甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒的制作方法

1.本发明属于医学检测领域，具体的涉及甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒。


背景技术：

2.常见的肝病有肝炎、肝硬化、肝脓肿、原发性肝癌等，肝炎主要以慢性肝炎为主，按病因学分为慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、药物毒性肝炎、遗传性疾病以及其它原因不明的慢性肝炎。临床诊断肝病主要靠检测一些肝脏合成的一些酶，例如丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶，通过测定这些酶活性来判断肝脏的损伤程度，这些酶类物质活性受其他因素影响比较大，例如疲劳、喝酒或者其他生活习性改变都可能导致这些酶活性变化，这些常规指标只能起到一个筛查作用，目前临床常用临床标志物为甲胎蛋白，但甲胎蛋白在肝癌诊断过程中存在特异性不强和灵敏度不高的特点。胆汁酸是由肝细胞中的胆固醇生物合成的，存在于胆汁中的一大类胆烷酸的总称，通常定位于肠肝循环系统，越来越受到大家的重视，胆汁酸浓度高低起到调节胆汁酸水平的作用。胆汁淤积是指肝脏胆汁流量受损的病理生理综合征。初期胆汁酸蓄积并促进肝细胞损伤，其次是肝硬化和肝功能衰竭。甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholicacid,gcdca)在血清中的蓄积，作为病理性肝细胞凋亡的诱导因子，对肝功能的损害具有重要的临床意义。甘氨鹅脱氧胆酸钠(glycochenodeoxycholatesodiumsalt,gs)是在肝脏中，游离鹅脱氧胆酸与甘氨酸结合时，形成一种结合型胆汁酸，以钠盐的形式存在。甘氨鹅脱氧胆酸钠水平能反应出鹅脱氧胆酸的浓度。鹅脱氧胆酸是fxr最有效的配体之一。鹅脱氧胆酸作为次级胆汁酸能活化核受体fxr，fxr主要是一种胆汁酸受体，可通过相应靶点基因参与胆汁酸代谢的调节。测量甘氨鹅脱氧胆酸钠，对于临床可以间接反应fxr活性。发现gcdc含量对良性肝病和癌症患者有一定意义，肝损伤程度和这种小分子代谢物水平具有良好的相关性，此外gcdc与消化道肿瘤的发生发展密切相关，为此设计出酶法测定甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒。


技术实现要素：

3.为解决上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种酶法测定甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒。
4.本发明为解决上述技术问题采用的技术方案是，甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂a和试剂b；
5.所述试剂a包括mes4.00g/l、brij350.8g/l、edta.2na.2h2o1g/l、thio-nad1.5g/l、草氨酸钠0.22g/l、proclin300:5g/l；
6.所述试剂b包括taps97.5g/l、曲拉通x-1000.8g/l、bsa0.5g/l、nadh4g/l、proclin300:10g/l、3αhsdh10ku/l。
7.优选的，还包括校准品tris12g/l、kh2po40.24g/l、na2hpo41.44g/l、nacl8g/l、kcl0.2g/l、bsa8g/l、蔗糖8g/l、甘氨鹅脱氧胆酸钠23mg/l、proclin300:5g/l。
8.优选的，还包括质控品tris12g/l、kh2po40.24g/l、na2hpo41.44g/l、nacl8g/l、
kcl0.2g/l、bsa8g/l、蔗糖8g/l、甘氨鹅脱氧胆酸钠23mg/l、proclin300:5g/l。
9.优选的，所述试剂a的ph为4.0-4.2。
10.优选的，所述试剂b的ph为9.2-9.5。
11.本发明取得的技术进步是：本发明中通过甘氨鹅脱氧胆酸钠在3α-羟基类固醇脱氢酶催化下将thio-nad+特异性地氧化，生成3-酮类固醇及thio-nadh，生成的3-酮类固醇在3α-羟基类固醇脱氢酶催化下还原性辅酶ⅰ(nadh)生成nad+。在405nm处测定生成的thio-nadh的吸光度变化，即可求得甘氨鹅胆酸钠含量。本发明稳定性好，精密度高，准确性良，并且具有很好的特异性，在临床检测过程中能更为准确的检测人体血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠的含量。
附图说明
12.图1为生化分析仪反应曲线图；
13.图2为22.32ug/ml对照品提取离子色谱图；
14.图3为实际样品溶液提取离子色谱图。
具体实施方式
15.下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
16.本发明提供了一种甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂a和试剂b；
17.所述试剂a包括mes4.00g/l、brij350.8g/l、edta.2na.2h2o1g/l、thio-nad1.5g/l、草氨酸钠0.22g/l、proclin300:5g/l；
18.所述试剂b包括taps97.5g/l、曲拉通x-1000.8g/l、bsa0.5g/l、nadh4g/l、proclin300:10g/l、3αhsdh10ku/l。
19.优选的，还包括校准品tris12g/l、kh2po40.24g/l、na2hpo41.44g/l、nacl8g/l、kcl0.2g/l、bsa8g/l、蔗糖8g/l、甘氨鹅脱氧胆酸钠23mg/l、proclin300:5g/l。
20.优选的，还包括质控品tris12g/l、kh2po40.24g/l、na2hpo41.44g/l、nacl8g/l、kcl0.2g/l、bsa8g/l、蔗糖8g/l、甘氨鹅脱氧胆酸钠23mg/l、proclin300:5g/l。
21.优选的，所述试剂a的ph为4.0-4.2。
22.优选的，所述试剂b的ph为9.2-9.5。
23.实施例：
24.首先，本试剂盒在生化分析仪上，用配套校准定标，对配套质控品进行检测，并和质谱检测数据进行对照。
25.一、生化分析仪检测
26.1、生化分析仪测定参数为：测定方法：速率法；反应方向：向上；反应时间：10min；主波：405nm；副波：660nm；样本量：3.6μl；试剂1：243ml；试剂2：81ml。
27.2、生化分析仪定标参数为：线性定标。
28.生化分析仪校准结果为:
[0029][0030]
二、质谱方法检测
[0031]
1、仪器与材料
[0032]
agilent1260高效液相色谱仪，6460质谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；电子天平(sartorius型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；色谱甲醇，乙腈(德国默克公司)；甲酸(色谱纯；赛默飞世尔科技有限公司)；甘氨鹅脱氧胆酸钠对照品(纯度》97％；德国默克公司)。
[0033]
2、色谱条件：
[0034]
phenomenexc18(150mm
×
2.1mm,3μm)色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-乙腈(50：50)，等度洗脱；洗脱时间：10min；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：2μl(图1)。
[0035]
3、质谱条件：
[0036]
mrm模式；esi电离源；正离子模式；毛细管电压：4000v；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11l/min；雾化器压力：15psi(表1)。
[0037]
表1甘氨鹅脱氧胆酸钠的质谱参数
[0038][0039]
三、检测结果如下：
[0040][0041]
四、检测：
[0042]
试剂盒包括试剂a和试剂b；
[0043]
所述试剂a包括mes4.00g/l、brij350.8g/l、edta.2na.2h2o1g/l、thio-nad1.5g/l、草氨酸钠0.22g/l、proclin300:5g/l；
[0044][0045]
所述试剂b包括taps 97.5g/l、曲拉通x-1000.8g/l、bsa0.5g/l、nadh 4g/l、proclin300:10g/l、3αhsdh 10ku/l。
[0046][0047]
该试验检测甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒的方法，包括如下步骤：
[0048]
1)实验所使用仪器为日立7600全自动生化仪(灵敏度0.001及以上, 其恒温装置的温度变化范围在
±
0.1℃)，水在未注明其他要求时，均不低于gb/t 6682-2008中三级水的要求。
[0049]
2)编辑实验参数：速率法；反应方向：向上；反应时间：10min；主波：405nm；副波：660nm；样本量：3.6μl；试剂1：243ml；试剂2： 81ml。
[0050]
3)将按上述标准优化后的甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒装载入日立 7600生化仪。
[0051]
4)以校准血清进行校准。
[0052]
5)检测质控血清确定检测的准确度。
[0053]
6)取临床血液标本离心，分离血清用甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒检测其结果。结果见表2。
[0054]
表2标准配制的甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒检测结果
[0055]
项目名称123校准浓度(μmol/l)47.647.747.6质控浓度(μmol/l)23.623.523.7临床血清(μmol/l)12.612.512.3
[0056]
7)将临床血清用质谱方法进行检测，检测结果见表3
[0057]
表3质谱检测结果
[0058]
项目名称123校准浓度(μmol/l)48.1048.0748.07质控浓度(μmol/l)23.523.423.3临床血清(μmol/l)12.312.412.4
[0059]
实验结果表明：我公司发明的甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒，稳定性好，精密度高，准确性良，并且具有很好的特异性，在临床检测过程中能更为准确的检测人体血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠的含量。进而更好的为临床服务，具有很好的社会效应和经济效益。