛选砧木的方法筛选不同品种的亲和性砧木所用的时间对比，传统筛选砧木的方法根据嫁接后接穗株高判断砧木的亲和性，平均需要28天，而使用本发明筛选砧木的方法仅需要7天，表1中同列不同字母表示结合多重比较后差异达到显著水平(p《0.05)。
[0064]
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以
根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。