一种病理组织切片染色试剂盒的制作方法

1.本发明属于病理学组织切片染色领域，具体地说是一种病理组织切片染色试剂盒。


背景技术：

2.在诸如组织病理学和微生物学的生命学科中，通常使用显微镜(例如光学显微镜)检验样本，这种方法需要将样本安置在载玻片上，经过染色后，使用玻璃盖玻片加以粘合剂进行封片。在病理学检查中通常使用苏木精伊红染色方法(h&e)对组织样本进行着色。h&e染色是将组织切片经过脱蜡、水化、苏木精染色、水洗、分化、水洗、返蓝、水洗、伊红染色、脱水、透明和封片等复杂繁琐的步骤，使组织细胞中的不同成分染成不同深浅的颜色，增强不同成分间的对比度，从而便于病理医生在光学显微镜下进行观察和研究。
3.在常规h&e染色过程中，使用二甲苯进行脱蜡和后续的透明封固处理，对操作者伤害很大；水化和脱水过程使用梯度酒精等易挥发、易燃化学品；分化液通常使用盐酸酒精分化，盐酸的使用一方面增加了分化的控制难度，另一方面对于前处理欠佳的组织切片极易在分化过程中发生掉片而影响诊断和造成交叉污染；返蓝液常使用氨水溶液，氨水原液因储存和厂家不同，浓度略有差异，这造成配制的返蓝液浓度差异问题，易引起批间差；在苏木精染色液配制过程中，为加速苏木精向苏木因转化，往往使用化学氧化剂，如氧化汞、双氧水和碘酸钠，但化学氧化剂的使用通常会产生无效的反应产物如氧化苏木因和复合的聚合物沉淀，这种方法配制的苏木素染色液比自然成熟的埃里希苏木精(ehrlich’s hematoxylin)失效的更快，而造成染液有效期短，着色效果差，细胞核上色不鲜明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种病理切片染色试剂盒，用以解决现有技术中的缺陷，保证均一的h&e染色效果。
5.本发明通过以下技术方案予以实现：
6.一种病理组织切片染色试剂盒，包括切片脱蜡液、转换液、清洗液、分化液、返蓝液、苏木精染色液、伊红染色液和封片剂；
7.所述的切片脱蜡液包括以下质量体积份数(即固体以重量计算，液体以体积计算，二者换算比为g/ml)的组分：溶剂油70
‑
90份、中长链烷烃10
‑
30份；
8.所述的转换液包括以下质量体积份数的组分：二丙二醇甲醚50份和丙二醇甲醚醋酸酯50份；
9.所述的清洗液包括以下质量体积份数的组分：去离子水70份、表面活性剂0.01
‑
0.02份和乙二醇30份；
10.所述的分化液包括以下质量体积份数的组分：去离子水70份、乙二醇30份、冰醋酸0.3
‑
0.5份和乙酸钠0.05份；
11.所述的返蓝液包括以下质量体积份数的组分：去离子水70份、乙二醇30份、三羟甲
基氨基甲烷1.21份和浓度为0.1mol/l盐酸2.8份；
12.所述的苏木精染色液包括以下质量体积份数的组分：去离子水75份、乙二醇25份、苏木素0.6份、碘酸钠0.06份、硫酸铝2.67份、二丁基羟基甲苯0.2份、环糊精0.1份和冰醋酸4份；
13.所述的伊红染色液包括一下质量份数的组分：去离子水50份、乙二醇50份、水溶性伊红0.1份、冰醋酸0.9份和乙酸钠0.3份；其中伊红染色液的ph值为4.5；
14.所述的封片剂为柠檬油精封片剂或环保封片剂其中的任意一种。
15.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的切片脱蜡液中，溶剂油为脱芳烃溶剂油d60，所述的中长链烷烃为正十二烷。
16.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的清洗液中表面活性剂包括如下重量百分比的物质：triton x
‑
100 20％、tween 20 40％、和壬基酚聚氧乙烯醚np
‑
9 40％。
17.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的分化液的ph值为3.1。
18.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的返蓝液的ph值为8.5。
19.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的苏木素染色液的ph值为2.2。
20.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的环糊精为β
‑
环糊精，所述的硫酸铝为十八水合硫酸铝。
21.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，所述的伊红染色液的ph值为4.5。
22.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，制备苏木素染色液：将苏木素、硫酸铝、碘酸钠加入至50份去离子水中，加热至沸腾，搅拌均匀，加入乙二醇，搅拌均匀，自然冷却避光保存1h，即溶液a；将二丁羟基甲苯和环糊精加入至剩余25份去离子水中，加热并搅拌至环糊精完全溶解，即溶液b；将溶液b加入至溶液a中，加入冰醋酸，混合均匀，即得到苏木素染色液
23.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，包括如下步骤：
24.步骤a：按照配比称取制备切片脱蜡液、转换液、清洗液、分化液、返蓝液、苏木精染色液、伊红染色液所需原料；
25.步骤b：将步骤a中称取的各组分倒入对应的混合容器中，室温下搅拌20
‑
30min，以使配制的各溶液混合均匀，然后将配置好的切片脱蜡液、转换液、清洗液、分化液、返蓝液、苏木精染色液、伊红染色液和封片剂试剂盒中。
26.如上所述的一种病理组织切片染色试剂盒，
27.本发明的优点是：本发明提供了一种成分简单、效果良好、毒性低、新型的病理组织切片染色试剂盒及制备方法，主要用于病理组织h&e染色。本发明的特征在于1、减少二甲苯、酒精等传统染色试剂对操作者的危害；2、减少对环境的污染；3、染色过程不需要额外去离子水引入；4、分化液和返蓝液采用缓冲体系设计，作用更温和，h&e染色的着色效果更清晰、鲜明；5、与传统苏木素配方相比，本试剂盒引入β
‑
环糊精以中和碘酸钠还原后产物碘，增加了染液的染色能力，同时引入还原剂二丁羟基甲苯，增加染液的使用寿命和保质期。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发
明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1本发明的实施例1与传统h&e染色比较例对比图像作为对比例对人肛周样本进行染色后的200x视野的显微图像，其中图(1a)为实施例1的显微图像，图(1b)为比较例的显微图像；
30.图2本发明的实施例1与传统h&e染色比较例对比图像作为对比例对人子宫样本进行染色后的400x视野的显微图像，其中图(2a)为实施例1的显微图像，图(2b)为比较例的显微图像；
31.图3本发明的实施例1与传统h&e染色比较例对比图像作为对比例对人肝样本进行染色后的400x视野的显微图像，其中图(3a)为实施例1的显微图像，图(3b)为比较例的显微图像；
32.图4本发明的实施例1与传统h&e染色比较例对比图像作为对比例对人肾样本进行染色后的400x视野的显微图像，其中图(4a)为实施例1的显微图像，图(4b)为比较例的显微图像；
33.图5本发明的实施例1与传统h&e染色比较例对比图像作为对比例对人肠样本进行染色后的400x视野的显微图像，其中图(5a)为实施例1的显微图像，图(5b)为比较例的显微图像；
34.图6本发明的实施例1与传统h&e染色比较例对比图像作为对比例对人乳腺样本进行染色后的100x视野的显微图像，其中图(6a)为实施例1的显微图像，图(6b)为比较例的显微图像.
具体实施方式
35.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例1：
37.1.实验对象：病理组织(肛周、子宫、肝、肾、肠和乳腺)，病理组织均取自人体离体病变组织。
38.2.染色试剂：病理组织切片染色试剂盒/常规h&e染色试剂。
39.3.实验过程：
40.(1)按照如下配比称取切片脱蜡液、转换液、清洗液、分化液、返蓝液、苏木精染色液、伊红染色液所需原料；
41.切片脱蜡液的质量体积份数的组分为：溶剂油d60 80份、正十二烷20份；
42.转换液的质量体积份数组分为：二丙二醇甲醚50份和丙二醇甲醚醋酸酯50份；
43.清洗液的质量体积份数的组分为：去离子水70份、表面活性剂0.01
‑
0.02份和乙二醇30份，其中表面活性剂为triton x
‑
100 20％、tween 20 40％和壬基酚聚氧乙烯醚np
‑
9 40％；
44.分化液的质量体积份数的组分为：去离子水70份、乙二醇30份、冰醋酸0.3
‑
0.5份
和乙酸钠0.05份，其中分化液的ph值为3.1；
45.返蓝液的质量体积份数的组分为：去离子水70份、乙二醇30份、三羟甲基氨基甲烷1.21份和0.1mol/l盐酸2.8份，其中返蓝液的ph值为8.5；
46.苏木精染色液的质量体积份数的组分为：去离子水75份、乙二醇25份、苏木素0.6份、碘酸钠0.06份、硫酸铝2.67份、二丁基羟基甲苯0.2份、环糊精0.1份和冰醋酸4份，其中苏木素染色液的ph值为2.2；
47.伊红染色液的质量体积份数的组分为：去离子水50份、乙二醇50份、水溶性伊红0.1份、冰醋酸0.9份和乙酸钠0.3份，其中伊红染色液的ph值为4.5；
48.封片剂为柠檬油精封片剂。
49.(2)采用病理组织切片染色试剂盒/常规h&e染色试剂分别对选取的各种组织进行病理组织切片制备，制备方法如下：
50.a、病理标本常规方法取材、固定、脱水、透明、浸蜡，包埋成组织蜡块；
51.b、切片：将蜡块修正后，切成4μm厚度的组织切片，捞至载玻片上，置于烘箱中60℃下烤片60min。
52.c、按表一所示步骤进行h&e染色方法对比。
53.表一本发明和传统h&e染色方法
54.[0055][0056]
d、封片：常规h&e组用中性树胶封片，实验组用试剂盒内配制封片剂封片。
[0057]
e、将两种苏木精染色液分别500ml装于1l试剂瓶内，开口试剂与空气直接接触，每隔一天观察表面氧化膜形成情况。
[0058]
4.实验结果
[0059]
(1)本发明在更短是时间内获得与常规h&e染色方法相一致的切片染色结果，切片脱蜡、透明效果良好，染色均匀，红蓝对比清洗；(2)对照组市售苏木精染液在暴露空气一天后，试剂表面就有一层明显的氧化膜形成，实验组在暴露5天后才有少许氧化膜形成；(3)分化液和返蓝液采用缓冲体系设计，作用更温和，染色更为均匀；(4)相比对照组，实验组染色过程中近乎无气味产生，使操作者免受酒精、二甲苯的危害。
[0060]
为体现本发明的实际效果，图1
‑
图6是使用本发明的实施例1与传统h&e染色比较
例对比图像，其中a为实施例，b为比较例，组织来源分别为人肛周、(图1)、人子宫(图2)、人肝(图3)、人肾(图4)、人肠(图5)和人乳腺(图6)。经5位病理专家审核判定，实施例获得与比较例一致的镜检结果，细胞核结构清晰，胶原纤维、肌纤维、细胞质、红细胞等分化清晰，长时间保存染色无明显褪色、出血现象，满足临床病理检查的需求。
[0061]
本发明的优点是：本发明提供了一种成分简单、效果良好、毒性低、新型的病理组织切片染色试剂盒及制备方法，主要用于病理组织h&e染色。本发明的特征在于1、减少二甲苯、酒精等传统染色试剂对操作者的危害；2、减少对环境的污染；3、染色过程不需要额外去离子水引入；4、分化液和返蓝液采用缓冲体系设计，作用更温和，h&e染色的着色效果更清晰、鲜明；5、与传统苏木素配方相比，本试剂盒引入β
‑
环糊精以络合碘酸钠还原后产物碘，增加了染液的染色能力，同时引入还原剂二丁羟基甲苯，增加染液的使用寿命和保质期。
[0062]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。